Herstellung von Proteinproduktion synthetischer Zellen mit zellfreien bakteriellen Extrakten, Liposomen und Emulsionstransfer

Protein produzierende synthetische Zellen bieten eine vielseitige Plattform, um die Ursprünge des Lebens zu untersuchen, sowie synthetische zellbasierte Therapien für die fortgeschrittene Medikamentenabgabe. Diese Methode ist einfach und erschwinglich für die RNA- und Proteinexpression und kann für die therapeutische Proteinproduktion vor Ort direkt im Körper angewendet werden. Die Systeme können zur Behandlung einer breiten Palette von Krankheiten verwendet werden, von Stoffwechselerkrankungen und Proteinersatz bis hin zu Krebs und möglicherweise Diabetes.

Dieses mehrstufige Protokoll verfügt über einen definierten Stopppunkt. Bei der ersten Ausführung wird empfohlen, die Arbeit auf mehrere Tage aufzuteilen. Das Protokoll für die synthetische Zellproduktion beginnt mit der Herstellung des zellfreien S30-T7-Lysats.

Als nächstes werden die Membranlipide und die zelluläre Nährstofflösung vorbereitet, um die innere Umgebung zu simulieren und die Proteinproduktion zu unterstützen. Der letzte Schritt ist die Herstellung der synthetischen Zellen selbst. Bereiten Sie doppelte Starterkulturen in 100 Milliliter Erlenmeyer-Flaschen vor.

Zu jedem Kolben, fügen Sie fünf Milliliter LB-Medien mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin und Inoculate mit einer einzigen E.coli-Kolonie ergänzt. Wachsen Sie die Kultur über Nacht in einem Boden-Inkubator-Shaker bei 250 Umdrehungen pro Minute und 37 Grad Celsius. Als nächstes bereiten Sie zwei Liter verwirrte Erlenmeyer-Flaschen mit 500 Milliliter TB-Medien zu, ergänzt um 50 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin.

Impfen Sie jeden Zwei-Liter-Kolben mit einer Fünf-Milliliter-Starterkultur. Die Kolben bei 250 U/min und 37 Grad Celsius in einen Shaker geben. Überwachen Sie die Kulturen regelmäßig mit einem Spektralphotometer und wachsen Sie die Kulturen bis OD600 zwischen 0,8 und eins.

Um die T7-RNA-Polymerase-Expression zu induzieren, fügen Sie jedem Kolben drei Milliliter 100 Millimolar IPTG hinzu, um 0,6 Millimolar zu erreichen. Die Kulturen werden weiter wachsen lassen, bis OD600 ungefähr vier Jahre alt ist. Nachdem die Kulturen die gewünschte optische Dichte erreicht haben, übertragen Sie die Suspension von jedem Erlenmeyerkolben in zwei 250 Milliliter sterilisierte Zentrifugenrohre.

Zentrifugieren Sie die Rohre bei 7 000 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand. Jedes Pellet in 250 Milliliter kaltem S30-Lysatpuffer auf Wunsch mit einem Rührwerk aufheben.

Zentrifuge bei 7 000 mal g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie alle Pellets zusammen in 15 Milliliter kaltem S30-Lysatpuffer wieder auf. Filtern Sie die Aufhängung mit Gazepads.

Bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren, kühlen Sie die Spitzen in 1,5 Milliliter-Fläschchen vor, die für die Lagerung des Lysats benötigt werden. Homogenisieren Sie die Aufhängung zweimal. Verwenden Sie einen Arbeitsdruck von 15.000 PSI mit einem Luftdruck von vier bar für Zellbruch.

Sammeln Sie das Homogenat. 100 Mikroliter 0,1 Mol DTT pro 10 Milliliter der homogenisierten Suspension hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Federung bei 24, 700 mal g bei 30 Minuten bei vier Grad Celsius.

DTT und Chloroform werden als reizend und schädlich eingestuft und sollten daher mit Vorsicht behandelt werden. Chloroform, das später im Protokoll verwendet wird, muss in einem Bereich mit Rauchabsaugung verwendet werden. Führen Sie den Schritt schnell aus, um die Lysataktivität beizubehalten.

200 Mikroliter Aliquots überstand in vorgekühlte Fläschchen geben und sofort mit flüssigem Stickstoff einfrieren. Bewahren Sie die Fläschchen bei minus 80 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung auf. PopC und Cholesterin in Chloroform jeweils auf eine Endkonzentration von 100 Milligramm pro Milliliter auflösen.

Wirbel jede Durchstechflasche separat. Kombinieren Sie die Komponenten in einer zwei Milliliter Glasdurchstechflasche. Fügen Sie 50 Mikroliter der Cholesterin-Chloroform-Lösung, 50 Mikroliter der POPC-Chloroform-Lösung und 500 Mikroliter Mineralöl hinzu.

Wirbeln Sie die Durchstechflasche, dann die Chloroform zu verdampfen, erhitzen Sie es für etwa eine Stunde bei 80 Grad Celsius in einer chemischen Haube. Bevor Sie mit der Herstellung der synthetischen Zelle beginnen, bereiten Sie die äußeren, vor-inneren und Fütterungslösungen vor, wie im Manuskript beschrieben. Dann 1,2 Milliliter der äußeren Lösung in ein 15-Milliliter-Rohr geben und langsam eine Schicht von 500 Mikroliter Lipiden-in-Öl-Lösung aus der ersten Glasdurchstechflasche hinzufügen.

Inkubieren Sie die Röhre bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Um die innere Lösungsvorbereitung fertigzustellen, mischen Sie auf Eis auf ein endgültiges Volumen von 100 Mikrolitern, indem Sie S30-T7-Lysat und DNA-Plasmid hinzufügen. 100 Mikroliter der inneren Lösung mit Lysat und Plasmid in die zweite Zwei-Milliliter-Glasdurchstechflasche mit 500 Mikroliter Lipid-in-Öl-Lösung geben.

Pipette für eine Minute kräftig auf und ab und dann wirbelt für eine weitere Minute auf Stufe fünf. Nachdem Sie die resultierende Emulsion 10 Minuten lang auf zerkleinertem Eis inkubiert haben, fügen Sie die Emulsion langsam auf die Ölphase in die 15-Milliliter-Röhre ein. Zentrifugieren Sie das Rohr für 10 Minuten bei 100 mal g und vier Grad Celsius.

Dann Zentrifuge für 10 Minuten bei 400 mal g und vier Grad Celsius. Am Ende der Zentrifugation sollte ein Pellet an der Unterseite des Rohres beobachtbar sein. Um das Pellet zu extrahieren, entfernen Sie zuerst die überschüssige Ölschicht.

Als nächstes laden Sie eine getrimmte Pipettenspitze mit ca. 400 Mikroliter außen lösungsmittel und verwenden Sie die Pipettenspitze, um das Pellet zu sammeln, wobei die äußere Lösung freisetzt wird, während die Pipettespitze die Ölphase durchläuft. Wischen Sie die Pipettenspitze ab und übertragen Sie das Pellet in ein sauberes 1,5-Milliliter-Rohr. Zentrifugieren Sie das Pellet für 10 Minuten bei 1 000 mal g und vier Grad Celsius.

Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 100 Mikroliter Futterlösung wieder auf. Für die Proteinexpression, inkubieren Sie die Suspension für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius ohne schütteln. Plasmide, die das Modell Protein sfGFP und Renilla luciferase exzessiieren, wurden in die zellfreie Proteinsynthese, CFPS-Massenreaktionen und synthetische Zellen eingeführt.

Die Proteinproduktion wurde mit mehreren Methoden bewertet. Western Blot Analyse entdeckt sfGFP His6 Produktion in CFPS Bulk-Reaktionen und in synthetischen Zellen. Purified sfGFP His6 wurde als positiv erachtet.

Ein Fluoreszenzmikroskop mit Brightfield und gfP-Filter zeigen synthetische Zellen, die sfGFP produzieren. Die Durchflusszytometrie wurde verwendet, um sfGFP zu analysieren, die synthetische Zellen produzierten. Die Berechnung der aktiven synthetischen Zellpopulation basierte auf dem sfGFP-Fluoreszenzintensitätsschwellenwert, der durch die negative DNA-Probe definiert wurde, die durch das rote Histogramm dargestellt wird.

Die mittlere Fluoreszenzintensität von sfGFP zur Herstellung synthetischer Zellen wurde aus der aktiven synthetischen Zellpopulation berechnet und zur negativen DNA-Probe normalisiert. Die Durchmesserverteilungen der aktiven synthetischen Zellen wurden auf Basis des sfGFP-Signals berechnet. Die Aktivität der Renilla-Luziferase wurde mit Lumineszenzmessungen quantifiziert.

Diese Methode ist sehr vielseitig und kann für verschiedene Zielproteine optimiert werden, indem Lysatursprung, Lipidzusammensetzung und innere Lösungskonzentrationen verändert werden. FaCS-Analysen von synthetischen Zellen, die ein fluoreszierendes Markerprotein produzieren, könnten durchgeführt werden, um einen quantitativen Wert des Anteils aktiver synthetischer Zellen bereitzustellen. Die Western-Blot-Analyse würde die Proteinproduktion messen.