Gleichzeitige Isolierung von hochwertigen Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten aus einem erwachsenen Rattenherz

Mehrere Protokolle wurden entwickelt und beschrieben für die Isolierung von verschiedenen Herzzelltypen von einem Rattenherz. Hier wird ein optimiertes Protokoll beschrieben, das die Isolierung von hochwertigen Hauptkardiometertypen (Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten) aus einer einzigen Präparation ermöglicht, wodurch die experimentellen Kosten reduziert werden.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, gleichzeitig lebensfähige Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten aus dem Rattenherz für ihre individuellen in vitro-Analysen zu isolieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im kardiovaskulären Bereich zu den Signalmechanismen zu beantworten, die an kardialer Hypertrophie, Ischämie, Reperfusionsschäden, Endothelfunktion und Herzfibrose beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass alle wichtigen Herzzellen gleichzeitig isoliert werden können, was die damit verbundenen Forschungskosten und die Anzahl der Versuchstiere reduzieren kann.

Nach einer Spülung mit destilliertem Wasser und einer 50-Milliliter-Spülung mit Powell-Medium ersetzen Sie das Medium durch 80 Milliliter frisches Powell-Medium und verwenden Sie eine Glaspasteurpipette aus dem Glaszylinder, um das Medium kontinuierlich mit Carbogen zu perfundieren. Anschließend wird mit zwei Paar dünner, gebogener Pinzetten ein frisch entnommenes Rattenherz über die Aorta auf das Langendorff-Perfusionssystem montiert und das Ende der Perfusionssystemkanüle zwischen dem ersten Aortenast und der Aortenklappe platziert. Fixiere die Aorta mit einer Krokodilklemme.

Öffnen Sie die Klappe der Kanüle und fixieren Sie das Herz mit einer chirurgischen Naht. Lassen Sie 35 Milliliter des Perfusionsmediums tropfenweise durch das Herz strömen und entfernen Sie dabei das restliche Blut. Platzieren Sie den Auffangtrichter unter dem Herz und starten Sie die Peristaltikpumpe, um das Perfusionsmedium aus dem Auffangtrichter in das Reservoir umzuwälzen.

Geben Sie Kollagenaselösung in das Perfusionsmedium und perfundieren Sie das Herz 30 Minuten lang mit der rezirkulierenden Kollagenaselösung. Am Ende der Verdauung wird das Herz mit einer Schere aus dem Langendorff-System entnommen und in eine Petrischale aus Glas gelegt. Entferne nun sowohl die Vorhöfe als auch eventuell übrig gebliebenes Fettgewebe aus dem Herzen.

Um eine Kontamination der Epithelzellen zu vermeiden, verwenden Sie zwei Pinzetten, um das Perikard vorsichtig abzuziehen. Schneide das Herz in der Mitte ab und lege die Hälften in den Zerkleinerer. Schneiden Sie das Herz zwei- bis dreimal und geben Sie die Gewebestücke in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen, das 12 Milliliter Verdauungspuffer aus der Langendorff-Perfusion enthält.

Verdauen Sie die Gewebefragmente fünf bis 10 Minuten lang in einem Wasserbad, gelegentlich mit einer Fünf-Milliliter-Einwegpipette aus Kunststoff. Anschließend filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 100-Mikrometer-Sieb in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Spülen Sie das Perfusionssystem 30 Minuten lang mit mindestens einem Liter destilliertem Wasser, gefolgt von 100 Millilitern 0,1 normalem Natriumhydroxid, spülen Sie dann das System mit weiteren zwei bis drei Litern destilliertem Wasser und trocknen Sie das Gerät mit gespülter Luft.

Sammeln Sie die filtrierten Zellen durch Zentrifugation und verwenden Sie eine Einwegpipette, um die Endothelzelle und den Fibroblasten, die den Überstand enthalten, vorsichtig in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen zu übertragen. Suspendieren Sie das Pellet in sechs Millilitern Kalziumlösung eins. Nach einer Minute sammeln Sie die Zellen mit einer zweiten Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in sechs Millilitern Kalziumlösung zwei.

Nach einer Minute die Zellsuspension mit 12 Millilitern Calciumlösung drei verdünnen und durch leichtes Kippen gut mischen. Nach einer weiteren Zentrifugation wird das Pellet in 20 Millilitern vorgewärmtem CCT-Medium resuspendiert. Aliquotieren Sie dann jeweils einen Milliliter Zellen in eine von 20 sterilen 35-Millimeter-Zellkulturschalen, die mit Laminin vorbeschichtet sind, und legen Sie die Zellen in einen kohlendioxidfreien Zellkulturinkubator, wobei Sie das Medium durch zwei Milliliter frisches CCT-Medium ersetzen, um nach zwei Stunden alle abgestorbenen Zellen zu entfernen.

Zentrifugieren Sie nun die Endothelzelle und den Fibroblasten, die den Überstand enthalten, und resuspendieren Sie das Pellet in 1,5 Millilitern Endothelzellisolationspuffer. Übertragen Sie die Zellen in ein Zwei-Milliliter-Probenröhrchen und geben Sie den Zellen einen Anti-Ratten-CD31-Antikörper der Maus für eine 30-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius mit einer End-to-End-Rotation. Am Ende der Inkubation fügen Sie Pan Anti-Maus-IGG-Kügelchen hinzu, um eine 20-in-Inkubation bei vier Grad Celsius zu erhalten, mit einer Drehung von Ende zu Ende.

Legen Sie die Zellen am Ende der Kügelcheninkubation für zwei Minuten in ein Magnetgestell und entfernen Sie mit einer Ein-Milliliter-Pipette vorsichtig den meist fibroblastenhaltigen Überstand. Sehen Sie sich die Fibroblasten auf einer 10 Zentimeter großen Kulturschale an, die 10 Milliliter Fibroblasten-Zellkulturmedium enthält, und legen Sie die Zellen eine Stunde lang in einen Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Geben Sie als Nächstes einen Milliliter Waschpuffer in das Röhrchen mit den Endothelzellen und verschließen Sie das Röhrchen.

Schütteln Sie die Zellen vorsichtig vier- bis fünfmal, um die Kügelchen wieder zu suspendieren. Setzen Sie dann die Tube wieder in den Magneten ein und entfernen Sie den Waschpuffer nach einer Minute. Ersetzen Sie nach dem letzten Waschen den Waschpuffer durch einen Milliliter MV2-Endothelzellkulturmedium und säen Sie die Endothelzellen in eine einzelne Vertiefung einer 12-Well-Platte aus, um sie über Nacht im Zellkultur-Inkubator zu kultivieren.

Am Ende der Fibroblasten-Inkubation waschen Sie die anhaftenden Zellen zwei- bis dreimal mit einem entsprechenden Volumen vorgewärmtem PBS. Geben Sie dann vorgewärmtes frisches Fibroblasten-Zellkulturmedium zu den Zellen und geben Sie die Fibroblasten wieder in den Zellkultur-Inkubator. Ersetzen Sie am nächsten Morgen den Überstand auf der Endothelzellkultur durch frisches Endothelzellkulturmedium und stellen Sie die Zellen wieder in den Inkubator ein, wobei Sie das Medium alle zwei bis drei Tage austauschen, bis die Semikonfluenz erreicht ist.

Waschen Sie dann die Kultur der angehängten Fibroblastenzellen mit frischem, vorgewärmtem PBS, wie gerade gezeigt, und füttern Sie die Zellen mit frischem vorgewärmtem Medium. Das Verfahren zur Isolierung von Kardiomyozyten ergibt eine 70 bis 80 % reine, lebensfähige, stäbchenförmige, quergestreifte Herzzellpopulation. Anschließend kann eine intrazelluläre Calciumoszillationsanalyse von isolierten Kardiomyozyten, die mit Fura AM beladen sind, als Reaktion auf eine Ischämie-Repurfusion in Kardiomyozyten durchgeführt werden, sowie eine Analyse der Veränderungen der Calcium-Signalübertragung in magnetischen Endothelzellen und Fibroblasten nach der Zugabe von ATP

Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dieses Perfusionssystem richtig einzurichten und das Herz sofort im System zu fixieren, sobald es bereit ist. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der kardiovaskulären Forschung, um die Signalübertragung zu erforschen, die an verschiedenen kardiovaskulären Pathophysiologien beteiligt ist.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für die Grundprinzipien der Isolierung und Kultivierung von Herzzellen haben. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit chirurgischen Instrumenten und Zellkulturreagenzien äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Eingriffs immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. der sorgfältige Umgang mit den Instrumenten und die Verwendung von Handschuhen.