Gleichzeitige Affinitätsanreicherung von zwei posttranslationalen Modifikationen für Quantifizierung und Standortlokalisierung

Dieses Protokoll beschreibt die neuartige Technik zur gleichzeitigen Anreicherung mehrerer PTMs mit Antikörpern, gefolgt von einer datenunabhängigen Erfassungsmassenspektrometrieanalyse, um biologische Einblicke in die Standortlokalisierung und Cross-Talk zu gewinnen. Dies ist eine zeit- und kosteneffektive Technik, die die gleichzeitige Identifizierung und Quantifizierung von Peptiden mit Schneiden ermöglicht, die Acetylierungs- und Präsinylierungs-PTMs mit nur geringen Mengen an Probeneingaben enthalten. Das Nachverfolgen von post-translationalen Modifikationen ist ein wichtiger Schritt bei der Charakterisierung und Bekämpfung verschiedener Krankheitszustände.

Wir sind uns bereits bewusst, dass bestimmte Krebsarten und Diabetes durch diese Proteinmodifikationen stark reguliert sind. Diese Methode kann theoretisch auf alle PTMs mit Antikörpern zur Anreicherung wie Ubiquitination, Phosphorylierung und andere angewendet werden. Es kann auch auf andere Gewebetypen oder Zellkulturmodelle angewendet werden.

Der Schlüssel zur Gewinnung wertvoller Daten mit dieser Technik ist die Reproduzierbarkeit. Dies kann erreicht werden, indem sichergestellt wird, dass alle Schritte sehr sorgfältig durchgeführt werden, insbesondere die Schritte mit den Antikörperperlen. Zu Beginn erhalten Sie Kartuschen, die C18-Harz enthalten, die bis zu 10 Milligramm Protein kombiniert.

Montieren Sie diese Patronen in ein Vakuumgerät. Fügen Sie 800 Mikroliter 80%Acetonitril und 0,2% Ameisensäure zu den Kartuschen mit 19,8% Wasser hinzu und starten Sie die Vakuumabsaugung, um die Flüssigkeit durchzuziehen. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal, um eine vollständige Trocknung der Patronen zu vermeiden.

Ausgleichen Sie die Patronen, indem Sie 800 Mikroliter 0,2% Ameisensäure in Wasser mit Vakuumabsaugung hinzufügen. Wiederholen Sie dies zweimal. Ein Milligramm Peptide in ca. 1.000 Mikroliter Lösung mit Vakuumabsaugung auf die Kartuschen laden.

Waschen Sie die Peptide zweimal mit 800 Mikrolitern 0,2% Ameisensäure in Wasser unter Vakuumabsaugung. Dann 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohre unter jeder Patrone anordnen, um das Peptid zu sammeln. Unter Vakuumabsaugung werden die Peptide von Kartuschen zuerst mit 800 Mikrolitern 80%acetonitril und 0,2% Ameisensäure in 19,8% Wasser und dann mit 400 Mikrolitern derselben Lösung.

Trocknen Sie die entsalzten Peptidproben zwei bis drei Stunden lang vollständig in einem Vakuumkonzentrator. Setzen Sie nun die getrockneten Peptide in 1,4 Milliliter kaltem 1X Immunaffinitätsreinigungspuffer wieder auf. Wirbel zu mischen und einen pH-Wert von ca. 7 zu gewährleisten.

Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Ein kleines Pellet erscheint. Legen Sie die Peptide beiseite auf Eis, während Sie Antikörperperlen vorbereiten.

Fügen Sie einen Milliliter kalte 1X PBS in ein Rohr mit 100 Mikroliter K-Acetyl-Antikörper-Perlenschlämme und eine Tube mit 100 Mikroliter K-Succinyl-Antikörper-Perlenschlämme und mischen Sie durch Pipettiern. Übertragen Sie die gesamte Lösung auf neue 1,5-Milliliter-Rohre und drehen Sie sie in einer Miniaturzentrifuge 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie die PBS darauf, keine Perlen abzusehen.

Wiederholen Sie die Wäsche dreimal. Als nächstes, resuspendieren Sie die Perlen in etwa 440 Mikroliter PBS. Pipette die Perlen mehrmals gut mischen.

Mit 200 Mikroliter Vorschnitten 100 Mikroliter jeder Acetyllysin-Antikörperperlen und Succinyllysin-Antikörperperlen in ein neues Rohr geben. Drehen Sie 30 Sekunden in einer Miniaturzentrifuge nach unten und aspirieren Sie die Medien mit einer Gelladerspitze ab. Die Perlen werden jetzt weiß.

Das resuspendierte Peptid direkt auf die gewaschenen Perlen pfeifen und die Peptide mit Perlen bei vier Grad Celsius über Nacht mit Aufregung bebrüten. Am Morgen drehen Sie die Peptidproben bei 2.000 mal g für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand, der ungebundene Peptide enthält, und speichern Sie ihn bei zukünftigen Experimenten, falls gewünscht.

Fügen Sie einen Milliliter kalten 1X Immunaffinitätsreinigungspuffer zu den Perlen hinzu, um sie zu waschen und zu mischen, indem Sie fünfmal invertieren. Drehen Sie bei 2.000 mal g für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius. Die Immunaffinitätsreinigungslösung absaugen und den Reinigungsschritt der Immunoaffinität noch einmal wiederholen.

Dann fügen Sie einen Milliliter kaltes HPLC-Wasser in die Perlen und mischen, indem Sie fünfmal invertieren. Drehen Sie bei 2.000 mal g für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius. Das Wasser absaugen und den Wasserwaschschritt zwei weitere Male wiederholen.

Drehen Sie eine zusätzliche Zeit bei 2.000 mal g für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius, um das verbleibende Wasser im Boden der Röhre zu sammeln. Mit flach gekippten Gel-Ladespitzen, aspirieren Sie jedes zusätzliche Wasser, das gesammelt haben. Achten Sie darauf, die Perlen nicht zu beaspirieren.

55 Mikroliter 0,15% Trifluoressigsäure in Wasser zu den Perlen geben. Inkubieren Sie die Perlen für 10 Minuten bei Raumtemperatur, während gelegentlich tippen Sie auf den Boden des Rohres zu mischen. Drehen Sie die Perlen bei Raumtemperatur für 30 Sekunden in einer Miniaturzentrifuge.

Verwenden Sie eine flache gekippte Gel-Ladespitze, um die eluierten Peptide in ein neues Rohr zu übertragen. 45 Mikroliter 0,15% Trifluoressigsäure in Wasser zu den Perlen geben. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, während Sie gelegentlich auf den Boden des Rohres tippen, um sie zu mischen.

Drehen Sie die Perlen bei Raumtemperatur für 30 Sekunden in der Miniaturzentrifuge. Entfernen Sie die zweite Elution mit einer flachen gekippten Gel-Ladespitze und kombinieren Sie sie mit der ersten Elution. Drehen Sie die kombinierten eluierten Peptide bei 12.000 mal g für fünf Minuten bei Raumtemperatur, um alle Perlen, die übertragen, zu pellet.

Übertragen Sie die Peptid-Probenlösung in eine neue 500-Mikroliter-Röhre. Bauen Sie die Lademethode auf, um die angereicherten Peptidmischungen auf einen C18-Vorsäulenchip zu laden und die Peptide wieder zu entsalzen, indem Sie mit der mobilen Phase A mit zwei Mikrolitern pro Minute 10 Minuten waschen. Erstellen Sie die Chromatographie-Methode so, dass Peptide in eine analytische Säule übertragen werden und mit einer Durchflussrate von 300 Nanolitern pro Minute mit einem zwei- bis dreistündigen Gradienten mit den mobilen Phasen A und B eine geschwindigkeit von 35 % betragen.

Anschließend wird die mobile Phase B über fünf Minuten auf 80 % hochgefahren und dann acht Minuten lang bei 80 %B halten, bevor sie für eine 25-minütige Wiederabgleich auf 5%B zurückkehrt. Erstellen Sie als Nächstes eine MS-Instrumentmethode für die datenabhängige Erfassung. Richten Sie für Versuch 1 den MS1-Vorläuferionenscan von M/Z 400 bis 1, 500 ein.

Stellen Sie die Dauer auf 120 Minuten ein. Erstellen Sie ein IDA-Experiment, und klicken Sie auf OK. Legen Sie unter der Registerkarte Schalterkriterien den Intensitätsschwellenwert fest, um MS/MS-Scans für Ionen geladener Zustände zwischen zwei und fünf bis 200 Zählungen pro Sekunde auszulösen. Stellen Sie den dynamischen Ausschluss von Vorläuferionen auf 60 Sekunden ein.

Für Versuch zwei stellen Sie ms/MS-Produktionenscan mit einem MS2-Scanbereich von M/Z 100 bis 1, 500 ein. Klicken Sie auf Parameter bearbeiten, und stellen Sie die Kollisionsenergiestreuung auf fünf ein, und wählen Sie den Hochempfindlichkeits-Produkt-Ionen-Scan-Modus aus. Platzieren Sie die Probe schließlich im Autosampler.

Senden Sie die Beispielwarteschlange und starten Sie LC-MS/MS-Erfassungsmethoden, indem Sie eine MS-Instrumentenmethode für die datenunabhängige Erfassung erstellen und zwei Instrumentenscanexperimente definieren. Führen Sie MS1-Vorläuferionenscans von 400 bis 1, 250 Masse aufundladen und stellen Sie die Dauer auf 120 Minuten ein. Stellen Sie die Kollisionsenergieausbreitung auf 10 und die Akkumulationszeit auf 45 Millisekunden ein und wählen Sie dann den Hochempfindlichkeits-Produkt-Ionen-Scan-Modus aus.

Importieren Sie anschließend eine Textdatei mit dem 64-Variablenfenster DIA SWATH-Erfassungsschema, um SWATH-Erfassungsfenster in die Methode aufzufüllen. In diesem Erfassungsschema werden variable Fenster von fünf bis 90 Masse bis Ladung und Breite in schrittweisen Schritten über den gesamten Massenbereich von 400 bis 1, 250 Masse mit insgesamt 64 SWATH-Segmenten mit einer Akkumulationszeit von 45 Millisekunden übertragen. Passen Sie die MS1-Akkumulationszeit auf 0,25 Sekunden an.

Zusammen sollen der MS1-Scan und 64 MS2-Scans nun eine Gesamtzykluszeit von 3,2 Sekunden ergeben. In dieser Studie dokumentierten experimentelle Ergebnisse die Möglichkeit, PTM-Cross-Talk zu erkennen und zu bewerten. Diese Tabelle zeigt, wie die Zeitachse des Workflows und die Menge an Proben und Protein enthont werden.

Die Ein-Topf-Methode kann in der Hälfte der Zeit und mit der Hälfte der Anzahl der Proben als diese alternativen Methoden durchgeführt werden. Der mittlere Variationskoeffizient für die modifizierten Peptidbereiche war bei der Ein-Topf-Methode niedriger als bei der einzelnen PTM- und seriellen PTM-Anreicherung. Beim Vergleich der Ein-Topf-PTM- und der einzelnen PTM-Anreicherungsmethoden waren keine nennenswerten Unterschiede zwischen den Korrelationen der Quantifizierung auf Standortebene für die beiden Modifikationen erkennbar.

Diese Abbildung zeigt Daten aus einer erfolgreichen Anreicherung und veranschaulicht ein Beispiel für ein Peptid, das mehrere und verschiedene Acylmodifikationen enthält, die PTM-Cross-Talk visualisieren. Ein Peptid wurde auf einem Lysinrückstand acetylaced iert und auf dem anderen prägnant, während hier das gleiche Peptid bei beiden Lysinen prägnant war. Dies zeigt, dass der gleiche Lysinrückstand mit beiden Acylationsgruppen modifiziert werden kann und es die Möglichkeit gibt, an dieser Stelle Zusprechgespräche zu führen.

Es ist wichtig, sicherzustellen, dass jede Probe die gleiche Menge an Perlen enthält und sicherzustellen, dass keine der Perlen versehentlich beim Waschen von Peptid-Bindungsperlen angesaugt wird. Massenspektrometrie-basierte Profilerstellung und Datenanalyse in Software-Tools wie Spectronaut werden nach diesem Verfahren durchgeführt, um die Standortlokalisierung von PTMs zu identifizieren, zu quantifizieren und durchzuführen. Dieser datenunabhängige Erfassungsworkflow in Kombination mit gleichzeitiger PTM-Anreicherung wird Wege eröffnen, PTM-Cross-Talk effizienter zu bewerten und bessere Einblicke in die Relevanz der PTM-Signalisierung zu geben.