Pankreasgewebe-abgeleitete extrazelluläre Matrix Bioink für den Druck 3D-Zell-Laden Pankreasgewebe Konstrukte

pdECM bioink kann eine vorteilhafte Mikroumgebung für Pankreasinseln mit gewebespezifischen Komponenten und Architektur bieten und hat optimale neurologische Eigenschaften, die zellabdeaths reduzieren und ihre Bedruckbarkeit erhöhen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die gewebespezifische Zusammensetzung innerhalb des pdECM-Bioinks erhalten werden kann, der einen konstruktiven Überlauf zwischen 3D-Pankreasgewebekonstrukten und verkapselten Inselchen fördert. Die Entwicklung der Isletverkapselung in pdECM-Bioink kann auf die Herstellung von transplantierbaren Pankreasgewebekonstrukten zur Behandlung von Typ-1-Diabetes angewendet werden.

Dieser Bioink kann verwendet werden, um die Anwendung von transplantierbaren Konstrukten sowie In-vitro-Gewebemodellen für Diabetes, Diabetes-bedingte Komplikationen und Bauchspeicheldrüsenkrebs zu erweitern. Für die Dezellularisierung einer gefrorenen Pankreas-Gewebeprobe mit einem gefrorenen Schweinebauch verwenden, um die gefrorene Bauchspeicheldrüse in einen Millimeter dicke Stücke zu schneiden und 50 Gramm des in Scheiben geschnittenen Gewebes in einen 500-Milliliter-Kunststoffbehälter zu übertragen. Waschen Sie das Gewebe mit 300 Millilitern destilliertem Wasser bei vier Grad Celsius auf einem digitalen Orbital-Shaker mit 150 Umdrehungen pro Minute für etwa 12 Stunden.

Wenn das trübe Wasser verschwindet, ersetzen Sie das Wasser 84 Stunden lang durch 400 Milliliter 1%Triton-X 100 in PBS. Am Ende der Waschmittelbehandlung das Gewebe mit 400 MilliliterIsopropanol für zwei Stunden inkubieren, um das restliche Fett aus der Bauchspeicheldrüse zu entfernen, gefolgt von einer 24-Stunden-Wäsche in 400 Milliliter PBS. Am Ende der Wäsche, sterilisieren Sie das dezellularisierte Gewebe mit 400 Milliliter 0,1%Peressigsäure in 4%Ethanol für zwei Stunden, bevor Sie die Probe mit 400 Milliliter frisches PBS für sechs Stunden waschen, um restliche Waschmittel zu entfernen.

Am Ende der Wäsche, verwenden Sie Zange, um die Gewebeteile in ein 50 Milliliter konisches Rohr zu übertragen und die Probe bei minus 80 Grad Celsius für eine Stunde wieder einzufrieren. Dann bedecken Sie das konische Rohr mit einem fusselfreien Wisch, der mit einem Gummiband fixiert ist, und lyophilisieren Sie das dezellularisierte Gewebe vier Tage lang bei minus 50 Grad Celsius. Um den Bioink vorzubereiten, übertragen Sie 200 Milligramm gefriergetrocknetes pdECM in eine neue 50 Milliliter konische Röhre und fügen Sie 20 Milligramm Pepsin und 8,4 Milliliter 0,5 Molessigsäure in die Gewebeprobe.

Dann legen Sie einen magnetischen Rührstab in die Röhre für eine 96-stündige Rühreninkubation bei 300 Umdrehungen pro Minute. Verwenden Sie am Ende der Inkubation ein 40-Mikrometer-Zellsieb und eine positive Verdrängungspipette, um die Lösung in ein neues Rohr auf Eis zu filtern, um unverdaute Partikel herauszufiltern und dem Rohr einen Milliliter 10X PBS hinzuzufügen. Verwenden Sie nach dem Wirbeln Natriumhydroxid, um den pH-Wert der Lösung auf sieben einzustellen.

Um den Bioink für den 3D-Zelldruck eines Pankreaskonstrukts mit einer gemusterten Struktur vorzubereiten, färben Sie ein Aliquot von pdECM-Bioink mit 0,4%Trypan Blue und ein Aliquot mit Rose Bengal Solution im Verhältnis eins bis 20. Dann verwenden Sie eine positive VerschiebungPipetten, um jede Bioink-Lösung mit einer mittelschwebenden Islet-Lösung im Verhältnis von drei zu eins zu einer endgültigen Konzentration von 1,5 % und einer Zelldichte von dreimal 10 zu den drei Islet-Äquivalenten pro Milliliter vorsichtig zu mischen. Für den 3D-Zelldruck von multimaterialbasierten Pankreasgewebekonstrukten laden Sie jedes Bioink-Islet-Gemisch in einzelne sterilisierte Spritzen, die mit 25-Spur-Düsen ausgestattet sind, und drucken Sie jeden Bioink unter optimierten Druckbedingungen bei 18 Grad Celsius in Form eines Gitters mit abwechselnden Linien von Blau und Rot.

Um den Bioink miteinander zu vernetzen, legen Sie das gedruckte Konstrukt 30 Minuten lang in einen 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Zellkultur-Inkubator. Dann tauchen Sie das gedruckte Konstrukt in RPMI 1640 Medium ergänzt mit 10%fetalen Rinderserum und 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin und Streptomycin. Nach dem Dezellularisierungsprozess werden 97,3% der doppelsträngigen DNA entfernt und die repräsentativen extrazellulären Matrixkomponenten wie Kollagen und Glycosaminoglykanen bleiben bei 1278,1% bzw. 96,9% im Vergleich zu dem des nativen Bauchspeicheldrüsengewebes.

In dieser repräsentativen Analyse zeigte der pdECM-Bioink ein Scherverdünnungsverhalten mit einem Wert von etwa 10 Pascal pro Sekunde bei einer Scherrate von einem pro Sekunde, was darauf hindeutet, dass der Bioink die geeigneten rheologischen Eigenschaften für die Extrusion durch eine Düse aufweist. Darüber hinaus begann der komplexe Modul des Bioinks zu steigen, als die Temperatur 15 Grad Celsius erreichte und schnell anstieg, wenn die Temperatur bei 37 Grad Celsius gehalten wurde, was auf den Sol-Gel-Übergang der Lösung hindeutet. Die dynamische G-Prim- und G-Doppelprime des pdECM-Bioinks wurden bei physiologisch relevanten Temperaturen untersucht, um ihre Stabilität nach dem Druckprozess zu gewährleisten, was zu einem stabilen Modul unter der Frequenz-Sweep-Bedingung führte.

Mit Hilfe eines Multihead-Drucksystems konnten dann verschiedene Arten von 3D-Konstrukten hergestellt werden, wie mit dem entwickelten pdECM demonstriert wurde, das die Vielseitigkeit von pdECM zum Zwecke des 3D-Bioprintings demonstriert, um zwei oder mehr Arten von lebenden Geweben in einer gewebeähnlichen Anordnung zu harmonisieren. Seien Sie sanft beim Mischen des Bioinks mit den Zellen, um Zelltod und Blasenbildung zu vermeiden, da das Vorhandensein von Blasen die Druckauflösung senkt und die Zelllebensfähigkeit verringert. Die Funktionalität der gekapselten Pankreasinseln innerhalb der 3D-Pankreasgewebekonstrukte kann durch Immunfluoreszenzfärbung oder einen Glukosetoleranztest beurteilt werden.

Diese pdECM-Bioink- und 3D-Bioprinting-Technik kann potenziell für die Entwicklung funktioneller Pankreasgewebekonstrukte im Bereich der Gewebetechnik eingesetzt werden. Die Forscher sollten die geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen, um Verletzungen beim Umgang mit der scharfen Reibe und den Reagenzien zu verhindern.