Name: Isolation, Transfektion und Langzeitkultur von Erwachsenenmaus und Rattenkardiomyozyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Lernen Sie die optimierte Isolation, Transfektion und Langzeitkultur adulter Maus- und Rattenkardiomyozyten mit RNAiMAX. Diese Methode ermöglicht über 20 Tage Kultur mit hoher Überlebensrate für kardiale Forschung.

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Diese Arbeit wurde durch Mittel der Abteilung für Pathologie und Labormedizin, Universität Cincinnati, College of Medicine, an Dr. Onur Kanisicak unterstützt; ein Stipendium der National Institutes of Health (R01HL148598) an Dr. Onur Kanisicak. Dr. Onur Kanisicak wird vom American Heart Association Career Development Award (18CDA34110117) unterstützt. Dr. Perwez Alam wird von der American Heart Association Postdoktorandenstipendium (AHA_20POST35200267) unterstützt. Dr. Malina J. Ivey wird durch ein NIH T32-Stipendium (HL 125204-06A1) unterstützt.

Alle Experimente sollten in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt werden, der vom U.S. National Institute of Health (NIH) veröffentlicht wurde. Alle Protokolle, die im Video angezeigt werden, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Cincinnati, College of Medicine, genehmigt.
1. Vorbereitung vor Derherzentnahme von erwachsenen Mäusen (und Ratten)
<ol><li>Bereiten Sie die entsprechenden Perfusions-, Enzym- und Stop-Lösungen gemäß den Rezepturen in Tabelle 1 bzw. Tabelle 2für die Ratten- bzw. Mausisolierung vor. Filtern Sie die Lösungen durch einen 0,22 m-Filter, um Verunreinigungen oder ungelöste Partikel zu entfernen.</li>
	<li>Reinigen und sterilisieren Sie die chirurgischen Instrumente, indem Sie sie 15 min in 70% Alkohol einweichen und anschließend mit doppelt destilliertem Wasser waschen. Lassen Sie die Werkzeuge auf einem sauberen Papiertuch trocknen.</li>
	<li>Das Wasserbad auf 37 oC vorheizen. Überprüfen Sie den Wasserstand im Wasserbad, um eine unterbrechungsfreie Zirkulation von warmem Wasser durch das Perfusionsgerät während des Eingriffs zu gewährleisten.</li>
	<li>Reinigen Sie das Perfusionsgerät, indem Sie mit 70% Alkohol für 5 min laufen. Wiederholen. HINWEIS: Erhöhen Sie den Durchfluss, der hilft, die Schläuche zu reinigen.</li>
	<li>Nach dem Alkoholdurchfluss reinigen Sie die Alkoholreste, indem Sie 10 min doppelt destilliertes Wasser laufen lassen.</li>
	<li>Richten Sie 3 mittelgroße Einweg-Polystyrol-Wägeschalen ein, um das Herz nach der Exzision zu reinigen. Füllen Sie die Gerichte mit 20 ml Myozytenpuffer.</li>
	<li>Fügen Sie 2-3 Tropfen Heparin zu jedem Gericht mit Hilfe von Pasteur Pipette und mischen Sie gut durch Pipettieren mehrere Male.</li>
	<li>Nehmen Sie eine 10 ml Spritze mit einer stumpfen Nadelkanüle ein. HINWEIS: Eine stumpfe Nadelkanüle kann durch Schneiden der Spitze einer sauberen, sterilen Nadel hergestellt werden. Zur Herstellung der Kanüle für die Maus bzw. die Ratte wurden eine 21 G Nadel und eine 14 G Nadel verwendet.</li>
	<li>Füllen Sie die Spritze mit Perfusionspuffer (Tabelle 1). Entfernen Sie alle Luftblasen aus der Spritze und legen Sie sie in der dritten Schale an einer abgewinkelten Position. Sichern Sie es mit Klebeband. HINWEIS: Für Ratten wurde Anstelle des Myozytenperfusionspuffers Lösung A (Tabelle 2) verwendet.</li>
	<li>Bereiten Sie einen lockeren Knoten mit einer chirurgischen Naht vor und legen Sie ihn um die Nadel.</li>
	<li>Injizieren Sie die Maus mit Heparin (100 USP-Einheiten/Maus) durch intraperitoneale Injektion, 20 min vor der Anästhesie-Injektion.</li>
	<li>Zirkulieren Sie den Myozytenperfusionspuffer (Tabelle 1) durch das Perfusionsgerät. Verringern Sie den Durchfluss auf 3 ml/min. HINWEIS: Für Ratten wurde Anstelle des Myozytenperfusionspuffers Lösung A (Tabelle 2) verwendet.</li>
	<li>Ersetzen Sie nach 5 min den Perfusionspuffer durch die Enzymlösung (Tabelle 1). Sättigen Sie die Enzymlösung während des Prozesses mit Sauerstoff. Verwenden Sie eine Durchflussmenge von 3 ml/min. HINWEIS: Verwenden Sie für die Isolierung von Ratten-CM stattdessen Lösung E (Tabelle 2).</li>
	<li>Anästhesisieren Sie die Maus durch intraperitoneale Injektion von Anästhesie. Verwenden Sie die von der IACUC empfohlene dosis Anästhesie für die Terminalchirurgie.</li>
	<li>Bestätigen Sie ausreichende Tiefe der Anästhesie durch das Fehlen einer Antwort auf eine Zehenklemme. Legen Sie dann die Maus auf die chirurgische Plattform.</li>
</ol>2. Entnahme des Herzens von erwachsenen Mäusen (und Ratten)
<ol><li>Sterilisieren Sie die Haut durch Wischen mit 70% Alkohol.</li>
	<li>Öffnen Sie vorsichtig die Brust.</li>
	<li>Verbrauchen Sie das Herz. Vermeiden Sie nicht-herzige Gewebe während der Exzision.</li>
	<li>Legen Sie das Herz auf die erste Schale, gefüllt mit Perfusionspuffer (Tabelle 1). HINWEIS: Verwenden Sie Lösung A für die Ratte (Tabelle 2).</li>
	<li>Reinigen Sie das Blut aus dem Herzen, indem Sie sanft quetschen.</li>
	<li>Übertragen Sie das Herz auf das zweite Gericht.</li>
	<li>Reinigen Sie das Blut aus dem Herzen und entfernen Sie nicht-kardiales Gewebe. Anschließend das Herz auf das dritte Gericht übertragen.</li>
	<li>Schneiden Sie Die Lunge und das andere umgebende Gewebe ab und können Sie über die aufsteigende Aorta keimen. Dieses Verfahren sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden (<5 min), um die QUALITÄT und Quantität von CM zu verbessern.</li>
</ol>3. Verdauung des Herzens
<ol><li>Verdauung des Mausherzes HINWEIS: Alle Lösungen/Puffer, die durch das Mausherz zirkulieren, sollten während des gesamten Verfahrens mit Sauerstoff versorgt werden.<ol>
<li>Entfernen Sie die Kanulationsnadel vorsichtig aus der Spritze und schließen Sie sie an das Langendorff-Perfusionsgerät an.</li>
		<li>Vermeiden Sie Luftblasen, die ins Herz gelangen, was den Durchfluss der Enzymlösung und der Verdauung beeinflussen kann.</li>
		<li>Bewegen Sie die Wasserjacke nach oben, um dem Herzen eine homogene Umgebung zu bieten. Lassen Sie die Enzymlösung mit einer Geschwindigkeit von 2-3 ml/min durch das Herz fließen. HINWEIS: Die Geschwindigkeit der Übergabelösung ist entscheidend und hat erhebliche Auswirkungen auf das Ergebnis der CM-Menge und -Qualität.</li>
		<li>Lassen Sie die Enzymlösung 2 min durch das Herz fließen.</li>
		<li>In 2 min fügen Sie der Enzymlösung 40 L von 100 M CaCl2-Lösung hinzu und mischen. Lassen Sie die Enzymlösung für weitere 10-15 min durch das Herz passieren. HINWEIS: Sobald der Fluss glatt wird, wird das Herz bräunlich und weich, was auf die gleichmäßige Verteilung des Kollagenase-Enzyms und die richtige Verdauung des Herzens hinweist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verdauung des Rattenherzens HINWEIS: Alle Lösungen/Puffer, die durch das Rattenherz zirkulieren, sollten während des gesamten Verfahrens mit Sauerstoff versorgt werden.<ol>
<li>Entfernen Sie die Kanulationsnadel vorsichtig aus der Spritze und schließen Sie sie an das Langendorff-Perfusionsgerät an.</li>
		<li>Vermeiden Sie Luftblasen, die ins Herz gelangen, was den Durchfluss der Enzymlösung und der Verdauung beeinflussen kann.</li>
		<li>Bewegen Sie die Wasserjacke nach oben, um dem Herzen eine homogene Umgebung zu bieten.</li>
		<li>Starten Sie den Fluss der Lösung A mit einer Geschwindigkeit von 2-3 ml/min für 3-5 min, um Blut aus dem Herzen zu entfernen. HINWEIS: Die Geschwindigkeit der Übergabelösung ist entscheidend und hat erhebliche Auswirkungen auf das Ergebnis der CM-Qualität.</li>
		<li>Sobald das Blut aus dem Herzen entfernt ist, wechseln Sie von Lösung A zu Lösung E (Tabelle 2). Titratlösung E mit CaCl2, wie unten angegeben, für eine Endkonzentration von 0,1 mM in Lösung:<ol>
<li>Nach 10 min Perfusion 12,5 l von 0,1 M CaCl2hinzufügen.</li>
			<li>Nach 15 min Perfusion 25 l von 0,1 M CaCl2hinzufügen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Lassen Sie die Enzymlösung für weitere 30-40 min durch das Herz gehen, bis der Fluss schnell wird und das Herz biegsam ist.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Herstellung der cm einzelligen Suspension
<ol><li>Vorbereitung der CM-Einzelzellsuspension (Maus)<ol>
<li>Entfernen Sie das Herz aus dem Langendorff-Perfusionssystem. Bewegen Sie es auf eine 60 mm Petrischale, gefüllt mit 5 ml Enzymlösung und übertragen Sie die Schale auf eine Biosicherheitshaube. HINWEIS: Stellen Sie eine ausreichende Herzverdauung sicher, bevor Sie das Herz aus dem Langendorff-Perfusionssystem entfernen. Die Verdauungszeit hängt von der Enzymaktivität, dem Lösungsfluss und der Größe des Herzens ab.</li>
		<li>Führen Sie eine weitere mechanische Disaggregation in einer Biosicherheitshaube durch, um Sterilität zu gewährleisten und Kontaminationen zu vermeiden.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die Vorhöfe (1/4des Basalherzteils) und zusätzliches Fettgewebe.</li>
		<li>Das Herz mit Dereinzange in feine Stücke zerkleinern.</li>
		<li>Nehmen Sie eine sterile Pasteur Pipette und schneiden Sie ihre Spitze in einem 45o Winkel.</li>
		<li>Verwenden Sie diese Pasteur Pipette, um das Herzgewebe in einer einzelzelligen Suspension durch sanftePipettierung zu verteilen. Die optimale Verdauung sorgt für eine Suspension von einzelligen Kardiomyozyten. HINWEIS: Entfernen Sie den schmalen unteren Teil der Transferpipette, um CM-Schäden durch mechanische Senklagerung zu reduzieren.</li>
		<li>Fügen Sie dann 5 ml Stop-Lösung hinzu, um die Enzymaktivität zu stoppen, was die Möglichkeit einer Überverdauung vermeidet.</li>
		<li>Nehmen Sie eine frische 50 ml konische und legen Sie ein steriles 100 m Zellsieb darauf.</li>
		<li>Passieren Sie die Kardiomyozytensuspension durch das Zellsieb, um den Gewebebrocken zu entfernen. Waschen Sie die Petrischale und das Sieb mit weiteren 5 ml Stop-Lösung (Tabelle 1), um alle Kardiomyozyten zu sammeln, die am Sieb befestigt bleiben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung der CM einzelligen Suspension (Ratte)<ol>
<li>Entfernen Sie das Herz aus dem Langendorff-Perfusionssystem. Bewegen Sie das Herz auf eine 100 mm Petrischale gefüllt mit 5 ml Lösung A und bewegen Sie die Schale auf eine Biosicherheitshaube. HINWEIS: Stellen Sie eine ausreichende Herzverdauung sicher, bevor Sie das Herz aus dem Langendorff-Perfusionssystem entfernen. Die Verdauungszeit hängt von der Enzymaktivität, dem Lösungsfluss und der Größe des Herzens ab.</li>
		<li>Führen Sie eine weitere mechanische Disaggregation in einer Biosicherheitshaube durch, um Sterilität zu gewährleisten und Kontaminationen zu vermeiden.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die Vorhöfe (1/4 des Basalherzteils) und zusätzliches Fettgewebe.</li>
		<li>Das Herz mit Dereinzange in feine Stücke zerkleinern.</li>
		<li>Nehmen Sie eine sterile Pasteur Pipette und schneiden Sie ihre Spitze in einem 45o Winkel.</li>
		<li>Verwenden Sie diese Pasteur Pipette, um das Herzgewebe in einzelliger Suspension durch sanftePipettierung zu verteilen. Die optimale Verdauung sorgt für eine Suspension von einzelligen Kardiomyozyten. HINWEIS: Entfernen Sie den schmalen unteren Teil der Transferpipette, um CM-Schäden durch mechanische Senklagerung zu reduzieren.</li>
		<li>Fügen Sie der CM-Suspension 5 ml lösungB (Tabelle 2) hinzu und übergeben Sie die Lösung durch ein 100-m-Zellsieb, um alle verbleibenden Fett- oder anderen nicht verdauten Gewebe zu entfernen.</li>
		<li>Filtrat in einer frischen 50 ml konischen Durchstechflasche sammeln.</li>
		<li>Verwenden Sie weitere 5 ml Lösung B, um die Petrischale und alle verbleibenden CM durch das Zellsieb zu waschen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Entfernung von Nicht-CMs
<ol><li>Entfernung von Nicht-CMs aus der erwachsenen einzelzelligen Suspension (Maus)<ol>
<li>Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 20 x g für 3 min.</li>
		<li>Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 10 ml Stop-Lösung wieder aus (Tabelle 1). ANMERKUNG: Eine Erhöhung der BSA-Konzentration in der Stop-Lösung wird ihre Viskosität erhöhen und die Sedimentationsrate von Nicht-CMs reduzieren.</li>
		<li>Setzen Sie die CMs durch sanfte Umkehrung des Rohres 3-5 mal aus.</li>
		<li>In 3 min Intervallen 10 l von 100 'M CaCl2 Lösung hinzufügen und mischen. Wiederholen Sie dies dreimal.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie nach der vierten Zugabe die Kardiomyozytensuspension bei 20 x g für 3 min.</li>
		<li>Entsorgen Sie den Überstand.</li>
		<li>Resuspend CMs in vorgewärmt (37 oC), Erwachsenenmaus CM-Beschichtungsmedien (Tabelle 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entfernung von Nicht-CMs aus den erwachsenen einzelzelligen Suspensionen (Ratte)<ol>
<li>Pelletzellen bei 20 x g für 3 min bei 25 oC.</li>
		<li>Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 25 ml der Lösung B (Tabelle 2) aus.</li>
		<li>Mischen Sie die Zellen durch sanfte Umkehrung und legen Sie sie in einen Rohrständer, damit sich der CM unter der Schwerkraft absetzen kann.</li>
		<li>Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig.</li>
		<li>Setzen Sie die Zellen in frischen 25 ml der Lösung B wieder ab und titrate sie auf 1,0 mM CaCl2 durch schrittweise Zugabe von 50 l, 75 l und 100 l von 0,1 M CaCl2 in 3-5 min Intervallen. HINWEIS: In diesem Schritt könnte eine höhere BSA-Konzentration in Lösung B verwendet werden. Die Erhöhung der BSA-Konzentration in Lösung B erhöht die Viskosität und reduziert damit die Sedimentationsrate von Nicht-CMs.</li>
		<li>Pelletzellen bei 20 x g für 3 min bei 25 oC, aspirieren den Überstand, und fügen Sie das gewünschte Volumen der erwachsenen Rattenzellkultur Medien (Tabelle 4).</li>
		<li>Samen-CMs auf einer lamininbeschichteten Platte. HINWEIS: Die Vorbeschichtung von CMs auf einer nicht beschichteten Kulturplatte kann verwendet werden, um die Kontamination von Nicht-CM-Zellen zu minimieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Adult CM Beschichtung
<ol><li>Vorbeschichtung<ol>
<li>Setzen Sie die Kardiomyozyten in Kulturmedien aus.</li>
		<li>Die Zellen in eine 60 mm bzw. 100 mm Schale für Maus- bzw. Ratten-CM vorkleben.</li>
		<li>Inkubieren Sie CMs für 2 h in einem Inkubator, ergänzt mit 5%CO2 bei 37 oC.</li>
		<li>Während der Vorplatteninkubation die Zellkulturplatten mit Laminin (10 g/ml in PBS) für eine langfristige CM-Kultur beschichten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nach 2 h Vorbeschichtung cMs in einer 50 ml konischen Durchstechflasche sammeln.</li>
	<li>Sammeln Sie die Zellen aus der Schale und verkleben Sie sie in eine laminbeschichtete 24-Well-Kulturplatte für Transfektionsexperimente.</li>
	<li>Kulturzellen in einem Inkubator bei 37 oC, ergänzt um 5% mitCO2. 4-6 Stunden sind ausreichend, um die Kardiomyozyten mit der Oberfläche zu haften, und somit kann die Transfektion 6 Stunden nach der Beschichtung durchgeführt werden. HINWEIS: Das Beschichtungsmedium, das FBS enthält, wird häufig verwendet und zeigt eine bessere Kompatibilität mit Proliferationsstudien. Ein serumfreies Medium kann jedoch für Experimente verwendet werden, bei denen sekretore Faktoren analysiert werden.</li>
</ol>7. Transfektion
<ol><li>Inkubieren Sie die CMs 4-6 Stunden lang auf die mit Laminin beschichteten Zellkulturplatten.</li>
	<li>Vier Stunden nach der CM-Aussaat auf der lamininbeschichteten Platte transfekieren Zellen mit siRNAs (50 nM) mit einem Transfektionsreagenz (z.B. Lipofectamin RNAiMAX) nach dem Herstellerprotokoll.</li>
	<li>Wechseln Sie die Medien 24 Stunden nach der Transfektion und alle 24 Stunden danach für bis zu 20 Tage.</li>
	<li>Nach 20 Tagen, fix zellen mit 4% PFA in PBS für nachgelagerte Anwendungen, einschließlich Immunzytochemie für herzspezifische Marker wie Troponin, um sicherzustellen, dass lebende Kardiomyozyten erfolgreich langfristig kultiviert wurden.</li>
</ol>

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Es ist von entscheidender Bedeutung, ein Protokoll für die Isolierung der Kardiomyozyten und die langfristige Kultur für die Durchführung zellspezifischer mechanistischer Studien zu erstellen. Es gibt nur wenige Berichte über Erwachsene CM Isolation Protokolle, und noch weniger von ihnen werden für die langfristige Kultur von erwachsenen Mäusen CM15,16,17verwendet. Es wird gezeigt, dass die erwachsene Ratte CM eine höhere Tolera...

Herzkrankheiten sind eine der häufigsten Todesursachen weltweit. Fast alle Arten von Herzverletzungen führen zu einem signifikanten Verlust von erwachsenen Kardiomyozyten (CMs). Erwachsene Säugetierherzen sind nicht in der Lage, ihre Herzverletzung aufgrund der seneszenten Natur des erwachsenen CM1zu reparieren. So führt jede Beleidigung des erwachsenen Säugetierherzens zu einem dauerhaften Verlust von CMs, was zu einer verminderten Herzfunktion und Herzinsuffizienz führt. Im Gegensatz zu erwachsenen Säugetieren können kleine Tiere wie Zebrafische und Newtika ihre Herzverletzungen durch bestehende CM-Proliferation2,3,4regenerieren. Weltweit wird derzeit versucht, eine neuartige therapeutische Intervention bei Herzverletzungen sowohl durch proliferative als auch durch nicht-proliferative Ansätze zu finden. In den vergangenen Jahrzehnten wurden verschiedene Arten von genetischen Mausmodellen entwickelt, um Herzverletzungen und Reparaturen zu untersuchen. Die Verwendung von In-vivo-Tiermodellen ist jedoch nach wie vor ein teurer Ansatz mit der zusätzlichen Komplexität, um einen zellautonomen Mechanismus von Sekundäreffekten zu entschlüsseln. Außerdem sind In-vivo-Systeme eine Herausforderung, CM-spezifische Effekte einer pharmakologischen Intervention zu analysieren, die kardioprotektive Signalisierung aus dem CM induziert.
Darüber hinaus ist die langfristige Kultur der CMs für Erwachsene notwendig, um CM-Proliferationsanalysen durchzuführen. CM-Proliferationstests erfordern mindestens 4-5 Tage, damit Zellen in den Zellzyklus induziert werden und danach genaue Daten erhalten. Darüber hinaus sind Studien, die isolierte CMs für elektrophysiologische Studien, Arzneimittelscreening, Toxizitätsstudien und Ca++ Homöostasestudien nutzen, alle eines verbesserten Kultursystems5,6,7erforderlich. Darüber hinaus zeigen neuere Studien die kardioprotektive Bedeutung von Zytokinen, die von CMs (Kardiokinen)8,9abgesondert werden. Um die therapeutische Rolle und den molekularen Mechanismus dieser Kardiokine während der Herzreparatur und Regeneration zu untersuchen, ist eine längere Kultur erforderlich.
Erwachsene Ratten-CMs sind robust genug für einzellige Isolation und Langzeitkultur in einem In-vitro-System10,11,12. Erwachsene Maus-CMs sind jedoch von großem Interesse für In-vitro-Assays, da eine Vielzahl von genetisch veränderten Mausmodellen verfügbar ist, die die Entwicklung und Durchführung verschiedener innovativer Analysen ermöglichen, die mit Ratte CM13nicht möglich sind. Im Gegensatz zur CM-Isolation von erwachsenen Ratten ist es eine ziemliche Herausforderung, eine einzellige Suspension von erwachsenen Mausherzen zu erhalten, und die langfristige Kultur der erwachsenen Maus-CMs in der Kultur ist noch schwieriger.
Adult CM Isolation von Maus- und Rattenherzen mit einem Langendorff-System wurde bereits eingerichtet, um CM-Funktion5,14,15zu studieren. Hier haben wir ausführlich die Protokolle für die CM-Isolierung von Erwachsenen von Ratten und Mäusen sowie eine modifizierte Langzeitkultur, Transfektion und CM-Proliferation isolierter Zellen beschrieben.

<table><tbody><tr><td>2,3-Butan-Dion-Monoxim</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0753</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>APExBIO</td><td>B1387</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturplatte</td><td>Corning Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Zellsieb</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Cel-miR-67</td><td>Dharmacon</td><td>CN-001000-01-50</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ2</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Messpipetten</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Wägeschalen aus Polystyrol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z154881-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified EagleThermo</td><td>Scientific</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>EdU</td><td>Life Technologies</td><td>C10337</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Corning</td><td>35-015-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hochpräzisionszange mit feinem Punkt</td><td>Fisherbrand</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-5400</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>PSLAB-018285-02</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Hochpräzise gerade breite Pinzette / Pinzette mit starker Spitze</td><td>Fisherbrand</td><td>12-000-128</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8281</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>Lichtmikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Life Technologies</td><td>13778-150</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Natürliches Maus-Laminin-Invitrogen</td><td></td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Henry Schein</td><td>24352</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Protease XIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147-1G</td><td></td></tr><tr><td>Selen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229865+5G</td><td></td></tr><tr><td>siMeis2</td><td>Dharmacon</td><td>s161030</td><td></td></tr><tr><td>siRb1</td><td>Dharmacon</td><td>s128325</td><td></td></tr><tr><td>Gerade stumpfe/scharfe Präparierschere</td><td>Fisher Scientific</td><td>28252</td><td></td></tr><tr><td>Gerade sehr feine Präzisionszange</td><td>Fisherbrand</td><td>16-100-120</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8158-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Ultraglatte, abgeschrägte Schere</td><td>Fisherbrand</td><td>22-079-747</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Fisher Scientific</td><td>3006S</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, transfektion und langzeitkultur von erwachsenenmaus und rattenkardiomyozyten

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Die Ex-vivo-Kultur der adulten Säugetierkardiomyozyten (CMs) stellt das relevanteste experimentelle System für die In-vitro-Studie der Herzbiologie dar. Adult mammalian CMs sind endlos differenzierte Zellen mit minimaler proliferativer Kapazität. Der post-mitotische Zustand von CMs für Erwachsene schränkt nicht nur die Progression des Kardiomyozytenzellzyklus ein, sondern auch die effiziente Kultur von CMs. Darüber hinaus ist die langfristige Kultur von CMs für Erwachsene für viele Studien notwendig, wie z. B. cm-Proliferation und Analyse der Genexpression.
Die Maus und die Ratte sind die beiden am häufigsten bevorzugten Labortiere, die für die Kardiomyozytenisolation verwendet werden. Während die langfristige Kultur der Ratten-CMs möglich ist, sind erwachsene Maus-CMs todesanfällig und dürfen unter normalen Bedingungen nicht länger als fünf Tage kultiviert werden. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die Zellisolation und das Langzeitkulturprotokoll für erwachsene murine CMs zu optimieren. Mit diesem modifizierten Protokoll ist es möglich, sowohl adulte Maus- als auch Ratten-CMs für mehr als 20 Tage erfolgreich zu isolieren und zu kultiieren. Darüber hinaus ist die siRNA-Transfektionseffizienz isolierter CM im Vergleich zu früheren Berichten deutlich erhöht. Für die CM-Isolierung der Erwachsenenmaus wird die Langendorff-Perfusionsmethode mit einer optimalen Enzymlösung und ausreichend Zeit für eine vollständige extrazelluläre Matrixdissoziation genutzt. Um reine ventrikuläre CMs zu erhalten, wurden beide Vorhöfe seziert und verworfen, bevor die Disassoziation und Beschichtung fortgesetzt wurden. Die Zellen wurden auf einer lamininbeschichteten Platte verteilt, was eine effiziente und schnelle Befestigung ermöglichte. CMs durften sich mit 4-6 h vor der siRNA-Transfektion begnügen. Kulturmedien wurden alle 24 Stunden für 20 Tage aufgefrischt, und anschließend wurden CMs für herzspezifische Marker wie Troponin und Marker des Zellzyklus wie KI67 fixiert und befleckt.

Das aktuelle modifizierte Protokoll ermöglicht eine effiziente Isolierung und Kultur von Ratten- und Mäuse-CMs in vitro. Zur Isolierung der Ratte CM wurden insgesamt 3 erwachsene (12 Wochen alte) männliche Fischer 344 Ratten in das Verfahren eingebracht. Abbildung 1 zeigt die chirurgischen Apparate und Isolationseinrichtungen, die im Verfahren erforderlich sind; jedes Teil wurde in der Abbildungslegende markiert und beschrieben. Kollagenase Typ 2 wurde für die Verdauung verwendet, was eine h...

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolation, Transfektion und Langzeitkultur von erwachsenen Maus- und Rattenkardiomyozyten vor.

Isolation, Transfektion und Langzeitkultur von Erwachsenenmaus und Rattenkardiomyozyten

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Das Ziel dieses Videos ist es, ein standardisiertes Protokoll für Erwachsene Kardiomyozyten Isolation, Langfristige Kultur und Transfektion zu demonstrieren. Die Isolierung und Kultivierung von Kardiomyozyten aus der Maus oder Ratte ist nach wie vor eine wesentliche Methode, um die zellautonome Biologie von Kardiomyozyten im gesunden und krankheitskranken Herzen zu untersuchen. Es gibt mehrere Fragen, die wir mit isolierten Kardiomyozyten beantworten können.Wie das proliferative Potenzial. Es gibt Genexpressionsänderungen oder spezifische Zytokinausdrücke bei Verletzungsreaktion. Leider überleben Maus-Kardiomyozyten nicht nach einer Woche unter normalen Kulturbedingungen.Daher beschreiben wir in diesem Video eine optimierte Methode, um erwachsene Maus-Kardiomyozyten zu isolieren, sie zu transfixieren und weit über 21 Tage hinaus zu kultivieren, diese Technik ist zunächst schwer zu beherrschen. Aber mit der Praxis kann man etwa 80 bis 90% überleben in Kardiomyozyten nach Isolation und etwa eine 100-prozentige Transfektionseffizienz erreichen. Und die meisten dieser Kardiomyozyten unter korrekten Bedingungen können die letzten 20 Tage überleben.Reinigen und sterilisieren Sie Ihre chi

isolation-transfection-long-term-culture-adult-mouse-rat

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Papier haben wir beschrieben, eine typische Art und Weise zu isolieren und Kultur erwachsenen Ratte Herz Myozyten. Collagenase und Protease werden verwendet, um zu verdauen und zu isolieren einzelnen Myozyten. Myozyten kultivierten folgen Sie diesem Protokoll erfüllen die meisten Anforderungen Experiment.

Primäre Kultur der erwachsenen Ratte Herz Myozyten

Adult Herzmuskelzellen sind primäre Zellen, die aus tierischen Herzen isoliert und kultiviert für mehrere Tage. Innerhalb dieses Zeitraums Kultur adenoviralen Gentransfer können verwendet werden, um genetisch kodierte Biosensoren (GEBS) oder fluoreszierende Fusionsproteine ​​zu exprimieren. Beide Ansätze erlauben zellulären Untersuchungen mittels der konfokalen Mikroskopie.

Isolation und genetische Manipulation von Adult Herzmuskelzellen für konfokale Imaging

Primäre Maus-Kardiomyozyten-Kulturen sind eines der zentralen Werkzeuge für die Untersuchung von myofibrillären Organisation und Funktion. Das folgende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von primären Kardiomyozyten aus neonatalen Mäuseherzen. Die resultierenden Kulturen Kardiomyozyten können anschließend für eine Vielzahl von biomechanischen, biochemischen und zellbiologischen Assays verwendet werden.

Isolation und Kultur der Neugeborenen-Maus-Kardiomyozyten

Hier beschreiben wir die Isolierung von adulten Maus cardiomyoctyes mit einem Langendorff-Perfusion-System. Die resultierenden Zellen sind Ca2 +-tolerant, elektrisch Ruhe und kultiviert und mit Adeno-oder Lentiviren, um die Genexpression zu manipulieren transfiziert werden. Ihre Funktionalität kann auch mit dem MMSYS System und Patch-Clamp-Techniken analysiert werden.

Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung der erwachsenen Maus Cardiomyoctyes

Wir beschreiben eine zuverlässige Methode zur Isolierung von adulten Herzmuskelzellen der Maus. Dieses Protokoll liefert ein konsistentes Ergebnis für die Kultur von funktionellen adulten Kardiomyozyten aus einer Vielzahl von gentechnisch veränderten Mäusen.

Isolation und Kultur der erwachsenen Maus Kardiomyozyten für Cell Signaling und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Herzhypertrophie

Dieses Protokoll beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode für die reproduzierbare Isolierung und Langzeitkultur von adulten Maus-Kardiomyozyten mit hoher Ausbeute, Reinheit und Lebensfähigkeit.

Isolierung, Kultur und Transduction von erwachsenen Maus Kardiomyozyten

Mehrere Protokolle wurden entwickelt und beschrieben für die Isolierung von verschiedenen Herzzelltypen von einem Rattenherz. Hier wird ein optimiertes Protokoll beschrieben, das die Isolierung von hochwertigen Hauptkardiometertypen (Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten) aus einer einzigen Präparation ermöglicht, wodurch die experimentellen Kosten reduziert werden.

Gleichzeitige Isolierung von hochwertigen Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten aus einem erwachsenen Rattenherz

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von Erwachsenen Ratte ventrikuläre Kardiomyozyten (ARVC). Isolierte ARVC kann für kurz- und langfristige Anbau verwendet werden. Die Isolierung und Kultivierung ARVC können eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung von neuen Behandlungsschemata für kardiale Erkrankungen spielen.

Isolierung und Kultivierung von Erwachsenen Ratte Kardiomyozyten

Eine Methode wird beschrieben, um Myozyten und Nicht-Myozyten gleichzeitig von den Vorhöfen und Ventrikeln eines einzelnen erwachsenen Mausherzens zu isolieren. Dieses Protokoll führt zu konsistenten Erträgen von hochlebensfähigen Herzmyozyten und Nicht-Myozyten und beschreibt optimale zellspezifische Kulturbedingungen für Phänotypisierung und In-vitro-Analyse.

Gleichzeitige Isolierung und Kultur von Atrial Myozyten, ventrikulären Myozyten und Nicht-Myozyten aus einem erwachsenen Mausherz

Der Goldstandard in der Kardiologie für zelluläre und molekulare Funktionsexperimente sind Kardiomyozyten. Dieser Artikel beschreibt Anpassungen an die Nicht-Langendorff-Technik zur Isolierung von Maus-Kardiomyozyten.

Eine einfache und effektive Methode zur konsistenten Isolierung von Maus-Kardiomyozyten

Lernen Sie die optimierte Isolation, Transfektion und Langzeitkultur adulter Maus- und Rattenkardiomyozyten mit RNAiMAX. Diese Methode ermöglicht über 20 Tage Kultur mit hoher Überlebensrate für kardiale Forschung.

Isolation, Transfektion und Langzeitkultur von Erwachsenenmaus und Rattenkardiomyozyten

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