Isolation und tierisches Serum Freie Expansion der menschlichen Nabelschnur Derived mesenchymale Stromazellen (MSCs) und Endothelial Colony Forming Progenitorzellen (ECFCs)

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und anschließende Expansion von mesenchymalen Stromazellen und Endothelzellen Kolonie-bildenden Zellen, ohne die Verwendung von tierischen Serum autologen Paare für experimentelle Zwecke der Transplantation zu generieren.

Die menschliche Nabelschnur ist eine leicht zugängliche Quelle für Vorläuferzellen. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll für die Isolierung und anschließende Expansion von endothelialen Vorläuferzellen e CFCs, einer Subpopulation von Zellen innerhalb der Gefäßwand und mesenchymalen Vorläuferzellen. MSCs, die aus einer einzigen menschlichen Nabelschnur gewonnen werden.

Zuerst schnitt man mit einer Schere in Längsrichtung entlang der menschlichen Nabelvene und kratzte die Zellen von der inneren Gefäßoberfläche ab. Übertragen Sie die Zellen aus dem Schaber in einen Kolben und warten Sie auf das Wachstum der Kolonie. Einige der abgeschabten Zellen weisen einen Vorläufer-Phänotyp auf und vermehren sich stark, um große Kolonien zu bilden.

Sobald diese Zellen vermehrt sind, können die e-FCKW in neuen Kolben expandiert werden. Für die weitere Analyse kann eine mesenchymale Zellpopulation auch aus der menschlichen Nabelschnur isoliert werden. Schneiden Sie Teile der Nabelschnur in kleine Stücke und geben Sie sie auf eine sterile Kulturplatte.

Nach einigen Tagen wird das Auswachsen der Stromazellen um die Gewebestücke des intervaskulären Rückenmarks sichtbar sein. Übertragen Sie diese Zellen in neue Kolben und erweitern Sie sie für die weitere Analyse. Dieses Protokoll ermöglicht es Ihnen, innerhalb von drei bis vier Wochen zwei Arten von Abstammungslinien von Vorläuferzellen aus einem einzigen Ausgangsmaterial zu gewinnen.

Hallo, ich bin Andreas Danish aus dem Labor von Dr.T. Strong in einer Stammzellforschungseinheit an der Medizinischen Universität in Österreich. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Isolierung, Expansion und Analyse von humanen mesenchymalen und endothelialen Kanalzellen aus einem Nabelcode. Nur eine Anmerkung zur Terminologie.

Unsere Zellen werden als multipotente, mesenchymale Stromazellen oder MSEs und endotheliale Colon bildende Pro-Zellen oder e CSCs bezeichnet. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die Funktion und Biologie von nicht-hämatischen Vorläuferzellen zu untersuchen. Also lasst uns loslegen.

Wischen Sie vor der Zellisolierung die Laminar-Flow-Gewebekulturhaube mit Inadine ab und sammeln Sie sterile Zellkulturplatten. Zellkulturflaschen, PBS-sterilisierte chirurgische Instrumente, Zellschaber, ein Röhrchenhalter, 25-Milliliter-Streifentiere und eine Fünf-Milliliter-Spritze mit einer Nadel mit stumpfem Ende. Denken Sie daran, das alpha MEM und EGM Zwei-Zell-Kulturmedium in einem 37 Grad heißen Wasserbad vorzuwärmen.

Übertragen Sie nun die Nabelschnur in die laminare Strömung und waschen Sie sie zweimal in PBS. Um kontaminierendes Blut zu entfernen, verwenden Sie eine sterile Fünf-Milliliter-Spritze, um die Nabelschnurvene auf einer Seite zu kanülieren. Spülen Sie nun die Nabelvene mit PBS aus, bis die Flüssigkeit herausfließt.

Das andere Ende des Kabels wird vollständig transparent und erhält keinen Rotstich. Beginnen Sie mit der Isolierung von Vorläuferzellen durch die Bildung einer Endothelkolonie, indem Sie einen 75 Quadratzentimeter großen Kolben mit 15 bis 20 Millilitern EGM 2-Medium füllen. Legen Sie die Nabelschnur in eine neue, mit sterilem PBS gefüllte Platte und schneiden Sie die Nabelschnur mit einer chirurgischen Schere in zwei Stücke, die jeweils etwa fünf Zentimeter lang sind.

Führen Sie nun eine Klinge der OP-Schere ein und schneiden Sie die Vene in Längsrichtung durch. Zu diesem Zeitpunkt kann ein Assistent die Vene mit einer Pinzette halten, während weitere Schnitte gemacht werden. Lege die Nabelschnur mit der offenen Vene in eine neue Platte.

Verwenden Sie ohne PBS einen Zellschaber, um die innere Oberfläche der Vene über eine Fläche von mindestens einem Zentimeter zu reiben. Waschen Sie den Schaber in der EGM two Medium, um die geriebenen Gefäßzellen in den Kolben freizusetzen. Dieser Vorgang muss bis zu 10 Mal wiederholt werden.

Schließen Sie den Kolben und stellen Sie ihn in einen Inkubator mit 37 Grad, 5 % Kohlendioxid und 95 % Luftfeuchtigkeit. Nachdem die elektrischen FCKW isoliert wurden, kommen wir nun zu den MSCs. Nachdem die Endothelschicht abgekratzt wurde, schneiden Sie die Nabelschnur mit einem sterilen Skalpell in sehr kleine Stücke.

Ein bis zwei Millimeter. Maximale Verwendung einer sterilen Pinzette, um diese Stücke in eine vorbeschriftete Kulturplatte zu überführen. Lassen Sie die Platte mindestens fünf Minuten lang offen, bevor Sie sie mit Medium füllen, damit die Stücke an der Kunststoffoberfläche haften können.

Bei möglichst niedriger Geschwindigkeit vorsichtig 30 bis 35 Milliliter vorwarmes alpha-modifiziertes MEM hinzufügen. Schließen Sie die Platte und stellen Sie sie in einen Inkubator bei 37 Grad mit 5 % Kohlendioxid und 95 % Luftfeuchtigkeit. Das Auswachsen von mesenchymalen Stromazellen aus den Nabelschnurstücken dauert drei bis sieben Tage, danach können die Zellen expandiert werden.

In der Zwischenzeit kann ECFC erweitert werden, was Ihnen im nächsten Schritt angezeigt wird. Verwenden Sie am nächsten Tag ein inverses Mikroskop, um die Zellen zu untersuchen. Wenn der Schabevorgang richtig durchgeführt wurde, sind die ersten proliferierenden Zellcluster vollständig sichtbar.

Ersetzen Sie das E GM zwei Medium, um alle nicht gebundenen Zellen und Partikel zu entfernen. Dehnen Sie die Zellen weiter aus und tauschen Sie zweimal pro Woche ein Drittel des Mediums aus. Nach 10 bis 12 Tagen werden regelmäßig sehr große Endothelkolonien beobachtet.

Entfernen Sie nun das Medium und waschen Sie es mit PBS, um den verbleibenden Proteinverbrauch loszuwerden. 0,05% Trypsin 0,7 Millimolar EDTA, um die Zellen abzulösen. Achten Sie beim Transfer von Zellen in neue Kulturgefäße darauf, Kolben in geeigneter Größe zu wählen, um eine niedrige Aussaatdichte zu erreichen.

Dies wird bei der weiteren Expansion helfen. Unser Labor züchtet in der Regel Nachkommen von mehr als 20 großen Kolonien in vier zweihundertfünfundzwanzig Quadratzentimeter große Kolben. Vergessen Sie nicht, zweimal pro Woche ein Drittel des Mediums auszutauschen.

Ein ähnliches Protokoll wird für die MSC-Erweiterung im nächsten Abschnitt verwendet. Nach Ablauf von drei bis sieben Tagen überprüfen Sie mit einem inversen Mikroskop das Auftreten spindelförmiger Zellen in der Nähe des anhaftenden Gewebes. Wenn genügend Zellwachstum vorhanden ist, neigen die Teile dazu, sich zu verfestigen, da sie den Kontakt mit dem Kunststoff verlieren.

Entfernen Sie nach 10 bis 12 Tagen die Gewebestücke. Die MSCs mit einer Trypsin-EDTA-Lösung vom Kunststoff lösen und die Zellen in neue, vorgefüllte Kulturflaschen mit Medium umfüllen, die die richtige Größe und Anzahl haben, um eine niedrige Aussaatdichte während der Zellexpansion zu gewährleisten. Nach der Vermehrung beider Zelltypen muss zweimal pro Woche ein Drittel des Mediums ausgetauscht werden.

Eine Färbung mit anschließender Durchflusszytometrie kann durchgeführt werden, um die Expression von Zelloberflächenmarkern zu erkennen, die auf Vorläuferphänotypen hinweisen, und um festzustellen, dass keine Kontamination mit hämatopoetischen Zellen vorliegt. Aussaat der reinen geernteten E-FCKW mit sehr geringer Plattierungsdichte von drei oder 10 Zellen pro Quadratzentimeter in Zellkulturplatten, um das Wachstum einer einzelnen Kolonie zu gewährleisten Tauschen Sie ein Drittel des Mediums zweimal wöchentlich nach 14 Tagen aus. Das Ende der Kultur.

Medium entfernen. Zweimal mit PBS waschen und die Kolonien mit eiskalter Fixierlösung fixieren 15 Minuten im Kühlschrank die Fixierlösung entsorgen und die Platten 10 Minuten offen trocknen lassen. Rehydrieren Sie die Zellen 10 Minuten lang mit destilliertem Wasser.

Fügen Sie Harris Hämatinlösung hinzu und färben Sie die fixierten Kolonien 12 Minuten lang. Hämatinlösung entfernen und die Platten mit Leitungswasser abspülen. Um die restliche Färbelösung loszuwerden.

Machen Sie Fotos von jeder Kolonie mit einem Stereomikroskop und importieren Sie Dateien im JPEG- oder TIFF-Format auf Ihren Computer. Öffnen Sie die Fotos mit der Image J-Software und analysieren Sie die genaue Zellzahl jeder Kolonie, wie in der folgenden Animation beschrieben. Öffnen Sie die Image J-Software und importieren Sie ein Kolonie-Image mit der Funktion zum Öffnen von Dateien im Pulldown-Menü.

Fahren Sie fort, indem Sie den Prozess verwenden. Funktion "Hintergrund subtrahieren". Verwenden Sie die elliptische oder Pinselauswahlfunktion im Menü Bild J, um den Kolonierand zu markieren.

Löschen Sie das umgebende Bild mit der Funktion "Außen löschen" und schneiden Sie das Bild zu, indem Sie "Bildzuschnitt" auswählen. Passen Sie den Schwellenwert manuell mit der Funktion zum Anpassen des Bildschwellenwerts an, sodass alle Zellen vollständig eingefärbt sind. Rot. Zählen Sie die Zellzahl der Kolonie, indem Sie auswählen.

Analysieren, Partikel analysieren. Wählen Sie die entsprechenden Einstellungen aus, die für jeden Zellentyp optimiert sind, und wählen Sie OK Bei korrekter Ausführung aus. Dieses Protokoll ermöglicht die Isolierung einer praktisch reinen Population von Zellen, die die Eigenschaften menschlicher endothelialer und mesenchymaler Vorläuferzellen teilen, die autolog zueinander sind, da sie aus demselben Strang stammen.

Ab dem fünften Tag treten spindelförmige mesenchymale Zellen unter dem Stück der Nabelschnur auf, das an der Kulturplatte befestigt ist. Nach ein bis zwei Tagen werden die ersten Cluster von Endothelkolonien, die Vorläuferzellen oder e FCKW bilden, unter einem inversen Mikroskop sichtbar. Diese schnell wachsende riesige Kolonie von e-FCKW bildete sich nach 11 Tagen.

Sowohl die MSC als auch die E-FCKW können durchgelassen und weiter ausgebaut werden. Wir empfehlen eine anschließende Analyse aller Kulturprodukte mittels Durchflusszytometrie, um den entsprechenden Phänotyp zu bestätigen. Bitte beachten Sie, dass sowohl die Endothel- als auch die Mesenchymlinie auf Antikörper reagieren, die spezifisch für CD 73, CD 1 46, CD 29 und CD 1 0 5 sind.

Beachten Sie, dass die MSCs den Oberschenkel eins exprimierten, was mit einem Anti-CD 90-Antikörper nachgewiesen wurde. Die E-FCKW sind positiv für CD 31, das auch als Thrombozyten-Endothelzell-Adhäsionsmolekül oder pcam bezeichnet wird. Es ist allgemein bekannt, dass die Expression der CD-34-Immunreaktivität im Nabelschnur durch E-FCKW durch wiederholte Kultivierung reduziert werden kann.

Blutzellmarker wie CD 45, H-L-A-D-R und CD 14 blieben für beide Zelltypen negativ. Die Hierarchie der Vorläuferzellen unter den E-FCKW kann mit der Image J-Software bewertet werden, indem die genaue Zellzahl jeder einzelnen Kolonie gezählt wird. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Maces und ECEs aus einem menschlichen Nabelschnurcode isolieren, erweitern und analysieren, wenn Sie dieses Verfahren durchführen.

Es ist wichtig, unter sterilen Bedingungen zu arbeiten und auf Phänotyp und Reinheit zu prüfen, bevor die Zellen in nachfolgenden Studien verwendet werden. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.