Name: Isolation und tierisches Serum Freie Expansion der menschlichen Nabelschnur Derived mesenchymale Stromazellen (MSCs) und Endothelial Colony Forming Progenitorzellen (ECFCs) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-08T16:03:00.000+00:00
Duration: 16 min 4 s
Description: Lernen Sie die Isolation und serumfreie Expansion von ECFCs und MSCs aus menschlichen Nabelschnüren. Diese Methode ermöglicht die Gewinnung autologer Zellpaare für Transplantationsstudien in der regenerativen Medizin.

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Die Autoren bedanken sich Katharina Schallmoser für die Bereitstellung PHPL, Eva Rohde und Nicole Hofmann für hilfreiche Kommentare zum Manuskript, Daniela Thaler und Margaretha Fr hwirth für die technische Unterstützung, Monica Farrell für die sprachliche Bearbeitung, Uwe Lang, Margit Holzapfel und Sandra Eppich am Institut für Geburtshilfe für die Bereitstellung der Leitungen. Diese Arbeit wurde von der Austrian Research Foundation (FWF, gewähren N211-NAN zu DS), der Österreichischen Forschungsförderungsgesellschaft (FFG, gewähren N200 zum DS) und The Adult Stem Cell Research Foundation (AR) unterstützt worden. AR ist ein Fellow des PhD-Programm Molecular Medicine der Medizinischen Universität Graz.

Teil 1: Einrichten 1. Vorbereitung von Zellkulturmedium Vor dem Start des Mediums Vorbereitung sammeln alle Materialien und Werkzeuge, die Sie benötigen. Thaw 2 x 56 ml Aliquots von gepoolten menschlichen Thrombozyten-Lysat (PHPL, self-made: Referenz 1 &amp; JoVE # 1523), 10 ml einer 100x Penicillin / Streptomycin-Lösung, 2 x 5 ml L-Glutamin (beide Sigma). Auftauen Zytokin-und Wachstumsfaktor Aliquots (VEGF, bFGF, EGF, IGF, Hydrocortison, Ascorbinsäure, Heparin, Amphotericin als &quot;einzigen quots &#39;versehen) zur Ergänzung 1 Flasche (500 ml) von EGM-2 Medium (Lonza) eingestellt. Aus dem Kühlschrank nehmen Sie eine 500 ml Flasche jeweils (i) alpha-modifizierte minimal essential medium (a-MEM) und (ii) endothelial Basalmedium (EBM). Alle folgenden Schritte werden in einer laminaren Strömung Gewebekultur Haube unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Bereiten Sie frei von Konservierungsmitteln Heparin (zB Biochrom) durch Auflösen des Pulvers zu einer endgültigen Konzentration von 1000 IU / mL mit sterilem Wasser. MSC-Medium: Verwenden Sie 500 ml a-MEM, fügen Sie 56 ml des aufgetauten PHPL (siehe auch Hinweis 1 für weitere Details) und 2 IU / mL (= 224 ul der Stammlösung) der frei von Konservierungsmitteln Heparin (verhindert Koagulation des Mediums durch Verklumpung der das Fibrinogen im Plasma), um eine endgültige Konzentration von 10% PHPL. Zusätzlich fügen Penicillin (100U/mL) / Streptomycin (100μg/mL)-Lösung und 2 mM L-Glutamin (beide Sigma). Filter das Medium, durch ein 20 um-Porengröße Vakuum-Filter (Millipore). Beschriften Sie die Flasche entsprechend (Inhalt, Datum). ECFC-Medium: Verwenden Sie eine Flasche (500 ml) von EBM, fügen Sie die Zytokin-Aliquots, 56 ml PHPL, 10 IU / ml (= 1120μl Stammlösung) der frei von Konservierungsmitteln Heparin, Penicillin (100U/mL) / Streptomycin (100 g / ml)-Lösung und 2 mM L-Glutamin, die Basalmedium und Filter mit 20 ul-Porengröße Vakuum-Filter (Millipore). Beschriften Sie die Flasche entsprechend (Inhalt, Datum). 2. Sterilisation von chirurgischen Instrumenten Pinzetten, scharfen Paar der chirurgischen Schere und Skalpell Inhaber muss Hitze sterilisiert Erz sterile Einmalprodukte werden. 3. Vorbereitung von Rohren für Kabel-Sammlung Add 500 IU Konservierungsmittel - free Heparin auf 50 ml Polypropylen-Röhrchen (Falcon) und passen Sie auf ein Endvolumen von 20 mL mit PBS. Übertragen Sie die Rohre in den Kreißsaal. 4. Informed Consent (bestätigt durch Ihren örtlichen Ethikkommission oder IRB). Bitten Sie die Eltern vor der Auslieferung, wenn sie möchten ein Stück von der Schnur zu spenden und angemessen informieren sie über den Zweck es dienen soll. 5. Cord Spende Nach der Lieferung und Kontrolle der Plazenta und Schnur schnitt ein 10 cm Stück und sofort übertragen, um Ihre Rohr mit Heparin vorgefüllte zu einer Koagulation des Blutes im übrigen die Schnur Gefäße zu vermeiden. Fahren Sie mit Zellisolation so schnell wie möglich. Teil 2: Zellisolierung <ol><li> Bereiten Laminar-Flow-Gewebekultur Haube von Oberflächen mit Incidin oder 70% EtOH. Legen Sie sterile 150 cm 2 Zellkultur-Platten, 75 cm Zellkulturflaschen (beide Corning), PBS, sterilisiert chirurgische Instrumente, Zell-Schaber, Rohrhalter, 25 mL stripettes und 5 ml Spritzen mit stumpfen Ende Nadeln entsprechend in Ihrem gereinigt Kapuze ausgestattet. </li><li> Pre-warm Ihre vorbereiteten α-MEM und EGM-2 Zellkulturmedium auf 37 ° C in einem Wasserbad. </li><li> Bringen Sie das Kabel aus dem Kreißsaal in Ihrem Labor mit der Zellkultur Kapuze ausgestattet. Nach dem Übertragen der Schnur in der laminaren Strömung waschen Sie es zweimal in PBS (durch die Übertragung auf eine neue Platte) loswerden kontaminierender Blutzellen. Spülen Sie die Nabelvene nach canulating es auf der einen Seite mit einer sterilen 5 ml Spritze mit einer stumpfen Ende Nadel mit PBS, bis die Flüssigkeit aus dem anderen Ende des Kabels ausgestattet wird komplett transparent (rötlich zeigt Kontamination mit Blut). </li></ol> ECFCs: <ol start="4"><li> Bereiten Sie eine 75 cm 2-Kolben (Corning), beschriften Sie sie und füllen Sie in 15-20 ml vorgewärmten EGM-2 Medium. </li><li> Stecken Sie das Kabel in eine neue Platte mit sterilem PBS gefüllt. Nehmen Sie die chirurgische Schere und schnitt die Nabelschnur in zwei Stücke von ca. 5 cm in der Länge (kurze Stücke sind leichter zu verarbeiten, weil die Nabelgefässe entlang ihrer Achse verdreht sind). </li><li> Versuchen Sie, die Nabelvene (großes Schiff) finden, legen Sie ein Blatt des chirurgischen Schere und schnitt die Vene in Längsrichtung. An diesem Punkt könnte es hilfreich sein, wenn ein Assistent die bereits aufgeschnittenen Vene mit zwei Zangen halten können, während Sie weiter zu senken. </li><li> Stecken Sie das Kabel piece mit der aufgeschnittenen Vene in eine neue Platte ohne PBS, nehmen Sie die Zellschaber und kratzen der inneren (Endothelzellen) Oberfläche der Nabelschnur durch Abreibungen von einem Ende zum anderen. Übertragen Sie die Zellen, um Ihre vorbereiteten Kolben durch die Reinigung der Spitze des Kratzers in das Medium. Wiederholen Sie diese Prozedur mindestens 10 mal. </li><li> Schließen Sie die Flasche und steckte es in einen Inkubator (37 ° C, 5% CO 2, 95% Luftfeuchtigkeit). </li></ol> MSCs: <ol start="4"><li> Bereiten Sie eine 150 cm 2 Kultur (Corning) und beschriften Sie sie. </li><li> Nehmen Sie das Stück Schnur (nach Abschaben der Endothelschicht) und schneiden das ganze Kabel in sehr kleine Stücke mit einer sterilen Schere und sterilen Skalpell. Maximale Größe des Kabels Stücke sollten 1-2 mm sein. </li><li> Übertragen Sie Ihre Schnur Stücke mit der sterilen Pinzette in das pre-markierten Kultur Platte. Indem Sie die Platte für 5 Minuten vor dem Befüllen mit Medium öffnen, wird die Anlage der Stücke auf der Kunststoffoberfläche gestärkt. </li><li> Sobald die Schnur Stücke angemessen auf die Kunststoff verbunden sind, sanft in 30-35 ml vorgewärmten alpha geändert MEM hinzuzufügen. Versuchen Sie, die niedrigste Geschwindigkeit nutzen, um sicherzustellen, dass alle Stücke verbunden bleiben. </li><li> Schließen Sie die Platte und lege sie in einen Inkubator (37 ° C, 5% CO 2, 95% Luftfeuchtigkeit). </li></ol> Teil 3: Cell Expansion und Bestätigung der Immun-Phänotyp mittels Durchflusszytometrie Zell-Expansion EFCFs: <ol><li> Überprüfen Sie die Befestigung der Endothelzellen am nächsten Tag auf einem inversen Mikroskop und Austausch ganze EGM-2 Medium, um loszuwerden, alle nicht-anhaftenden Zellen und Partikeln. </li><li> Erweitern Sie die Zellen bis zur Mündung und zum Austausch ein Drittel des Mediums zweimal pro Woche. Wenn Konfluenz erreicht ist, lösen die Zellen mit 0,05% Trypsin/0.7 mM EDTA und sie auf neue Kulturgefäße. Abhängig von der Anzahl der Zellen innerhalb Ihres T75 Kolben, sollten Sie die Größe und Anzahl der neuen Flaschen zu niedrigen Aussaatdichte für die weitere Expansion zu gewährleisten. </li><li> Börse ein Drittel des Mediums zweimal in der Woche während der Expansion der Zellen. </li></ol> MSCs: <ol><li> Der Auswuchs von MSCs aus der Nabelschnur wird länger dauern, so können Sie warten mindestens 3-4 Tage, bis Sie überprüfen, auf einem inversen Mikroskop für das Auftreten von spindelförmigen Zellen in der Umgebung des angeschlossenen Gewebestücke. Wenn es genügend Zellen aus-Wachstum, neigen die Stücke zu trennen, weil sie Kontakt mit dem Kunststoff zu verlieren. </li><li> Nach 10-12 Tagen entfernen Sie die Gewebestücke, nehmen Sie den MSCs aus dem Kunststoff mit 0,05% Trypsin/0.7 mM EDTA und sie auf neue Kulturgefäße. Je nach der Menge der Zellen in Ihrem Teller sollten Sie die Größe und Anzahl der neuen Flaschen entscheiden, niedrige Aussaatdichte für die weitere Expansion zu gewährleisten. </li><li> Börse ein Drittel des Mediums zweimal in der Woche während der Expansion der Zellen. </li></ol> Durchflusszytometrie Benötigte Ausrüstung: Durchflusszytometer (BD FACSCalibur), Micronic Röhrchen (Corning), Rohrhalter, Schaf-Serum (Blockierungsreagenz), Eppifuge (Eppendorf), monoklonale Antikörper MSCs: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD73, CD90, CD105, Isotypkontrollen ECFCs: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD34, CD90, CD105, CD144, CD146, Isotypkontrollen <ol><li> Nach Erreichen der Konfluenz, trennen Sie die Zelle mit 0,05% Trypsin/0.7 mM EDTA und Zentrifuge bei 300g für 7 min bei 4 ° C. </li><li> Resuspendieren der Zellen in einer Konzentration von 1x10 6 Zellen / ml in modifizierter PBS und blockieren unspezifische Bindung des Antikörpers mit 10% v / v Schafserum für 20 min bei 4 ° C. </li><li> Beschriften Sie die Micronic Röhrchen und fügen Sie die entsprechende Konzentration der fluoreszenzmarkierten Antikörpern. </li><li> Dann werden 50 ul Zellsuspension (gesperrt) in jedes Röhrchen pipettieren und 30 min bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von modifizierten PBS, um nicht-bindende Antikörper zu entfernen. </li><li> Gehen Sie mit Ihrem markierten Zelle auf die Durchflusszytometer und führen Sie die Analyse. </li></ol> Teil 4: ECFC Koloniewachstum, Fixierung, Färbung und Hierarchie-Analyse <ol><li> Seed das praktisch reine geerntet ECFCs bei sehr niedrigen Plattierungsdichte von 3 oder 10 Zellen pro Quadratzentimeter in Zellkultur-Platten für einzelne Kolonie Wachstum zu ermöglichen. </li><li> Börse ein Drittel des Mediums zweimal pro Woche. </li><li> Nach 14 Tagen (Ende der Kultur) zu entfernen Medium, zweimal waschen mit PBS und fixieren den Kolonien mit eiskaltem Fixierung Lösung (Aceton: Methanol = 3: 2) für 15 Minuten in den Kühlschrank stellen. </li><li> Entsorgen Sie die Fixierung Lösung und lassen die Platten offen für 10 Minuten trocknen lassen. </li><li> Rehydrieren die Zellen mit destilliertem Wasser für 10 Minuten. </li><li> Add Harris Hämatoxylin-Lösung und färben die feste Kolonien für 12 Minuten. </li><li> Entfernen H matoxylin und spülen Sie die Platten mit Leitungswasser, um loszuwerden, die restlichen Färbelösung. </li><li> Machen Sie Fotos von jeder Kolonie vonmit einem Stereomikroskop und Import *. jpg oder *. tif-Format-Dateien auf Ihrem Computer. </li><li> Öffnen Sie die Fotos mit ImageJ-Software und zu analysieren, die genaue Zellzahl jeder Kolonie wie in der Animation beschrieben. </li><li> Öffnen Sie die ImageJ-Software und importieren Sie eine Kolonie Bild mit dem &quot;File \ Open&quot;-Funktion in dem Pulldown-Menü. </li><li> Fahren Sie mit dem &quot;Process \ Subtract Background&quot;-Funktion </li><li> Verwenden Sie die &#39;* * elliptische oder Pinsel Auswahl &quot;-Funktion in der ImageJ Menü, um die Kolonie-Marge zu markieren. </li><li> Deaktivieren Sie das umgebende Bild mit dem &quot;Bearbeiten \ Klare Outside&quot;-Funktion und beschneiden Sie das Bild, indem Sie &#39;Bild \ Crop&#39;. </li><li> Stellen Sie die Schwelle manuell mit Hilfe der &#39;Bild \ Stellen \ Threshold &quot;-Funktion, so dass alle Zellen vollständig sind rot gefärbt. </li><li> Zählen Sie die Zellzahl der Kolonie, indem Sie &#39;Analyze \ Analyze Particles &quot;. Wählen Sie die entsprechenden Einstellungen (optimiert für jeden Zelltyp) und wählen Sie &#39;OK&#39;. Die Ergebnisse Box, einschließlich Zellzahl und ein neues Bild mit den entsprechenden Konturen der gezählten Zellen erscheint. <img src="/files/ftp_upload/1525/1525op2.jpg" alt="Abbildung 1" /></li></ol>

<ol><li>Schallmoser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+lysate+can+replace+fetal+bovine+serum+for+clinical-scale+expansion+of+functional+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells.</a> Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).</li>
<li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+system+to+propagate+cord+blood-derived+multipotent+mesenchymal+stromal+cells+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application.</a> Regen Med. 2, 371-382 (2007).</li>
<li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+large-scale+expanded+endothelial+colony-forming+cells+function+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo.</a> Blood. 113, 6716-6725 (2009).</li>
<li>Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+and+preclinical+production+of+human+lineage-negative+cells+for+regenerative+stem+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization and preclinical production of human lineage-negative cells for regenerative stem cell therapy.</a> Transfusion. 45, 315-326 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine finanziellen Interessenkonflikte zu erklären.

Es gibt eine Vielzahl von Quellen, aus denen MSCs oder ECFCs einschließlich Knochenmark, Fettgewebe, Nabelschnurblut, etc. zu bekommen, um Es ist notwendig, um beide Arten von Vorläuferzellen aus der gleichen Quelle direkt miteinander zu vergleichen die Beteiligung der verschiedenen Zelltypen in Prozesse wie Gewebe-und Gefäß Regeneration oder Beitrag zur Tumorprogression. Die Leichtigkeit, mit der zu isolieren und anschließend studieren autologen Paare ECFCs und ...

<table><tbody><tr><td>alpha modifiziertes MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EBM</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Einzige Zytokin-Zusätze</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Flaschen</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>150 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Platten</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellabstreifer</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoklonale Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50-ml-Röhrchen</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>500-mL-Filter mit 20 &amp;mu;m Porengröße</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heberin ohne Konservierungsstoffe</td><td>Biochrom AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation und tierisches serum freie expansion der menschlichen nabelschnur derived mesenchymale stromazellen (mscs) und endothelial colony forming progenitorzellen (ecfcs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Die Nabelschnur ist eine reiche Quelle für Stammzellen mit hoher proliferative Potenzial, einschließlich mesenchymale Stromazellen (auch als mesenchymale Stammzellen, MSCs) und Endothelzellen koloniebildenden Progenitorzellen (ECFCs). Beide Zelltypen sind wichtige Akteure bei der Aufrechterhaltung der Integrität des Gewebes und sind wahrscheinlich auch in regenerative Prozesse und Tumorbildung beteiligt. Zur Untersuchung ihrer Biologie und Funktion in einer vergleichenden Weise ist es wichtig, beide Zelltypen Verfügung vom gleichen Spender haben. Es kann auch nützlich sein für regenerative Zwecke abzuleiten MSCs und ECFCs aus dem gleichen Gewebe. Da zelluläre Therapeutika schließlich finden sollten ihren Weg vom Labor zum Krankenbett haben wir eine neue Methode zur Isolierung und weiter ausbauen Vorläuferzellen ohne die Verwendung von tierischem Eiweiß. Pooled menschlichen Thrombozyten-Lysat (PHPL) ersetzt Rinderfötenserum in alle Schritte unseres Protokolls vollständig vermeiden Sie den Kontakt der Zellen an xenogenen Proteinen. Dieses Video zeigt eine Methodik für die Isolierung und Expansion von Vorläuferzellen aus einer Nabelschnur. Alle Materialien und Verfahren beschrieben werden.

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und anschließende Expansion von mesenchymalen Stromazellen und Endothelzellen Kolonie-bildenden Zellen, ohne die Verwendung von tierischen Serum autologen Paare für experimentelle Zwecke der Transplantation zu generieren.

Isolation und tierisches Serum Freie Expansion der menschlichen Nabelschnur Derived mesenchymale Stromazellen (MSCs) und Endothelial Colony Forming Progenitorzellen (ECFCs)

Die Nabelschnur ist eine reichhaltige Quelle für Progenitorzellen mit hohem proliferativem Potenzial, einschließlich mesenchymaler Stromazellen (auch bezeichnet als mesenchymale ...

Die menschliche Nabelschnur ist eine leicht zugängliche Quelle für Vorläuferzellen. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung und anschließenden Expansion von endothelialen Vorläuferzellen (EPCs), einer Teilpopulation von Zellen in der Gefäßwand, sowie mesenchymaler Vorläuferzellen (MSCs), die aus einer einzelnen menschlichen Nabelschnur gewonnen werden.Schneiden Sie zunächst mit einer Schere längs entlang der menschlichen Nabelvene und kratzen Sie die Zellen von der inneren Gefäßoberfläche ab. Überführen Sie die abgekratzten Zellen vom Spatel in eine Zellkulturflasche und warten Sie auf das Auswachsen von Kolonien. Einige der abgekratzten Zellen weisen ein Vorläufer-Phänotyp auf und proliferieren stark, wodurch sich große Kolonien bilden.Nachdem sich diese Zellen vermehrt haben, können die eCFCs in neuen Kolben erweitert werden. Für weitere Analysen kann eine mesenchymale Zellpopulation auch aus der menschlichen Nabelschnur isoliert werden. Schneiden Sie Teile der Schnur in kleine Stücke und überführen Sie sie in eine sterile Kulturschale.Nach einigen Tagen ist das Auswachsen der stromalen Zellen um die Gewebestücke des Interwirbelschnurs herum sichtbar. Überführen Sie diese Zellen in neue Kolben und vermehren Sie sie für weitere Analysen. Dieses Protokoll ermöglicht es Ihnen, innerhalb von drei bis vier Wochen zwei Arten von Vorläuferzell-Linien aus einem einzigen Ausgangsmaterial, dem Schnurmaterial, zu gewinnen.Hallo, ich bin Andreas Danish aus dem Labor von Dr. T. Strong in einer Einheit für Stammzellforschung an der Medizinischen Universität von Grads in Österreich. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Isolierung, Expansion und Analyse menschlicher mesenchymaler und endothelialer Stammzellen aus einer Nabelschnur. Nur ein Hinweis zur Terminologie.Unsere Zellen werden als multipotente mesenchymale Stromazellen oder MSEs und endotheliale koloniebildende Progenitorzellen oder eCSCs bezeichnet. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Funktion und Biologie nicht-hämatischer Vorläuferzellen zu untersuchen. Beginnen wir also.Bevor Sie mit der Zellisolierung beginnen, wischen Sie die laminare Luftströmungs-Werkbank mit Inadine ab und bereiten Sie sterile Zellkulturschalen vor. Zellkulturgefäße, chirurgische Instrumente, die mit PBS sterilisiert wurden, Zellabstreifer, einen Reagenzglashalter, 25-Milliliter-Streifenkappenröhrchen und eine 5-Milliliter-Spritze mit stumpfer Nadel bereit. Denken Sie daran, das α-MEM- und EGM-2-Zellkulturmedium im 37-Grad-Wasserbad vorzuwärmen.Überführen Sie nun die Nabelschnur in den laminaren Luftstrom und waschen Sie sie zweimal mit PBS. Um verunreinigendes Blut zu entfernen, verwenden Sie eine sterile 5-mL-Spritze, um die Nabelschnurvene auf einer Seite zu kanülieren. Spülen Sie nun die Nabelschnurvene mit PBS, bis die austretende Flüssigkeit klar ist.Das andere Ende der Nabelschnur wird vollständig transparent, ohne roten Farbton. Beginnen Sie die Isolierung endothelialer koloniebildender Vorläuferzellen, indem Sie einen 75 Quadratzentimeter-Flaschenkolben mit 15 bis 20 Milliliter vorgewärmtem EGM-2-Medium füllen. Legen Sie die Nabelschnur in eine neue Schale, die mit steriler PBS gefüllt ist, und schneiden Sie sie mit einer chirurgischen Schere in zwei etwa fünf Zentimeter lange Stücke. Setzen Sie nun eine Klinge der chirurgischen Schere ein und schneiden Sie die Vene längs auf. An diesem Punkt kann ein Assistent mit einer Pinzette die Vene festhalten, während weitere Schnitte vorgenommen werden. Legen Sie das Band mit der geöffneten Vene in eine neue Platte.Ohne PBS die innere Fläche der Vene über eine Strecke von mindestens einem Zentimeter mithilfe eines Zellkratzers abkratzen. Den Kratzer in dem EGM zwei Medium waschen, um die abgeschabten Gefäßzellen in den Kolben zu überführen. Dieser Vorgang muss bis zu 10-mal wiederholt werden.Schließen Sie den Kolben und stellen Sie ihn in einen Inkubator, der auf 37 Grad, 5 % Kohlendioxid und 95 % Luftfeuchtigkeit eingestellt ist. Nachdem nun die eCFCs isoliert wurden, fahren wir mit den MSCs fort. Nachdem die endotheliale Schicht abgeschabt wurde, schneiden Sie die Nabelschnur mit einem sterilen Skalpell in sehr kleine Stücke.Ein bis zwei Millimeter. Überführen Sie diese Stücke höchstens mit sterilen Pinzetten in eine vorab beschriftete Kulturplatte. Lassen Sie die Platte mindestens fünf Minuten lang geöffnet, bevor Sie sie mit Medium auffüllen, damit die Stücke an der Kunststoffoberfläche haften können.Unter Verwendung der niedrigstmöglichen Geschwindigkeit vorsichtig 30 bis 35 Milliliter vorgewärmtes alpha-modifiziertes MEM hinzufügen. Die Platte schließen und in einen Inkubator stellen, der auf 37 Grad mit 5 % Kohlendioxid und 95 % Luftfeuchtigkeit eingestellt ist. Das Auswachsen mesenchymaler stromaler Zellen aus den Nabelschnurstücken dauert drei bis sieben Tage, danach können die Zellen vergrößert werden.Unterdessen können ECFCs vermehrt werden, wie im nächsten Schritt gezeigt wird. Am nächsten Tag untersuchen Sie die Zellen mit einem umgekehrten Mikroskop. Wenn das Abkratzen ordnungsgemäß durchgeführt wurde, sind die ersten proliferierenden Zellverbände vollständig sichtbar.Ersetzen Sie das E GM zwei Medium, um alle nicht angehefteten Zellen und Partikel zu entfernen. Kultivieren Sie die Zellen weiter und tauschen Sie zweimal pro Woche ein Drittel des Mediums aus. Nach 10 bis 12 Tagen werden regelmäßig sehr große endotheliale Kolonien beobachtet.Entfernen Sie nun das Medium und waschen Sie mit PBS, um verbleibendes Protein zu entfernen. Verwenden Sie 0,05 % Trypsin und 0,7 Millimolar EDTA, um die Zellen abzulösen. Wenn Sie Zellen in neue Kulturgefäße überführen, achten Sie darauf, flaschenförmige Gefäße passender Größe zu wählen, um eine niedrige Aussaatdichte zu erreichen.Dies erleichtert eine weitere Ausweitung. In unserem Labor werden normalerweise Nachkommen von mehr als 20 großen Kolonien in vier 225 cm²-Flaschen überführt. Vergessen Sie nicht, zweimal wöchentlich ein Drittel des Mediums zu erneuern.Ein ähnliches Protokoll wird im nächsten Abschnitt für die Expansion von MSC verwendet. Nach drei bis sieben Tagen überprüfen Sie mithilfe eines umgekehrten Mikroskops das Auftreten spindelförmiger Zellen in der Nähe des angehefteten Gewebes. Wenn ein ausreichendes Zellauswachsen erfolgt ist, neigen die Gewebestücke dazu, sich festzuheften, während sie den Kontakt zum Kunststoff verlieren.Nach 10 bis 12 Tagen die Gewebestücke entfernen. Die MSCs mithilfe einer Trypsin-EDTA-Lösung vom Kunststoff lösen und die Zellen in neue, mit Medium vorgefüllte Kulturflaschen überführen, die in geeigneter Größe und Anzahl gewählt sind, um während der Zellvermehrung eine niedrige Aussaatdichte sicherzustellen. Sobald beide Zelltypen vermehrt wurden, ist es erforderlich, zweimal wöchentlich jeweils ein Drittel des Mediums zu erneuern.Die Färbung gefolgt von der Durchflusszytometrie kann durchgeführt werden, um die Expression von Oberflächenmarkern nachzuweisen, die auf Vorläuferphänotypen hinweisen, und um sicherzustellen, dass keine Kontamination mit hämatopoetischen Zellen vorliegt. Säen Sie die reinen geernteten eCFCs mit einer sehr geringen Ansiedledichte von drei oder 10 Zellen pro Quadratzentimeter in Zellkulturschalen aus, um das Wachstum einzelner Kolonien zu gewährleisten. Wechseln Sie nach 14 Tagen zwei Mal pro Woche jeweils ein Drittel des Mediums. Das Ende der Kultur.Entfernen Sie das Medium. Waschen Sie zweimal mit PBS und fixieren Sie die Kolonien 15 Minuten lang im Kühlschrank mit eiskalter Fixierungslösung. Entsorgen Sie die Fixierungslösung und lassen Sie die Platten 10 Minuten offen trocknen. Rehydrieren Sie die Zellen 10 Minuten lang mit destilliertem Wasser.Fügen Sie Harris-Hämatin-Lösung hinzu und färben Sie die fixierten Kolonien 12 Minuten lang. Entfernen Sie die Hämatin-Lösung und spülen Sie die Platten mit Leitungswasser ab, um die restliche Färbelösung zu entfernen.Nehmen Sie Fotos jeder Kolonie mit einem Stereomikroskop auf und importieren Sie Dateien im JPEG- oder TIFF-Format auf Ihren Computer. Öffnen Sie die Fotos mit der Image-J-Software und analysieren Sie die genaue Zellanzahl jeder Kolonie, wie in der folgenden Animation beschrieben. Öffnen Sie die Image-J-Software und importieren Sie ein Koloniebild mithilfe der Funktion „Datei öffnen“ im Dropdown-Menü.Fahren Sie mit dem Verfahren fort. Subtrahieren Sie die Hintergrundfunktion. Verwenden Sie die elliptische Auswahl- oder Pinsel-Auswahlfunktion im Bild-J-Menü, um den Kolonierand zu markieren.Löschen Sie das umgebende Bild mithilfe der Bearbeitungsfunktion „Außerhalb löschen“ und beschneiden Sie das Bild durch Auswahl von „Bild zuschneiden“. Passen Sie die Schwelle manuell über die Funktion „Bild – Schwellwert anpassen“ so an, dass alle Zellen vollständig rot eingefärbt sind. Zählen Sie die Zellanzahl der Kolonie durch Auswahl.Analysieren, analysieren Sie die Partikel. Wählen Sie geeignete Einstellungen, die für jeden Zelltyp optimiert sind, und bestätigen Sie mit „Okay“. Wenn das Verfahren korrekt durchgeführt wurde, ermöglicht dieses Protokoll die Isolierung einer nahezu reinen Zellpopulation, die die Eigenschaften menschlicher endothelialer und mesenchymaler Vorläuferzellen aufweist, welche aufgrund ihrer Herkunft aus demselben Nabelstrang autolog zueinander sind.Ab dem fünften Tag erscheinen spindelförmige mesenchymale Zellen unterhalb des am Kulturgefäß befestigten Gewebestücks. Nach ein bis zwei Tagen sind die ersten Zellhaufen von endothelialen koloniebildenden Vorläuferzellen oder eKFCs im umgekehrten Mikroskop sichtbar. Diese schnell wachsende, große Kolonie von eKFCs bildete sich nach 11 Tagen.Sowohl die MSCs als auch die E-CFCs können weitergegeben und weitervermehrt werden. Wir empfehlen, alle Kulturprodukte anschließend mittels Durchflusszytometrie zu analysieren, um das entsprechende Phänotyp zu bestätigen. Beachten Sie, dass sowohl endotheliale als auch mesenchymale Linien auf Antikörper gegen CD 73, CD 1 46, CD 29 und CD 1 0 5 reagieren.Beachten Sie, dass die MSCs Thymus-1 exprimierten, das mithilfe eines Anti-CD-90-Antikörpers nachgewiesen wurde. Die E-ZFCs sind positiv für CD-31, das auch als Plättchen-Endothelzell-Adhäsionsmolekül oder PCAM bezeichnet wird. Es ist gut dokumentiert, dass die Expression der CD-34-Immunreaktivität in E-ZFCs aus Nabelschnurblut durch wiederholte Kultur verringert werden kann.Blutzellmarker wie CD 45, H-L-A-D-R und CD 14 blieben für beide Zelltypen negativ. Die Vorläuferzellhierarchie unter den E-Zellkolonien (E CFCs) kann mithilfe der Image-J-Software durch genaue Zählung der Zellzahlen jeder einzelnen Kolonie bewertet werden. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Maces und ECEs aus einem menschlichen Nabelschnurblut isoliert, vermehrt und analysiert, wenn man dieses Verfahren durchführt.Es ist wichtig, unter sterilen Bedingungen zu arbeiten und vor der Verwendung der Zellen in nachfolgenden Studien den Phänotyp und die Reinheit zu überprüfen. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Endothelial koloniebildenden Progenitorzellen (ECFCs) sind ein viel versprechendes Instrument, um vaskuläre Homöostase und Reparatur zu studieren.

Isolation und großräumige Ausdehnung der erwachsenen Menschen Endothelial Colony Forming Progenitorzellen

Endothelial Kolonie-bildenden Zellen (ECFCs) im Umlauf Endothelzellen mit robusten klonale proliferative Potential zeigen, dass...

Phänotypische und funktionelle Charakterisierung von Endothelial Kolonie-bildenden Zellen aus humanem Nabelschnurblut

Hier beschreiben wir Verfahren zur Präparation von fetalen und mütterlichen Geweben aus menschlichen Plazenta, gefolgt von der Isolierung und Expansion von mesenchymalen Stamm- / Stromazellen (MSC) aus diesen Geweben.

Isolierung und Expansion von mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen aus humanen Placenta Gewebe gewonnen

Hier stellen wir ein Protokoll für die Präparation der menschlichen Nabelschnur (UC) und fetaler placenta Probe in Kord Belages (CL), Wharton-Sulze (WJ), Cord-Plazenta-Übergang (CPJ) und fetale Plazenta (FP) für die Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen (MSCs), um die Explantation Kultur-Technik.

Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen aus Nabelschnur und Fetal Placenta

Das Ziel dieses Protokolls ist, endotheliale Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut zu isolieren. Einige der Anwendungen sind mit diesen Zellen als Biomarker für die Identifizierung von Patienten mit Herz-Kreislauf-Risiko, Behandlung von ischämischen Erkrankungen und Erstellen von Tissue-Engineering Gefäß- und Herz-Ventil konstruiert.

Isolierung der endothelialen Vorläuferzellen aus menschlichen Nabelschnurblut

Menschlichen Nabelschnur (UC) erhalten Sie während der Perinatalperiode durch Frühgeburt, Begriff und postterm Lieferung. In diesem Protokoll beschreiben wir die Isolierung und Charakterisierung von UC-mesenchymale Stammzellen (UC-MSCs) von Föten/Säuglinge bei 19-40 Wochen der Schwangerschaft.

Isolierung und Charakterisierung der menschlichen Nabelschnur gewonnenen mesenchymalen Stammzellen aus Frühgeborenen und Kleinkindern Begriff

Dieses Protokoll bietet eine enzymfreie Methode zur Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus abdominoplastischen und lipoaspiratischen Proben mit einer Explant-Methode. Das Fehlen harter Enzyme oder Zentrifugationsschritte sieht klinisch relevante Stammzellen vor, die für Studien in vitro verwendet oder in die Klinik zurückgebracht werden können.

Eine enzymfreie Methode zur Isolierung und Expansion von humanen Adsetzen-abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen

Diese Studie stellt ein einzigartiges stumpfes Dissektionsverfahren vor, um die Integrität von Wharton-Gelee (WJ) zu erhalten, was zu weniger beschädigtem WJ und einer größeren Menge und Lebensfähigkeit der entnommenen mesenchymalen Stammzellen (MSCs) führt. Die Methode zeigt eine überlegene Ausbeute und Proliferationsfähigkeit im Vergleich zu herkömmlichen scharfen Dissektionsmethoden.

Isolierung von mesenchymalen Stammzellen aus der Nabelschnur mit hoher Ausbeute und geringer Schädigung

Die Isolierung von BAMBI-hohenMFGE8-hohen MSCs, einer der drei Hauptuntergruppen der heterogenen humanen UC-MSCs, ist hilfreich, um die Eigenschaften und Funktionen dieses Subtyps für seine zukünftige Anwendung zur Verbesserung der klinischen Wirksamkeit bei bestimmten Erkrankungen vollständig zu verstehen. Hier stellen wir eine Methode zur Sortierung von BAMBIhochMFGE8hoch UC-MSCs vor.

Isolierung von humanen mesenchymalen Stromazellen mitBAMBI-Gehalt anhohemMFGE8-Nabelschnurgehalt

Dieses Video-Protokoll zeigt die Isolierung und Kultivierung der menschlichen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC) aus humanen Nabelschnur. Nach der Isolierung dieser Zellen in vitro Angiogenese-Assays, wie die optimierte Fibringel Bead Assay auch durch die Hughes-Labor nachgewiesen werden kann, verwendet werden.

Isolierung humaner Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC)

Lernen Sie die Isolation und serumfreie Expansion von ECFCs und MSCs aus menschlichen Nabelschnüren. Diese Methode ermöglicht die Gewinnung autologer Zellpaare für Transplantationsstudien in der regenerativen Medizin.

Isolation und tierisches Serum Freie Expansion der menschlichen Nabelschnur Derived mesenchymale Stromazellen (MSCs) und Endothelial Colony Forming Progenitorzellen (ECFCs) (Video) | JoVE Journal

Isolation und tierisches Serum Freie Expansion der menschlichen Nabelschnur Derived mesenchymale Stromazellen (MSCs) und Endothelial Colony Forming Progenitorzellen (ECFCs)

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