Name: Ein Neurit Engrowth Assay und Neurotoxizität Satonie-Bewertung mit menschlichen neuronalen Vorläufer Cell-Derived Neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-06T15:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Lernen Sie einen Neuriten-Auswuchs-Assay zur Neurotoxizitätsbewertung mit humanen neuronalen Vorläuferzellen. Diese Methode ermöglicht Screening kleiner Moleküle mit hoher translationsmedizinischer Relevanz.

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Diese Forschung wurde durch ein NIMAD-Forschungsstipendium (940714) finanziert, das mAF gewährt wurde.

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</ol>

Alle Autoren weisen auf keine potenziellen Interessenkonflikte hin.

Dieses Protokoll ist eines der wenigen veröffentlichten Papiere, die den Test auf Neuritenlänge bei der Behandlung mit Testverbindungen beschreiben. Darüber hinaus beschreiben wir, wie hNPCs für einen Neuriten-Outgrowth-Assay und eine Neurotoxizitätsbewertung verwendet werden. Durch die Verwendung dieses Neuriten-Outgrowth-Assays und der Neurotoxizitätsbewertung an hNPCs-abgeleiteten Neuronen wird das neurogene Potenzial einer Kategorie von epigenetischen Kleinmolekülverbindungen, HDAC-Hemmern, bei der Induktion von Neur...

Das Neuritwachstum ist ein Prozess, der für die Bildung des neuronalen Netzwerks und der Nervenregeneration1,2von grundlegender Bedeutung ist. Nach einer Verletzung spielt das Neuritenwachstum eine Schlüsselrolle bei der Regeneration des Nervensystems. Neuritenwachstum ist auch ein wichtiges Element der extrazellulären Signalisierung bei der Induktion neuronaler regenerativer Aktivitäten zur Verbesserung der Ergebnisse bei neurodegenerativen Erkrankungen und neuronalen Verletzungen3,4,5,6.
Durch die Aufrechterhaltung ihres Differenzierungspotenzials bei der Herstellung verschiedener neuronaler Abstammungen könnten menschliche neuronale Vorläuferzellen (hNPCs) ein Modellsystem für Studien der Funktion des zentralnervensystems (ZNS) und der Entwicklung7,8,9. Hohes Translationspotenzial und physiologische Relevanz von hNPCs als primäres menschliches Zellmodell bieten einen erheblichen Vorteil bei neurititbedingten Antik-Entdeckungsscreenings. Die Wartung und Skalierung der primären Zellmodelle für Tests mit hohem Durchsatz kann jedoch zeitaufwändig und arbeitsintensiv sein10,11,12,13.
Neben der Anwendung der vorgestellten Methode in Neuriten-Auswuchsstudien ist die Neurotoxizitätsbewertung eine weitere Anwendung mit den hNPC-abgeleiteten Neuronen. Es gibt Tausende von kommerziellen chemischen Verbindungen, die entweder nicht untersucht werden oder mit schlecht verstandenem Neurotoxizitätspotenzial. Daher sind zuverlässigere und effektivere Screening-Experimente zur Bewertung, Unterscheidung und Rangfolge von Verbindungen basierend auf ihrem Potenzial, eine Entwicklungsneurotoxizität auszulösen, sehr gefragt14. Die Zunahme der Prävalenz und Inzidenz von neurologischen Störungen zusammen mit der Fülle von ungetesteten Verbindungen in der Umwelt erfordert die Entwicklung von vertrauenswürdigeren und effizienteren Experimenten, um gefährliche Umweltverbindungen zu identifizieren, die Neurotoxizität darstellen können15.
Die vorgestellte Methode hierin kann verwendet werden, um für die Fähigkeit von Verbindungen zu untersuchen, um Neuritenwachstum und Neurotoxizität zu induzieren, indem die Vorteile der menschlichen neuronalen Vorläufer-Zell-abgeleiteten Neuronen, ein Zellmodell, das eng die menschliche Biologie darstellt.

<table><tbody><tr><td>4-Well-Glaskammer-Objektträger</td><td>Sigma</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>R37117</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotisch-Antimykotisch</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&Beta;-Tubulin III</td><td>Thermo</td><td>MA1-118X</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermo</td><td></td><td></td>17504001</tr><tr><td>B27 - minus Vitamin A</td>, <td>Thermo</td><td>12587010</td> BDNF, <td></td></tr><tr><td></td><td>PeproTech</td><td>450-02</td><td></td></tr>, <tr><td>BSA</td>, <td></td><td>Sigma A8531</td><td></td></tr>, <tr><td>CellTiter-Glo</td>, <td>Promega</td><td>G7572</td><td></td></tr>, <tr><td>CoolCell</td><td>, Corning</td><td>432000</td><td>Zellen-Gefrierbehälter, die eine standardisierte kontrollierte Rate gewährleisten -1&#176; C/Minute Einfrieren der Zelle in einem -80&#176; C Gefrierschrank</td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>StemCell Technologies</td><td>7930</td><td>Kryokonservierungsmedium mit 10% DMSO</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>34869-100ML</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Gibco</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>FGF</td><td>Gibco</td><td>PHG6015</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Thermo</td><td>FB002</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PeproTech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>L-Alanyl-L-Glutamin Nahrungsergänzungsmittel</td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Thermo</td><td>50062Z</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Calbiochem</td><td>375095</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure</td><td>Sigma</td><td>A92902-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Lysin</td><td>Sigma</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>MEM nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>StemCell Technologies</td><td>5854</td><td>Serumfreies Kryokonservierungsmedium für die Kryokonservierung von menschlichen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen</td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 384-Well Polystyrol Weiße Mikrotiterplatten</td><td>Thermo</td><td>164610</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma</td><td>P5899-5MG</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Eindeckmittel</td><td>Thermo</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Retinsäure</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>Zelldissoziationsreagenz mit proteolytischen und kollagenolytischen Enzymen</td></tr><tr><td>Synaptophysin</td><td>Thermo</td><td>MA5-14532</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

ein neurit engrowth assay und neurotoxizität satonie-bewertung mit menschlichen neuronalen vorläufer cell-derived neuronen

A Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment with Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons

Neuriten-Auswuchs-Assay und Neurotoxizitätsbewertung sind zwei wichtige Studien, die mit der vorgestellten Methode hierin durchgeführt werden können. Dieses Protokoll bietet eine zuverlässige Analyse der neuronalen Morphologie zusammen mit quantitativen Messungen von Modifikationen auf Neuritenlänge und synaptische Proteinlokalisierung und Fülle bei der Behandlung mit kleinen Molekülverbindungen. Zusätzlich zur Anwendung der vorgestellten Methode in Neuriten-Auswuchsstudien kann eine Neurotoxizitätsbewertung durchgeführt werden, um kommerzielle chemische Verbindungen auf der Grundlage ihrer potenziellen Entwicklungs-Neurotoxizitätswirkung zu bewerten, zu unterscheiden und zu ordnen.
Obwohl Zelllinien heutzutage in zusammengesetzten Screening-Assays in der Neurowissenschaft weit verbreitet sind, unterscheiden sie sich oft genetisch und phänotypisch von ihrem Gewebeursprung. Primärzellen hingegen behalten wichtige Marker und Funktionen bei, die in vivo beobachtet werden. Aufgrund des Übersetzungspotenzials und der physiologischen Relevanz, dass diese Zellen einen Neuriten-Auswuchs-Assay anbieten könnten, kann die Neurotoxizitätsbewertung erheblich von der Verwendung menschlicher neuronaler Vorläuferzellen (hNPCs) als primäres menschliches Zellmodell profitieren.
Die vorgestellte Methode hierin kann verwendet werden, um für die Fähigkeit von Verbindungen zu untersuchen, um Neuritenwachstum und Neurotoxizität zu induzieren, indem die Vorteile der menschlichen neuronalen Vorläuferzell-abgeleiteten Neuronen, ein Zellmodell, das eng die menschliche Biologie darstellt."

Das im Manuskript vorgestellte Protokoll wurde erfolgreich in zwei kürzlich veröffentlichten Papieren22,23verwendet. Abbildung 3 zeigt die Verwendung von hNPCs-abgeleiteten Neuronen bei der Untersuchung der Wirkung von HDAC-Inhibitoren als epigenetische Verbindungen auf die Ausdehnung von Neuriten als Marker für das Neuritenwachstum und die anschließende neurogene Fähigkeit kleiner Molekülverbindungen.
Dar...

Das vorgestellte Protokoll beschreibt eine Methode für einen Neuriten-Auswuchs-Assay und neurotoxizitätsbewertete kleine Molekülverbindungen.

Ein Neurit Engrowth Assay und Neurotoxizität Satonie-Bewertung mit menschlichen neuronalen Vorläufer Cell-Derived Neuronen

Neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment are two major studies that can be performed using the presented method herein. This protocol provides ...

Das vorgestellte Protokoll zur Beschreibung des Neuriten-Auswuchs-Assays, der für die menschliche Biologie und die Neurotoxizitätsbewertung einer kleinen Molekül-Verbindungen von großer Bedeutung ist. Hohes Translationspotenzial und physiologische Relevanz menschlicher neuronaler Vorläuferzellen als primäres menschliches Zellmodell bieten einen erheblichen Vorteil im neuritrischen Antik-Entdeckungsscreening und der Neurotoxizitätsbewertung. Unter Verwendung des vorgestellten Protokolls können humaninduzierte pluripotente Stammzell und menschliche embryonale Stammzellen-abgeleitete Neuronen auch als alternative Zellquellen für den Neuriten-Auswuchs-Assay und die Neurotoxizitätsbewertung verwendet werden.Beginnen Sie mit dem Sammeln der Medien mit schwimmenden Neurosphären und übertragen Sie es auf eine 50 Milliliter konische Röhre. Zentrifugieren Sie das Rohr drei Minuten lang bei 300 bis 400 mal g. Dann den Überstand vorsichtig ansaugen.und setzen Sie die Kugeln in 500 Mikroliter aufgetauten Zelldissoziationsreagenz wieder auf. Die Kugeln bei 37 Grad Celsius für fünf bis 15 Minuten bebrüten. Dann fünf bis zehn Milliliter vorgewärmter Kulturmedien hinzufügen und das Rohr bei 300 bis

a-neurite-outgrowth-assay-neurotoxicity-assessment-with-human-neural

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieser Artikel beschreibt ein neuartiges Protokoll und Reagenz-Set für empfindliche Messung der neurotoxischen Wirkungen von Verbindungen und Behandlungen auf Co-Kulturen von Neuronen und Astrozyten mit High Content Analyse entwickelt. Die Ergebnisse zeigen, dass High Content Analyse eine spannende neue Technologie für die Neurotoxizität Beurteilung darstellt.

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Neuroblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen neuronalen Vorläuferzellen und neuronalen Zelltypen in sich entwickelnden ZNS für neuronale Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

Diese Video-Protokoll zeigt ein neues Verfahren zur Erzeugung und anschließender Reinigung von neuronalen Vorläuferzellen aus einer erneuerbaren Quelle von neuralen Stammzellen (NSC) an körperlicher (Größe und Granularität internen) und fluoreszierenden Eigenschaften unter Verwendung von Durchflusszytometrie-Technologie.

Die Neuroblast Assay: Ein Test für die Erzeugung und Anreicherung von neuronalen Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen differenzieren Progeny mittels Durchflusszytometrie

Dieses Video demonstriert den Neurosphären-Migrationsassay für neuronale Vorläuferzellen – ein In-vitro-Assay zur Untersuchung der Migrationsreaktion von neuronalen Vorläuferzellen aus der Neurosphäre – mittels mikroskopischer Analyse.

NPC Neurosphere Assay: Ein in vitro Assay zur Beurteilung der Migrationsreaktion von neuralen Vorläuferzellen aus der Neurosphäre

In diesem Video beschreiben wir eine auf Lumineszenz basierende Methode, um die Neurotoxizität von Neuritenauswuchs fördernden niedermolekularen Verbindungen auf die Lebensfähigkeit von hNPC-abgeleiteten Neuronen zu bewerten. Der Assay misst den intrazellulären ATP-Spiegel, einen Indikator für die Lebensfähigkeit der Zellen, um die Neurotoxizität nach der Behandlung mit der Testsubstanz zu bewerten.

Lumineszenz-basierter Assay zur Beurteilung der Neurotoxizität von Testverbindungen auf Neuronen

Mit der Absicht, Veränderungen in miRNAs auf differenzierten humanen neuralen Stammzellen (hNSCs) zu charakterisieren, beschreiben wir die hNSC-Differenzierung auf einem dreidimensionalen System, die Bewertung von Veränderungen in der microRNA-Expression durch miRNA-PCR-Arrays und computergestützte Analysen zur Vorhersage von miRNA-Zielen und deren Validierung durch duale Luciferase-Assays.

Differenzierung einer Menschen Neural Stem Cell Line auf Dreidimensional Kulturen, Analyse der MicroRNA und mutmaßlichen Zielgene

In der Neurobiologie und Neurovirologie ist es von entscheidender Bedeutung, ein zuverlässiges, replizierbares in vitro System zu haben, das als translationales Modell für das dient, was in vivo in menschlichen Neuronen passiert. Dieses Protokoll beschreibt, wie humane SH-SY5Y-Neuroblastomzellen kultiviert und in lebensfähige Neuronen für den Einsatz in In-vitro-Anwendungen differenziert werden.

Differenzierung der SH-SY5Y humanen Neuroblastom-Zelllinie

Menschliche induzierte pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) gelten als ein leistungsfähiges Werkzeug für die Arzneimittel- und Chemikalien-Screening und für die Entwicklung neuer in vitro- Modelle für die Toxizitätstests, einschließlich Neurotoxizität. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Differenzierung von hiPSCs in Neuronen und Glia beschrieben.

Protokoll zur Differenzierung von human induzierten pluripotenten Stammzellen in Mischkulturen von Neuronen und Glia für Neurotoxizitätstests

Neurodevelopmental Prozesse wie Proliferation, Migration und Neurit Auswuchs bei neuropsychiatrischen Erkrankungen oft gestört sind. So präsentieren wir Protokolle, um schnell und reproduzierbar Diese Entwicklungsstörungen Prozesse im menschlichen iPSC-abgeleitete NPCs zu beurteilen. Diese Protokolle ermöglichen auch die Bewertung der Auswirkungen der relevanten Wachstumsfaktoren und Therapeutika auf NPC-Entwicklung.

Schnelle Erkennung von Entwicklungsstörungen Phänotypen in menschlichen neuronalen Vorläuferzellen (NPCs)

Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren zur Aussetzung und Kultivierung von neuronen menschlichen Stammzellen, die zuvor mehrere Wochen lang von neuronalen Vorläufern in vitro unterschieden wurden. Das Verfahren erleichtert bildgebende Assays von Neuriten, Synapsen und spät exemitten neuronalen Markern in einem Format, das mit Lichtmikroskopie und High-Content-Screening kompatibel ist.

Post-Differenzierung Replating von Human Pluripotent Stem Cell abgeleiteten Neuronen für High-Content Screening von Neuritogenese und Synapse Reifung

In diesem Bericht beschreiben wir ein einfaches Protokoll zur Untersuchung des Neuritenauswüchss in embryonalen kortikalen Neuronen von Ratten durch Co-Transfecting mit EGFP und dem Protein von Interesse.

Ein verbesserter grüner Fluoreszenzprotein-basierter Assay zur Untersuchung des Neuriten-Auswuchses in primärneuronen

Lernen Sie einen Neuriten-Auswuchs-Assay zur Neurotoxizitätsbewertung mit humanen neuronalen Vorläuferzellen. Diese Methode ermöglicht Screening kleiner Moleküle mit hoher translationsmedizinischer Relevanz.

Ein Neurit Engrowth Assay und Neurotoxizität Satonie-Bewertung mit menschlichen neuronalen Vorläufer Cell-Derived Neuronen

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