Name: Messung des mitochondrialen Masse- und Membranpotenzials in hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen durch Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Lernen Sie die Durchflusszytometrie zur Messung von mitochondrialer Masse und Membranpotential in hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Analyse seltener Zellpopulationen und die Bewertung metabolischer Fitness.

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Wir danken der UNIL Flow Cytometry Core Facility für ihre Unterstützung, insbesondere Dr. Romain Bedel. Diese Arbeit wurde durch das Stipendium der Kristian Gerhard Jebsen Stiftung an N.V. und O.N. unterstützt.

Alle im Manuskript beschriebenen Experimente folgen den Richtlinien unserer Institution und wurden nach schweizerischem Tierversuchsrecht (Zulassung: VD3194) und für die Forschung an menschlichen Proben durchgeführt (Protokoll: 235/14; CER-VD 2017-00490)
1. Hämatopoetische Stammzellextraktion
<ol><li>Kaufen Sie wilde Mäuse des Typs C57BL6/J und halten Sie sie mindestens eine Woche im Tierheim, um transportassoziierten Stress zu reduzieren.</li>
	<li>Am Tag des Experiments, euthanisieren Sie die Maus mit CO 2-Erstickung.</li>
	<li>Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol, um das Fell zu sterilisieren und schneiden Sie die Maus am Bauch mit Standard-Chirurgischen Werkzeugen, wie Sezierschere und Zange, um den Oberschenkelknochen und Tibiaknochen von den Hinterbeinen zu schneiden.</li>
	<li>Entfernen Sie die Muskeln, die an Oberschenkelknochen, Tibia und Becken befestigt sind, mit einem weichen Papiertuch und legen Sie die gereinigten Knochen in ein 50 ml-Rohr mit PBS mit 1 mM EDTA (Puffer) auf Eis.</li>
	<li>Einen Mörtel und Einen Stößel mit 70% Ethanol besprühen und in eine Zellkulturhaube geben. Sterilisieren Sie es mit UV für 30 min. Nach der Sterilisation spülen Sie den Mörtel und Stößel mit Puffer, um Spuren von Ethanol zu entfernen.</li>
	<li>Legen Sie die sauberen Knochen mit etwas Puffer (ca. 10 ml) in den Mörtel und zerkleinern Sie sie vorsichtig, um das Knochenmark in Suspension heraus zu bekommen. Sammeln Sie nun die Zellsuspension und leiten Sie sie durch ein 70-m-Zellsieb in ein 50 ml-Rohr, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 1.6, bis das gesamte Knochenmark extrahiert wurde und der Knochenrest weiß geworden ist.</li>
	<li>Legen Sie die 50 ml Tube(n) mit der Einzelzellsuspension des Knochenmarks auf eine Zentrifuge. Führen Sie die Zentrifuge bei 300 x g 10 min bei 4 °C, um die Zellen zu pellet.</li>
	<li>In der Zwischenzeit 10 ml 1x RBC-Lysepuffer in autoklaviertem destilliertem Wasser vorbereiten. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22-mm-Filter.</li>
	<li>Sammeln Sie das Probenrohr aus der Zentrifuge und dekantieren Sie den Überstand. Pipette den 1x RBC Lyse Puffer (Tabelle der Materialien) auf dem Zellpellet. Das Pellet austreiben und eine homogene Lösung vorbereiten, indem man ein paar Mal auf und ab pfeift. Lassen Sie das Rohr bei Raumtemperatur für 1-2 min für die RBC-Lyse auftreten. Stoppen Sie den Lyseprozess, indem Sie das Rohr mit dem Puffer füllen.</li>
	<li>Das Rohr auf eine Zentrifuge legen und bei 300 x g bei 4 °C 5 min drehen. Sammeln Sie das Rohr von der Zentrifuge und dekantieren Sie den Überstand. Setzen Sie das Pellet wieder auf, indem Sie 10 ml Puffer hinzufügen und filtern Sie die Lösung über ein 70-ml-Zellsieb in ein neues 50 ml-Rohr, um die Trümmer aufgrund der RBC-Lyse zu entfernen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Rohr bei 300 x g für 5 min bei 4 °C. Sammeln Sie das Rohr von der Zentrifuge und dekantieren Sie den Überstand. Setzen Sie das Pellet in 500 l Puffer aus.</li>
	<li>Entfernen Sie ein 100 L Aliquot und halten Sie es in einem separaten 1,5 ml-Rohr auf. Fügen Sie den verbleibenden 450 l Biotin-L-Antikörper-Antikörpercocktail aus dem Vorläuferanreicherungskit(Tabelle der Materialien) zu den restlichen 450 l Zellsuspension hinzu. Bei 4 °C auf einem Shaker 15 min inkubieren.</li>
	<li>15 ml Puffer hinzufügen und das Rohr bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrieren. Sammeln Sie das Rohr von der Zentrifuge und dekantieren Sie den Überstand. Setzen Sie das Pellet in 460 L Puffer aus. Entfernen Sie ein 10 L Aliquot und halten Sie es in einem separaten 1,5 ml-Rohr auf.</li>
	<li>Fügen Sie der verbleibenden 450-L-Zellsuspension 50 L Streptavidin-Magnetperlen aus dem Vorläuferanreicherungskit(Materialtabelle)hinzu. Bei 4 °C auf einem Shaker 15 min inkubieren.</li>
	<li>15 ml Puffer hinzufügen und das Rohr bei 300 x g für 5 min bei 4 °C zentrieren. Sammeln Sie das Rohr von der Zentrifuge und dekantieren Sie den Überstand. Das Pellet in 5 ml Puffer wieder aufhängen und die Lösung in ein 15 ml Rohr übertragen.</li>
	<li>Nehmen Sie das Rohr zu einem automatisierten Zellabscheider (Tabelle der Materialien). Führen Sie ein Waschprogramm aus, um die Schläuche des Zellabscheiders zu spülen und zu grundieren. Legen Sie die Probe und zwei Sammelrohre auf den Rohrhalter. Führen Sie die Trennung mit dem Programm "Deplete" durch. Sammeln Sie die positiven und die negativen Brüche aus dem automatisierten Zelltrennzeichen, sobald der Lauf beendet ist. HINWEIS: In Ermangelung eines automatischen Zellabscheiders können die Benutzer manuelle Magnetsäulen und entsprechende Magnete gemäß der Bedienungsanleitung verwenden. Die Benutzer sollten bedenken, dass der Prozess der manuellen Trennung langsamer ist als der automatisierte. Außerdem sind die manuellen Spalten anfälliger für Verstopfungen. Daher wird Benutzern empfohlen, die Probe zu verdünnen und die Spalte langsam zu belasten.</li>
	<li>Entsorgen Sie den positiven Bruch. Füllen Sie das negative Bruchrohr mit Puffer. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 300 x g für 5 min bei 4 °C.</li>
	<li>In der Zwischenzeit bereiten Sie den Antikörpermix in 1 ml Endvolumenlösung und die einfarbigen Steuerungen in 200 l Endvolumenlösung vor, wie in Tabelle der Materialien und Tabelle 1beschrieben. HINWEIS: Wenn das TMRM und der grüne fluoreszierende mitochondriale Fleck mit Stammzellmarkerfärbung kombiniert werden sollen, dann ersetzen Sie CD150-PE durch CD150-PEcy5 und Streptavidin-Tx rot durch Streptavidin-Pac Orange.</li>
	<li>Sammeln Sie das Probenrohr aus der Zentrifuge und dekantieren Sie den Überstand. Das Pellet in 1 ml Antikörpermischung wieder aufhängen. Fügen Sie in jedem der einfarbigen Steuerröhrchen (außer Linie) 10 L Zellen (ab Schritt 1.13) hinzu. Fügen Sie 10 L Zellen (ab Schritt 1.14) in die Einfarbigröhre der Abstammung ein.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Proben- und einfarbigen Steuerrohre bei 4 °C auf einem Shaker für 45 min. Bedecken Sie den Eiskübel mit einem Deckel oder einer Aluminiumfolie.</li>
	<li>Füllen Sie alle Rohre mit Puffer und Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei 4 °C. Verwerfen Sie den Überstand und setzen Sie die Probe in 1 ml Puffer- und einfarbigen Steuerelementen in 200 L Puffer wieder aus.</li>
	<li>Übertragen Sie die Probe und die einfarbigen Steuerungen auf 5 ml Filteroben-FACS-Rohre.</li>
	<li>Nehmen Sie die Rohre zur Sortiermaschine und sortieren Sie die HSC-Population (Gating-Strategie in Abbildung 1A) in 1,5 ml-Rohren, die 400 l Stammzellausdehnungsmedium enthalten.</li>
</ol>2. Ex-Vivo-Kultur hämatopoetischer Stammzellen
<ol><li>Sammeln Sie Rohre mit sortierten Zellen (siehe Abschnitt 1 für die Zellextraktion). Zentrifugieren Sie die Rohre bei 300 x g für 5 min bei 4 °C. Entfernen Sie vorsichtig den größten Teil des Überstandes, ohne das Pellet zu lösen, und lassen Sie 50–80 l auf dem Zellpellet. Dadurch wird der Zellverlust minimiert.</li>
	<li>Das Zellpellet im Stammzellexpansionsmedium abhängig von der Anzahl der zu testenden Bedingungen auf ein endgültiges Volumen aussetzen (Anzahl 100 l pro Brunnen/Kulturzustand).</li>
	<li>Vorbereitung eines 2x Kulturmediums mit Stammzellexpansionsmedium, Stammzellfaktor (200 ng/ml), FLT3-Ligand (4 ng/ml) und Pen-Strep-Antibiotika (1%) (2x Basalmedium; Materialtabelle).</li>
	<li>Nehmen Sie eine sterile Gewebekultur behandelt 96 U-Boden-Brunnenplatte (Tabelle der Materialien) und identifizieren Sie die Brunnen, in denen die Zellen kultiviert werden (Plattendesign in Abbildung 1B). HINWEIS: Benutzern wird empfohlen, marginale Brunnen zu vermeiden, da sie anfälliger für Verdunstung sind.</li>
	<li>Legen Sie 100 l 2x Basalmedium, das zuvor in Schritt 2.3 hergestellt wurde, in diese Brunnen. In der markierten NR gut 2 l einer 100x NR-Lösung (Materialtabelle )hinzufügen. Nr alle 24 h auffüllen. HINWEIS: Die Auffüllung ist spezifisch für NR. Andere Stoffwechselmodulatoren können nachgefüllt werden oder auch nicht.</li>
	<li>Samen 100 l Zellen, die in Schritt 2.2 auf den Brunnen mit 2x Basalmedium hergestellt werden. In diesem Experiment lagen die HSCs pro Bohrkörper zwischen 800 und 1.000 Zellen.</li>
	<li>Bereiten Sie fünf zusätzliche Brunnen mit 2x Basalmedium vor. In jeder dieser addieren 100.000 ganze Knochenmarkzellen (ab Schritt 1.13) resuspendiert in 100 l Stammzellausdehnungsmedium als Färbung Spirierungssteuerungen für die Postkultur-Flow-Zytometrie-Analyse verwendet werden. HINWEIS: Wenn Benutzer Stammzellmarker und mitochondriale Marker für die Postkulturanalyse kombinieren möchten, wird empfohlen, zusätzlich die Vorläuferpopulation zu sortieren (entweder Ckit+-Zellen oder LKSCD150-Zellen). Samen diese sortierten Vorläufer in den Färbekontrollbrunnen für die Postkultur-Flow-Zytometrie-Analyse. Bereiten Sie einen Brunnen pro einzelnen Fleckenfarbe vor.</li>
	<li>Legen Sie 200 l autoklaviertes Wasser in alle umliegenden Brunnen, um die Verdunstung aus Brunnen, die Zellen enthalten, zu reduzieren. Lassen Sie die Platte ungestört in einem Inkubator bei 37 °C und 5%CO2 für die Dauer des Kulturzeitraums (72 h). Entfernen Sie die Platte, um NR alle 24 h aufzufüllen und legen Sie sie wieder in den Inkubator.</li>
</ol>3. Messung des mitochondrialen Masse- und Membranpotentials
<ol><li>Am Ende der Kulturperiode bereiten Sie eine 100-fache Lösung von TMRM (20 m) und Mitotracker grün (10 m) (grüner fluoreszierender Fleck) im Stammzellausdehnungsmedium(Materialtabelle)vor.</li>
	<li>Fügen Sie in jeder der Testbrunnen 2 l 100x TMRM-Lösung und 2 l 100x grüne fluoreszierende Fleckenlösung hinzu. Fügen Sie 2 l von 100x TMRM in die TMRM-Steuerung ein. Fügen Sie 2 l von 100x grünen fluoreszierenden Fleck in der Mitotracker-Steuerung gut hinzu. Legen Sie die Platte für 45 min wieder in einen Inkubator bei 37 °C und 5% CO2. Bedecken Sie die Plattenoberseite mit Aluminiumfolie. HINWEIS: Eine zusätzliche Steuerung mit Verapamil (ABC-Pumpenhemmer) kann vorbereitet werden, wenn ABC-Pumpe vermittelten Farbstoff Efflux getestet werden muss. Dazu fügen Sie 50 M Verapamil in eine der Testbrunnen 1 h vor der Färbung für TMRM und grüne fluoreszierende Flecken.</li>
	<li>Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und zentrifugieren Sie sie bei 300 x g für 5 min. Umkehren Sie die Platte, um den Überstand zu entfernen. Fügen Sie 200 l Standard-FACS-Puffer (PBS-1 mM EDTA-P/S-2% FBS) hinzu, zentrifugieren Sie die Platte bei 300 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 3x. Der Anwender muss sicherstellen, dass die Platte immer mit Folie bedeckt ist, um eine minimale Lichteinwirkung zu gewährleisten. HINWEIS: Wenn Benutzer die mitochondriale Färbung mit Stammzellfärbung kombinieren müssen, muss die Probe mit einem Antikörpermix aus allen Stammzellmarkern inkubiert werden, und die einfarbigen Kontrollen müssen mit einzelnen Antikörpern separat bei 4 °C für 30–45 min gefärbt werden. HINWEIS: Bei allen Schritten müssen die Benutzer die Platte mit Aluminiumfolie bedeckt halten. Benutzer müssen beachten, dass dieser zusätzliche Färbeschritt und nachfolgende Waschschritte zu einem zusätzlichen Zellverlust führen können.</li>
	<li>Setzen Sie die Zellen in 200 L FACS-Puffer aus und übertragen Sie sie in FACS-Rohre.</li>
	<li>Führen Sie die Proben auf dem Durchflusszytometer aus (siehe Abbildung 1). Einfarbige Röhren, die WBM enthalten, sind: (1) Unstained; (2) DAPI; (3) TMRM (PE); (4) grüner fluoreszierender Fleck (FITC); (5) Voller Fleck (PE und FITC).</li>
	<li>Erwerben Sie zunächst die einfarbigen Steuerelemente, um die Maschine einzurichten. Verwenden Sie die laufende Software auf dem Computer, um die Kompensation zu berechnen. Sobald die Kompensation angewendet wurde, erwerben Sie die HSC-Probe und zeichnen Sie so viele Ereignisse wie möglich auf. HINWEIS: Wenn die Stammzell- und mitochondrialen Marker kombiniert werden, müssen die Anwender besonders vorsichtig sein mit der Kompensation zwischen TMRM (PE), CD150 (PE-Cy5) und Sca-1 (APC). Außerdem sollten die Proben sofort nach der Färbung ausgeführt werden.</li>
	<li>Exportieren Sie die FACS-Dateien aus dem Zytometer und analysieren Sie die Daten auf einer Analysesoftware (Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Öffnen Sie für die Analyse die Datei auf der Analysesoftware. Identifizieren Sie mit FSC-A und SSC-A gating die Zellpopulation. Identifizieren Sie Singlets in den nächsten Gates, bevor Sie den negativen DAPI-Anteil (live cells) plotten. Im Live-Zell-Tor erstellen Sie ein Konturdiagramm im TMRM- und grünen fluoreszierenden Fleckenkanal, um die Größe bzw. masse zu messen (Abbildung 2A). Exportieren Sie die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) dieser beiden Kanäle im Live-Zell-Gate.</li>
		<li>Das TMRM Low Gate wird basierend auf der Schulterpopulation im TMRM-Kanal eingestellt. Die TMRM Einfarbigsteuerung kann verwendet werden, um diese Schulterpopulation zu identifizieren, um das Tor einzustellen. Exportieren Sie den Anteil der Lebenden Zellen im TMRM Low Gate in Ihrer Steuerung und testen Sie Proben zum Plotten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Busch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+properties+of+unperturbed+haematopoiesis+from+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo.</a> Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).</li>
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<li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+act+through+p38+MAPK+to+limit+the+lifespan+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells.</a> Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).</li>
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<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405(2019).</li>
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<li>van der Waart, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Akt+signaling+promotes+the+generation+of+superior+tumor-reactive+T+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).</li>
<li>Crompton, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+inhibition+enhances+expansion+of+potent+tumor-specific+lymphocytes+with+memory+cell+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics.</a> Cancer Research. 75 (2), 296-305 (2015).</li>
<li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li>
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</ol>

Einige Elemente dieser Arbeit wurden als Anmeldung P1828EP00 beim Europäischen Patentamt eingereicht.

Eine strenge Regulierung der HSC-Funktion ist wichtig, um eine stabile Hämatopoese während der Lebensdauer eines Organismus aufrechtzuerhalten. Wie verschiedene andere Zelltypen im Körper ist ein Schlüsselbestandteil, der zur Regulierung der HSC-Funktion beiträgt, der Zellstoffwechsel. Frühere Studien aus unserem Labor9 und anderen2,3 haben die Bedeutung von Mitochondrien für die Aufrechterhaltung eines ausgeprägten Stoffwechselzustandes i...

Hämatopoetische Stammzellen (HSCs) sind eine kleine Population von Zellen, die im Knochenmark leben und die Blutproduktion und Homöostase während der gesamten Lebensdauer eines Organismus gewährleisten. HSCs vermitteln diesen Prozess, indem sie Vorläufer hervorrufen, die wiederum endlos differenzierte reife Blutzelllinien über mehrere Zellteilungsrunden und gut orchestrierte Differenzierungsschritte1erzeugen. Wichtig ist, dass HSCs ihre Energie über anaerobe Glykolykose erzeugen. Im Gegensatz dazu schalten engagiertere und aktive hämatopoetische Vorläufer ihren Stoffwechsel in Richtung mitochondrialer Stoffwechsel2,3,4. Dieser ausgeprägte Stoffwechselzustand wird geglaubt, um die HSCs vor zellulären Schäden durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) durch aktive Mitochondrien verursacht zu schützen, wodurch ihre langfristige in vivo Funktion5,6,7,8. Die direkte Messung des HSC-Stoffwechselzustands ist eine Herausforderung und aufgrund ihrer begrenzten Anzahl oft geringer Durchsatz. Hier beschreiben wir einen strömungszytometriebasierten Assay zur robusten Messung des mitochondrialen Membranpotentials (M) mit Tetramethylrhodinmethylester (TMRM) Fluoreszenz und mitochondrialer Masse unter Verwendung eines grünen fluoreszierenden mitochondrialen Flecks (Mitotracker Green) in HSCs. Wir haben bereits gezeigt, dass low 'm ein bona-fide funktioneller Marker von hochgereinigten HSCs9 und metabolischen Modulatoren ist, die in der Lage sind, die HSCs-Funktion9,10zu verbessern. Hier schlagen wir die Verwendung unserer Methode auf HSCs mitochondriale Profilierung als Strategie zur Identifizierung neuartiger Moleküle vor, die in der Lage sind, das langfristige Rekonstitutionspotenzial der HSCs zu verbessern.
Als Beispiel zeigen wir, dass dieser Assay zuverlässig die Senkung von HSC-M bei Exposition gegenüber Vitamin B3-analogem Nicotinamid-Ribosid (NR) misst. Dementsprechend zeigen wir in unserer kürzlich veröffentlichten Studie, dass NR die Blutrückgewinnung nach der Transplantation sowohl in Maus- als auch in humanisierten Maussystemen stark verbessert, indem es die hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferfunktionen direkt verbessert10. Die Kapazität solcher metabolischen Modulatoren ist von großem klinischen Wert, wenn man bedenkt, dass eine 25% Sterberate mit Verzögerungen bei der Blut- und Immunregeneration bei posttransplantierten Patienten verbunden ist11,12.
Darüber hinaus liefern wir Beweise dafür, dass diese Methode für die Charakterisierung des metabolischen Profils und der Funktion menschlicher T-Zellen angewendet werden kann. In den letzten Jahren ist die Entwicklung der Adoptivzelltherapie (ACT) mit autologen Tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TILs) zum effektivsten Ansatz für bestimmte Arten von fortgeschrittenem Krebs mit extrem ungünstiger Prognose (z. B. metastasierendes Melanom, bei dem >50% der Patienten auf eine Behandlung ansprechen und bis zu 24% der Patienten eine vollständige Regression haben)geworden. TiLs, die eine ausreichende Antitumoraktivität haben, sind jedoch schwierig,14zu erzeugen. Die umfangreiche Proliferation und Stimulation, die TILs während der Ex-vivo-Expansion erfahren, verursacht T-Zell-Erschöpfung und Seneszenz, die die T-Zell-Antitumorreaktion dramatisch beeinträchtigen15. Wichtig ist, dass die antitumorale Kapazität der TILs eng mit ihrem Stoffwechsel16,17 verbunden ist und Ansätze, die darauf abzielen, den Stoffwechsel durch die Hemmung des PI3K/Akt-Signalwegs zu modulieren, ermutigende Ergebnisse hervorgebracht haben18,19. Aus diesem Grund vergleichen wir die von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) und patientenabgeleiteten TILs gewonnenen T-Zellen und zeigen, dass weniger differenzierte PBMC-abgeleitete T-Zellen eine niedrigere Und mitochondriale Masse aufweisen als endlos differenzierte TILs.
Wir stellen uns vor, dass dieser Assay verwendet werden kann, um neuartige metabolische Modulatoren zu identifizieren, die die HSC- und T-Zellfunktion durch die Modulation von m verbessern.

<table><tbody><tr><td>5 mL FACS-Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>Probenvorbereitung</td></tr><tr><td>96-U Bodenplatte</td><td>Corning</td><td>3799</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>AutoMACS pro Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td>Automatische Zelltrennung</td></tr><tr><td>BD FACS AriaIII</td><td>Becton und Dickinson</td><td></td><td>Zellsortierung</td></tr><tr><td>BD IMag Maus Hämatopoetische Vorläuferzellanreicherung</td><td>Kit BD</td><td>558451</td><td>Abstammungsdepletion</td></tr><tr><td>BD LSRII</td><td>Becton und Dickinson</td><td></td><td>FACS-Erfassungsmaschine</td></tr><tr><td>BD-DIVA</td><td>Becton und Dickinson</td><td></td><td>Erfassungssoftware</td></tr><tr><td>CD150 PE</td><td>Biolegend</td><td>115904</td><td>Antikörper-Färbemischung</td></tr><tr><td>CD150 PE-Cy5</td><td>Biolegend</td><td>115912</td><td>Antikörper-Färbemischung</td></tr><tr><td>CD48 PB</td><td>Biolegend</td><td>103418</td><td>Antikörper-Färbemischung</td></tr><tr><td>Zentrifuge- 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Centrifugation</td></tr><tr><td>Ckit PeCy7</td><td>Biolegend</td><td>105814</td><td>Antikörper-Färbemischung</td></tr><tr><td>Flow jo</td><td>FlowJo LLC</td><td></td><td>FACS Analysesoftware</td></tr><tr><td>GraphPad-Prism</td><td>GraphPad</td><td></td> Daten <td>in Diagramme</td></tr><tr><td>eintragen Mitotracker Green</td><td>Invitrogen</td><td>M7514</td><td>Grün fluoreszierende mitokondriale Färbung zur Messung der mitochondrialen Masse; Arbeitskonzentration = 100 nM; Stammkonzentration = 1 mM</td></tr><tr><td>Nicotinamid-Ribosid (NR)</td><td>Kundenspezifisch synthetisiert im Haus</td><td></td><td>Metabolischer Modulator; Arbeitskonzentration = 500 & Mikro; M; Stammkonzentration = 50 mM</td></tr><tr><td>PBS</td><td>CHUV</td><td></td> 1000324 <td>Puffervorbereitung; Arbeitskonzentration = 1x; Stammkonzentration = 1x</td></tr><tr><td>Pen-Strep (P/S)</td><td>Lebenstechnologien</td><td>15140122</td><td>Ex-vivo-Kultur; Arbeitskonzentration = 1x; Stammkonzentration = 1x</td></tr><tr><td>RBC-Lysepuffer</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td>Lysing Rote Blutkörperchen; Arbeitskonzentration = 1x; Stammkonzentration = 10x</td></tr><tr><td>Rekombinanter Maus-Flt-3-Ligand (FLT3)</td><td>RnD</td><td>427-FL-005/CF</td><td>Ex-vivo-Kultur; Arbeitskonzentration = 2 ng/ml; Stammkonzentration = 10 & Mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Rekombinanter Maus-Stammzellfaktor (SCF)</td><td>RnD</td><td>455-MC-010/CF</td><td>Ex-vivo-Kultur; Arbeitskonzentration = 100 ng/ml; Stammkonzentration = 50 & Mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Sca1 APC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-5981-82</td><td>Antikörper-Färbemischung</td></tr><tr><td>StemlineII Hämatopoetisches Stammzellexpansionsmedium</td><td>SIGMA</td><td>S0192</td><td>Ex-vivo-Kultur</td></tr><tr><td>Streptavidin Pac orange</td><td>Life Technologies</td><td>S32365</td><td>Antikörper-Färbemischung</td></tr><tr><td>Streptavidin Tx rot</td><td>Life Technologies</td><td>S872</td><td>Antikörper-Färbemischung</td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Invitrogen</td><td>T668</td><td>Färbung des mitochondrialen Membranpotentials; Arbeitskonzentration = 200 nM; Stammkonzentration = 10 mM</td></tr><tr><td>Ultrareines EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>Pufferpräparation; Arbeitskonzentration = 0,5 M; Stammkonzentration = 1 mM</td></tr></tbody></table>

messung des mitochondrialen masse- und membranpotenzials in hämatopoetischen stammzellen und t-zellen durch durchflusszytometrie

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

Ein feines Gleichgewicht aus Ruhe, Selbsterneuerung und Differenzierung ist der Schlüssel, um den hämatopoetischen Stammzellpool (HSC) zu erhalten und die lebenslange Produktion aller reifen Blutkörperchen aufrechtzuerhalten. In den letzten Jahren hat sich der Zellstoffwechsel zu einem entscheidenden Regulator der HSC-Funktion und des Schicksals entwickelt. Wir haben bereits gezeigt, dass die Modulation des mitochondrialen Stoffwechsels das Schicksal des HSC beeinflusst. Insbesondere konnten wir durch die chemische Entkopplung der Elektronentransportkette die HSC-Funktion unter Kulturbedingungen aufrechterhalten, die normalerweise eine schnelle Differenzierung induzieren. Die Begrenzung der HSC-Zahlen schließt jedoch häufig die Verwendung von Standard-Assays aus, um den HSC-Stoffwechsel zu messen und daher ihre Funktion vorherzusagen. Hier berichten wir über einen einfachen Durchflusszytometrie-Assay, der eine zuverlässige Messung des mitochondrialen Membranpotenzials und der mitochondrialen Masse in knappen Zellen wie HSCs ermöglicht. Wir diskutieren die Isolierung von HSCs aus dem Knochenmark der Maus und die Messung von mitochondrialen Masse- und Membranpotenzialen nach ex vivo Kultur. Als Beispiel zeigen wir die Modulation dieser Parameter in HSCs über die Behandlung mit einem Metabolenmodulator. Darüber hinaus erweitern wir die Anwendung dieser Methode auf menschliche periphere, blutabgeleitete T-Zellen und menschliche Tumor-infiltrierende Lymphozyten (TILs), die dramatische Unterschiede in ihren mitochondrialen Profilen aufweisen, die möglicherweise verschiedene T-Zellen widerspiegeln. Funktionalität. Wir glauben, dass dieser Assay in Screenings eingesetzt werden kann, um Modulatoren des mitochondrialen Stoffwechsels in verschiedenen Zelltypen in verschiedenen Kontexten zu identifizieren.

In Abbildung 1 zeigen wir die Gating-Strategie zur Isolierung hämatopoetischer Stammzellen aus dem Mausknochenmark und das Layout der Platte für ihre Ex-vivo-Kultur. Abbildung 1A zeigt die Identifizierung des Lymphozytenanteils im SSC-A/FSC-A-Diagramm. Doublets wurden im Singlet-Gate entfernt, gefolgt von der Identifizierung von lebenden Zellen durch das Fehlen eines DAPI-Signals. Die LKS-Population, definiert durch Abstammung - Sca1+...

Hier beschreiben wir eine zuverlässige Methode zur Messung des mitochondrialen Massen- und Membranpotenzials in ex vivo kultivierten hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen.

Messung des mitochondrialen Masse- und Membranpotenzials in hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen durch Durchflusszytometrie

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Dieses Protokoll ist ein einfacher, auf Flusszytometrie basierender Assay, der die Messung des mitochondrialen Membranpotentials und der mitochondrialen Masse in lebenden Zellen ermöglicht. Standard-Metabolische Assays scheitern bei der Arbeit mit seltenen Populationen wie den hämatopoetischen Stammzellen. Diese Methode ermöglicht es Benutzern, mitochondriale Membranprofilierung bei der Arbeit mit einer geringen Anzahl von Zellen und neue metabolische Modulatoren von Zellen wie den HSCs zu bestimmen.Darüber hinaus können Sie es mit nachgelagerten funktionellen Assays wie Knochenmarktransplantation oder koloniebildenden Assays kombinieren, um die Funktionalität Ihrer Zellen nach der Kultur zu bestimmen. Unsere Technik kann zur Identifizierung neuartiger Moleküle genutzt werden, die in der Lage sind, die HSC-Funktion im Zusammenhang mit Knochenmarktransplantationen und hämatopoetischer Immunrückgewinnung nach ablativen Therapien zu verbessern. Wie in unserem Protokoll beschrieben, kann unsere Methode verwendet werden, um die metabolische Fitness von Immun-T-Zellen zu bewerten.Es ist sehr wichtig, dass die Zellen nach der Färbung nur minimal lichtdurchäuert werden. Darüber hinaus muss der Einsatz von Pumpeninhibitor verapamil einbezogen werden, um den Beitrag des Pumpenausflusses zu bewerten. Jedoch, Benutzer müssen sich bewusst sein, dass Verapamil zutiefst stört ionisches Gleichgewicht und kann nicht verwendet werden, um die Wirkung eines metabolischen Modulators auf mitochondriale MembranPotenzial zu bewerten.Visuelle Demonstration dieser Methode ist extrem wichtig, weil es einige kritische Schritte gibt, die man bei der Arbeit mit einer geringen Anzahl von Zellen beachten muss, und diese Schritte fehlen sehr oft in den regulären Papieren, die Benutzer auf PubMed lesen. Für die FAC-Sortierung wird die LKS-Population, definiert durch Abstammung negativ, Sca1-positiv, cKit-positiv identifiziert. Hämatopoetische Stammzellen aus etwa fünf bis zehn % der Zellen in der LKS-Population werden durch Gating für CD150-positive CD48-negative Population identifiziert, die als HSCs bezeichnet wird.Nach der hämatopoetischen Stammzellsortierung zentrieren Sie die Rohre bei 300 mal g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie vorsichtig den größten Teil des Überstandes, ohne das Pellet zu lösen, und lassen Sie 50 bis 80 Mikroliter auf dem Zellpellet. Das Zellpellet im Stammzellausdehnungsmedium auf ein Endvolumen von 200 Mikrolitern aussetzen.Bereiten Sie eine sterile Gewebekultur behandelt 96 U-Boden-Brunnenplatte, und identifizieren Sie die Brunnen, in denen die Zellen kultiviert werden. Übertragen Sie 100 Mikroliter 2x Basalmedium, das zuvor in diesen Brunnen hergestellt wurde. In der nr markierten gut, fügen Sie zwei Mikroliter einer 100x Nicotinamid-Ribosi-Lösung.Übertragen Sie 100 Mikroliter 2x Basalmedium in Brunnen zur Färbekontrolle. Samen 100 Mikroliter vorbereiteter hämatopoetischer Stammzellen auf den Brunnen, die 2x Basalmedium enthalten. Samen 100 Mikroliter ganzer Knochenmarkzellen auf Brunnen, die als Fleckenkontrollen gekennzeichnet sind.Fügen Sie 200 Mikroliter autoklaviertes Wasser in alle umliegenden Brunnen hinzu, um die Verdunstung aus Brunnen, die Zellen enthalten, zu reduzieren. Legen Sie die Platte ungestört in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für 72 Stunden. Nehmen Sie den Teller heraus, um Nicotinamid-Ribosi alle 24 Stunden aufzufüllen, und legen Sie ihn wieder in den Inkubator.Am Ende der Kulturperiode zwei Mikroliter 100x TMRM-Lösung und zwei Mikroliter 100x grüne fluoreszierende Fleckenlösung in jede der Testbrunnen geben. Fügen Sie zwei Mikroliter 100x TMRM in die TMRM-Färbungskontrolle gut ein. Fügen Sie zwei Mikroliter von 100x grünen fluoreszierenden Fleck in der MitoTracker Färbung Gut.Bedecken Sie die Oberseite der Platte mit Aluminiumfolie. und legen Sie die Platte wieder in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für 45 Minuten. Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator, und zentrifugieren Sie sie bei 300 mal g für fünf Minuten.Invertieren Sie die Platte, um den Überstand zu entfernen, und fügen Sie 200 Mikroliter Standard-FACS-Puffer hinzu, um sie wieder aufzuhängen. Bedecken Sie die Platte mit Folie. Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 mal g für fünf Minuten.Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal. Setzen Sie die Zellen in 200 Mikroliter FACS-Puffer aus und übertragen Sie sie in FACS-Rohre. Um die Proben auf dem Durchflusszytometer auszuführen, laden Sie zuerst die einzelnen Farbsteuerelemente in das Gerät, und zeichnen Sie jeweils mindestens 5.000 Ereignisse auf.Drücken Sie in der Software Acquire and then Record auf dem Dashboard, um einzelne Farbsteuerelemente zu erfassen und aufzuzeichnen. Drücken Sie Compensation Setup, und klicken Sie auf Vergütung berechnen, um die Vergütung zu berechnen. Sobald die Kompensation angewendet wurde, erwerben Sie die hämatopoetische Stammzellprobe und zeichnen Sie so viele Ereignisse wie möglich auf.Exportieren Sie die FACS-Dateien aus dem Zytometer, und öffnen Sie die Datei auf der Analysesoftware. Verwenden Sie in FlowJo Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung, um die Zellpopulation zu identifizieren. Identifizieren Sie Singlets in den nächsten Gates, und zeichnen Sie dann den negativen DAPI-Anteil, der lebende Zellen darstellt.Erstellen Sie im Live-Zell-Tor ein Konturdiagramm im TMRM- und grünen fluoreszierenden Fleckenkanal, um das mitochondriale Membranpotenzial bzw. die Masse zu messen. Exportieren Sie die mittlere Fluoreszenzintensität dieser beiden Kanäle im Live-Zell-Gate. Exportieren Sie dann den Anteil der Zellen im TMRM-Low-Gate in allen Proben.Die Behandlung mit Nicotinamid-Ribosi zeigte einen deutlichen Anstieg der TMRM-Armenpopulation. Es erhöhte auch signifikant den Anteil der Zellen im TMRM Low Gate und zeigte eine signifikante Senkung der TMRM-Fluoreszenzintensität. Mitochondriale Masse änderte sich nicht auf Nicotinamid Ribosid Supplementierung.Zusätzlich wurde die Mastzellmarkerfärbung mit der mitochondrialen Färbung nach der Kultur kombiniert. Mit der Gating-Strategie zur Identifizierung hämatopoetischer Stammzellen zeigte die Exposition gegenüber Nicotinamid-Ribosid einen signifikanten Anstieg der TMRM-Niedrigen Population und eine signifikante Abnahme der TMRM-Fluoreszenzintensität in gated HSCs. Das grüne fluoreszierende mitochondriale Fleckgrünsignal blieb in den beiden Bedingungen unverändert.Es ist wichtig, die Färbeplatte mit Aluminiumfolie zu bedecken, um die Lichteinwirkung von Fleckenproben zu minimieren. Diese Methode kann mit nachgelagerten Assays wie Knochenmarktransplantation und koloniebildenden Assays kombiniert werden, um die Funktionalität Ihrer Stammzellen zu bestimmen. Diese Technik ermöglicht eine einfache Screening-Methode zur Identifizierung neuartiger Metabolenmodulatoren von HSCs.

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Biologie

Dieses Video zeigt die Markierung neuronaler Zellen mit Antikörpern für mitochondriale Atmungskettenkomplexe, mitochondriale DNA-assoziierte Proteine und mitochondriale äußere Membranproteine, gefolgt von einer Durchflusszytometrie zur Quantifizierung ihrer Spiegel.

Messung mehrerer mitochondrialer Parameter in Neuronen mittels Durchflusszytometrie

Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Detektion und Quantifizierung der mitochondrialen Außenmembran-Proteine ​​durch Immunmarkierung von Mitochondrien aus Nagetiergewebe und Analyse durch Durchflusszytometrie Strom isoliert. Diese Methode kann erweitert werden, um funktionale Aspekte der mitochondrialen Subpopulationen zu bewerten.

Immundetektion von Außenmembranproteinen mittels Durchflusszytometrie von isolierten Mitochondrien

Hier präsentieren wir eine Protokoll, die JC-1 Farbstoff verwendet, um die Mitochondrien-Membran-Potential der Zellen beurteilen nach Hypoxie/flussbettfilters mit oder ohne einem Schutzmittel ausgesetzt wird.

Ein Flow Cytometry-basierten Test zur Messung der Mitochondrien-Membran-Potential in kardialen Myozyten nach Hypoxie/Flussbettfilters

Dieser Artikel beschreibt eine leistungsfähige Methode zur Quantifizierung von Mitochondrien oder Lysosomen in lebenden Zellen. Die Kombination aus Lysosomen oder Mitochondrien-spezifische Farbstoffe mit Gewebekulturen konjugierten Antikörpern gegen Oberflächenmarker ermöglicht die Quantifizierung dieser Organellen in gemischten Zell-Populationen, wie primäre Zellen mithilfe von Gewebeproben, geerntet Multicolor Durchflusszytometrie.

Multicolor Flow Cytometry-basierte Quantifizierung der Mitochondrien, Lysosomen in T-Zellen

Wir beschreiben eine Methode zur Verwendung von Multiparameter-Durchflusszytometrie zum Nachweis von mitochondrialen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in murinen gesunden hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und Leukämiezellen aus einem Mausmodell akuter myeloischer Leukämie (AML), das von MLL-AF9.

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Xenobiotische Efflux-Pumpen sind hochaktiv in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und verursachen die Extrusion von TMRM, einem mitochondrialen Membranpotenzial fluoreszierender Farbstoff. Hier stellen wir ein Protokoll zur genauen Messung des mitochondrialen Membranpotenzials in HSPCs durch TMRM in Gegenwart von Verapamil, einem Efflux-Pumpeninhibitor, vor.

Verbesserung der Genauigkeit der zytometrischen Bewertung des mitochondrialen Membranpotenzials in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen durch die Hemmung von Efflux-Pumpen

Die metabolische Anpassung ist für T-Zellen von grundlegender Bedeutung, da sie Differenzierung, Persistenz und Zytotoxizität bestimmt. Hier wird ein optimiertes Protokoll zur Überwachung der mitochondrialen Atmung in ex vivo Zytokin-differenzierten humanen primären T-Zellen vorgestellt.

Echtzeitüberwachung der mitochondrialen Atmung in zytokindifferenzierten humanen primären T-Zellen

Diese Studie berichtet über einen neuartigen Ansatz zur Messung mehrerer mitochondrialer Funktionsparameter basierend auf Durchflusszytometrie und Doppelfärbung mit zwei fluoreszierenden Reportern oder Antikörpern, um Veränderungen des mitochondrialen Volumens, des mitochondrialen Membranpotentials, des reaktiven Sauerstoffgehalts, der mitochondrialen Atmungskettenzusammensetzung und der mitochondrialen DNA zu erkennen.

Durchflusszytometrische Analyse multipler mitochondrialer Parameter in humaninduzierten pluripotenten Stammzellen und deren neuronalen und glialen Derivaten

Die Methoden zur Untersuchung der mitochondrialen Bioenergetik unter physiologisch relevanten Substratkonzentrationen in Immunzellen sind begrenzt. Wir stellen ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, das hochauflösende Fluorespirometrie verwendet, um Veränderungen in der Reaktion des mitochondrialen Membranpotentials auf den Energiebedarf in menschlichen T-Zellen, Monozyten und peripheren mononukleären Zellen zu bewerten.

Hochauflösende Fluorespirometrie zur Beurteilung dynamischer Veränderungen des mitochondrialen Membranpotentials in menschlichen Immunzellen

Isolierung und Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen (HSZ)

Lernen Sie die Durchflusszytometrie zur Messung von mitochondrialer Masse und Membranpotential in hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen. Diese Methode ermöglicht die Analyse seltener Zellpopulationen und die Bewertung metabolischer Fitness.

Messung des mitochondrialen Masse- und Membranpotenzials in hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen durch Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal

Messung des mitochondrialen Masse- und Membranpotenzials in hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen durch Durchflusszytometrie

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