Name: Intra-arterielle Lieferung von neuronalen Stammzellen an das Ratten- und Maushirn: Anwendung auf zerebrale Ischämie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Erfahren Sie die intra-arterielle Zelltherapie für Schlaganfall-Behandlung bei Ratten und Mäusen. Diese Methode ermöglicht gezielte Lieferung neuronaler Stammzellen ins ischämische Gehirn mit Nachweisbarkeit bis zu 30 Tagen.

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Diese Forschung wurde unterstützt von den folgenden: AHA Award 14SDG20480186 für LC, Subject Innovation Team der Shanxi University of Chinese Medicine 2019-QN07 für BZ, und Kentucky Spinal Cord and Head Injury Research Trust Grant 14-12A für KES und LC.

Alle Verfahren zu tierischen Themen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Kentucky genehmigt, und es wurde entsprechend darauf geachtet, Stress oder Schmerzen im Zusammenhang mit einer Operation zu minimieren.
1. Herstellung von Injektionskatheter und chirurgischen Haken
<ol><li>Konstruieren Sie den Injektionskatheter (Abbildung 1). Sammeln Sie notwendige Materialien wie: MRE010, MRE025 und MRE050 Rohre, 20 G, 26 G und 27 G Injektionsnadeln (Abbildung 2A), 600 Sandpapier, Superkleber und Zweikomponenten 5-Minuten-Epoxid.<ol>
<li>20 G und 26 G Nadeln bei 1 cm von der Nadelnbenabe schneiden und das Ende auf Schleifpapier polieren (Abbildung 2B). Spülen Sie die Nadeln mit 10 ml doppelt destilliertem Wasser, um die Nadelbohrung zu reinigen. HINWEIS: Es werden zwei verschiedene Ausführungen verwendet (Abbildung 1). Design 1 verfügt über einen einzigen Steckverbinder und wird für die Injektion von Lösungen oder Suspensionen verwendet. Design 2 verfügt über 20 G und 26 G Luer-Sperrverbinder für die Injektion von Zellen (20 G Nadel) und Bündigung des Totvolumens (26 G Nadel), um die Lieferung des gesamten Volumens der NSC-haltigen Lösung zu gewährleisten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ausführung 1: Legen Sie einen 3-4 cm langen MRE010 Katheter in einen 15 cm langen MRE025 Katheter ein und sichern Sie ihn mit Superkleber.<ol>
<li>Schließen Sie das andere Ende des MRE025-Rohrs an ein Segment des MRE050-Katheters an und sichern Sie es mit Superkleber. Eine abgestumpfte 20 G Nadel in das restliche Ende des MRE050 Katheters einlegen und mit Superkleber sichern (Abbildung 1).</li>
		<li>Verstärken Sie die Verbindungsstellen mit Epoxidkleber weiter. Dieses Katheter-Design ist optimal für die Injektion von Reagenzien (wie chemische oder medikamentöse Lösungen oder andere Biologika wie Zytokine).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Design 2: Legen Sie einen 3-4 cm langen MRE010 Katheter in einen 15 cm langen MRE025 Katheter ein und sichern Sie ihn mit Superkleber.<ol>
<li>Schließen Sie das andere Ende des MRE025-Rohrs an ein Segment des MRE050-Katheters an und sichern Sie es mit Superkleber. Eine abgestumpfte 20 G Nadel in das restliche Ende des MRE050 Katheters einlegen und mit Superkleber sichern.</li>
		<li>Setzen Sie eine abgestumpfte 26 G Nadel in das MRE050-Rohr in der Nähe der Spitze der ersten Nadel, nach der Richtung des Injektionsflusses, und sichern Sie mit Superkleber (Abbildung 1 und Abbildung 2C). Verstärken Sie sowohl Nadeln als auch das Segment der MRE050-Röhre mit klarem Epoxid (Abbildung 2C). Dieses Design ermöglicht die Injektion der Fahrzeuglösung durch Nadel 2 (26 G) nach NSC-Injektion durch Nadel 1 (20 G), um das tote Volumen im Katheter in den Gehirnkreislauf zu spülen und so eine genauere Kontrolle der Injektionsvolumina zu erreichen.</li>
		<li>Verwenden Sie eine 20 G Nadel für die NSC-Injektion, um Schäden an den NSCs zu minimieren, die die Lebensfähigkeit beeinträchtigen könnten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nach dem Bau die Katheter mit 10 ml doppelt destilliertem Wasser, gefolgt von 70% Ethanol, spülen und dann über Nacht in 70% Ethanol einweichen.</li>
	<li>Vor der Operation entfernen Sie die Katheter aus 70% Ethanol und spülen Sie sie mit 10 ml sterilem PBS, und legen Sie sie in eine autoklavierte chirurgische Werkzeugbox für lagerungs- und Transport.</li>
	<li>Vorbereitung der chirurgischen Haken<ol>
<li>Einen 1,5- 2 cm langen Nadelschaft aus einer 27 G Nadel schneiden und beide Enden auf Schleifpapier polieren, bis sie stumpf sind. Dann verwenden Sie eine kleine hämostatische Klemme, um die Welle in einen Haken an einem Ende und eine Ringform am anderen Ende zu biegen.</li>
		<li>Legen Sie einen 10-15 cm langen MRE025 Katheter durch den Ring und sichern Sie ihn mit klarem chirurgischem Klebeband (Abbildung 2D). Machen Sie 2 weitere Haken mit der gleichen Methode.</li>
		<li>Alle Haken und Kathetersysteme bis zur Verwendung in 70% Ethanol einweichen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Tierzubereitung: Lieferung, Unterbringung, Umweltanpassung
<ol><li>Männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse (10-12 Wochen, n=10/Zeitpunkt) und Wistar-Ratten (10-12 Wochen, n=10) wurden in dieser Studie verwendet.</li>
	<li>Beherbergen Sie sie in einem umweltkontrollierten Tiervivarium mit Nahrung und Wasser ad libitum.</li>
	<li>Erlauben Sie ihnen, sich mindestens 1 Woche vor der Schlaganfalloperation an die Umwelt anzupassen. HINWEIS: Eine Maus und eine Ratte starben nach einer Schlaganfalloperation bei 1 d und eine Maus wurde nach einem Schlaganfall vor der NSC-Injektion aus humanen Gründen wegen schwerer Lähmung eingeschläfert.</li>
</ol>3. Kultur von mund- und rattenneuralen Stammzellen (NSCs)
HINWEIS: NSCs wurden nach einem etablierten Protokoll20isoliert und kultiviert.
<ol><li>Maus<ol>
<li>Isolat wildtype (WT) und GFP-markierte NSCs aus dem E18 embryonalen Kortex von zeitschwangeren weiblichen C57BL/6-Mäusen, die mit GFP-positiven männlichen Mäusen (B6 ACTb-EGFP) gepaart sind. Um GFP (+)-Embryonen zu identifizieren, beobachten Sie die geernteten Embryonen auf einem Fluoreszenzmikroskop mit dem FITC-Kanal. GFP (+) Embryonen liefern grünes Fluoreszenzsignal, während WT-Embryonen nur eine schwache Autofluoreszenz aufweisen (Abbildung 3A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ratte<ol>
<li>Isolieren Sie NSCs aus der subventrikulären Zone (SVZ) junger erwachsener WT-Ratten. Etikettieren Sie sie mit DiI kurz vor der Injektion nach Herstelleranleitung21.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kultur Maus oder Ratte NSCs, bis sie sich zu Neurosphären entwickeln, und durchsiet sie, wenn der Durchmesser der Kugel erreicht etwa 100 m (Abbildung 3B). Verwenden Sie die NSCs zur Injektion zwischen den Gängen 3 und 5.</li>
	<li>Überprüfen Sie ihre Stammzelleigenschaften mithilfe eines embryonalen Stammzellmarkerpanels (Abbildung 3C).</li>
	<li>Am Tag der Injektion NSC-Kugeln sammeln und mit der Zellablösung dissoziieren, in kalzium- und magnesiumfreiem PBS auf eine Konzentration von 107 Zellen/ml aussetzen und bis zur Injektion auf nasses Eis legen.</li>
</ol>4. Chirurgische Präparation
<ol><li>Markieren Sie vor der Operation einen Punkt auf der kommerziellen MCAO-Naht mit einem silbernen Markerstift bei 9 mm (für die Maus) oder 15 mm (für Ratten) von der Spitze für die in-chirurgische Referenz der Einstecklänge. Autoclavdien Sie die chirurgischen Werkzeuge (Schere, Zange) und Instrumente vor jeder Operation, und Wärme sterilisieren sie in einem Glasperlensterilisator zwischen den Operationen.</li>
	<li>Anästhesie bei Tieren mit 5% Isofluran durch Inhalation induzieren und Anästhesie mit 1-2% Isofluran aufrecht erhalten. Bewerten Sie die Tiefe der Anästhesie durch Beobachtung der allgemeinen Bedingungen (Atemmuster, Schnurrbartbewegung und spontane Körperkorrekturhaltung), Hornhautreflex und Reaktion auf Zehenkneifen.</li>
	<li>Legen Sie die tierische Suppe auf ein Heizkissen und bereiten Sie die chirurgische Stelle am Tier durch Clipping und Schrubben mit Betadinlösung, gefolgt von 70% Ethanol, vor. Schützen Sie die Augen des Tieres vor dem Trocknen, indem Sie während der Operation eine ophthalmologische Salbe (z. B. künstliche Tränensalbe) auftragen.</li>
	<li>Lassen Sie Chirurgen ihre Hände gründlich mit einem bakteriziden Peeling schrubben und eine Maske, sterile Handschuhe und einen sauberen Labormantel tragen.</li>
</ol>5. Mittlere Zerebrale Arterienverschluss (MCAO) Schlaganfallchirurgie
HINWEIS: Die Operationen, um ischämischen Schlaganfall in einer Hemisphäre von Maus oder Ratte zu induzieren, sind ähnlich, da eine Naht in die innere Karotisarterie (ICA) eingeführt wird, um den Blutfluss zu verschließen (Abbildung 4)17,18,19,22. Die für das Einstecken der Nahtform ausgewählte Arterie unterscheidet sich jedoch je nach dem für die nachfolgende Stammzellinjektion erforderlichen Einsatzraum. Die Ratte hat genügend Platz im externen Carotisarterie (ECA) Segment, um zwei separate, sequenzielle Operationen (Schlag und NSC-Injektion) zu ermöglichen, aber die Maus nicht, erfordert einen alternativen Ansatz. Schlaganfall-induzierte hirnbedingte Blutflussveränderungen, Hirninfarktgröße und neurologische Defizite wurden berichtet, wie in den früheren Berichten der Autoren17,18,19berichtet.
<ol><li>Um ischämischen Schlaganfall zu induzieren, beginnen Sie sowohl Maus- als auch Rattenoperationen mit einem Mittellinienschnitt im Gebärmutterhalsbereich und der Isolierung der linken gemeinsamen Halsschlagader (CCA), ECA und ICA (Abbildung 4). Seien Sie vorsichtig, um den CCA- oder Vagusnerv nicht zu dehnen, zu verdrängen oder zu drücken. Da die Auswahl der Arterie und der chirurgischen Schritte danach unterschiedlich sind, wird die MCAO-Operation an Maus und Ratte separat beschrieben.</li>
	<li>MCAO-Chirurgie an der Maus (Abbildung 4A)<ol>
<li>Legen Sie drei geflochtene 6-0 Nylonnähte unter die CCA(Abbildung 4A, Schritt 1), und machen Sie einen engen chirurgischen Knoten, um das Gefäß so weit wie möglich von der Bifurkation mit der proximalen Schnur zu verschließen (Abbildung 4A, Schritt 2). Trimmen Sie die Nähtenachlten nach unten.</li>
		<li>Machen Sie einen Slipknot an der distalen Seite von CCA (Vorsicht: nicht überziehen, da es in Schritt 6 freigegeben wird) und einen lockeren Slipknot zwischen den beiden angezogenen Knoten(Abbildung 4A,Schritt 2).</li>
		<li>Schneiden Sie einen kleinen Schnitt (ca. 1/4 - 1/3 des Umfangs) in der Nähe des proximalen Knotens auf der CCA mit Mikroschere(Abbildung 4A,Schritt 3), und legen Sie vorsichtig die kommerzielle Silikongummi beschichtet 7-0 massive Nylon Naht(Abbildung 4A, Schritt 4). Sichern Sie diese Naht mit der mittleren Schnur, ziehen Sie ausreichend(Abbildung 4A, Schritt 5), um sicherzustellen, dass kein Blutleck aus dem Schnitt und keine Bewegung des silikongummibeschichteten Nylon-Filaments durch den Rückfluss von ICA, während immer noch das Vorrücken der Naht in Richtung der ECA mit einem sanften Druck durch die Pinzette ermöglicht.</li>
		<li>Lassen Sie den oberen (distalen) Slipknot (Abbildung 4A, Schritt 6) los und bringen Sie die Nylonnaht in die ICA, bis ihre Spitze die Bifurkation für 9 mm passiert (mit dem silbernen Marker auf der Naht als Referenz). Ziehen Sie die oberen beiden Slipknots fest, um die Naht zu sichern und Blutrückfluss zu verhindern.</li>
		<li>Ziehen Sie das Filament 1 h später zurück(Abbildung 4A, Schritt 7) und ligaten Sie den CCA mit dem mittleren Knoten, um Blutungen zu verhindern (Abbildung 4A, Schritte 5-7 in umgekehrter Reihenfolge, Endergebnisse wie in Schritt 8). Lösen Sie den oberen Knoten. Schließen Sie die Wunde mit 4-0 chirurgische Naht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MCAO-Chirurgie an Ratten (Abbildung 4B)<ol>
<li>Legen Sie zwei geflochtene 6-0 Nylonnähte unter den ECA(Abbildung 4B, Schritt 1), und machen Sie einen engen Knoten am distalen Ende so weit wie möglich(Abbildung 4B, Schritt 2).</li>
		<li>Legen Sie Gefäßclips auf der ICA und CCA, um den arteriellen Blutfluss zu verschließen (Abbildung 4B, Schritt 3). Ein Slipknot kann als Alternative für einen Schiffsclip verwendet werden.</li>
		<li>Machen Sie einen kleinen Schnitt auf dem ECA mit Mikroschere(Abbildung 4B, Schritte 3-4), legen Sie ein kommerzielles Silikon gummibeschichtet 6-0 Nylon Filament(Abbildung 4B,Schritt 5), und sicheren Sie ordnungsgemäß mit einem Slipknot auf dem ECA.</li>
		<li>Lösen Sie den Gefäßclip auf der ICA, bringen Sie das Filament in die ICA vor, bis der Silbermarker (15 mm) die Bifurkation erreicht(Abbildung 4B,Schritt 6), und sichern Sie dann die Naht mit dem2. Knoten auf dem ECA(Abbildung 4B,Schritt 6).</li>
		<li>Nach 1 h Ischämie, ziehen Sie dieses Filament und ligate den Schnitt, um Blutungen zu verhindern(Abbildung 4B,Schritt 7), entfernen Sie den Gefäßclip von CCA (Endergebnis wie in Schritt 8), und schließen Sie die Wunde mit 4-0 chirurgische Naht.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Wiederherstellung
<ol><li>Legen Sie die Tiere nach einer Schlaganfalloperation auf ein Heizkissen, bis sie das Bewusstsein wiedererlangen.</li>
	<li>Analgesie durch subkutane Injektion. Bringen Sie Tiere in ihre HeimischenKäfige mit Zugang zu Wasser und Nahrung ad libitum zurück.</li>
</ol>7. Intraarterieninjektion
<ol><li>Den gesamten Katheter mit 70% Ethanol waschen und über Nacht bis zum Gebrauch einweichen. Schließen Sie kurz vor der Injektion das Luer-Schloss der Nadel mit einer sterilen Spritze an und waschen Sie die gesamte Lumenseite des Kathetersystems mit 10 ml sterilem PBS.</li>
	<li>Zeitfenster und Vorbereitung für NSC-Injektion HINWEIS: Basierend auf Erfahrungen und Berichten anderer Forschungsteams ist der Zeitpunkt für die NSC-Injektion entscheidend für das Überleben beider Probanden und exogener NSCs. In unserer Pilotstudie führte die Injektion von NSCs zu frühen Zeitpunkten (innerhalb der ersten 6 h nach Reperfusion) zu einer höheren Sterblichkeit. So testeten wir spätere Injektionszeitpunkte und ermittelten das Zeitfenster zwischen 2 d (48 h) bis 3 d (72 h) nach einem Schlaganfall ist sicher und für Tiere verträglich und ist effizient bei der Erreichung der intraparenchymalen Verteilung von NSCs. Die hier vorgestellten Ergebnisse stammen von Tieren, die nach einer Verletzung bei 3 d nSC injektionn wurden.<ol>
<li>Stellen Sie die Injektionsrate der Spritzenpumpe auf 20 l/min für Mäuse und 50 l/min für Ratten ein. Übermäßige Geschwindigkeit oder Dauer der Injektion kann zu einer systemischen Volumenüberlastung führen, für die Mäuse anfälliger sind als Ratten.</li>
		<li>Kurz gesagt, bei 3 d nach Schlaganfall-Operation, befeuchten Sie die Tiere mit Isofluran und legen Sie sie auf einem Heizkissen.</li>
		<li>Öffnen Sie die Halswunde erneut und setzen Sie eCA, ICA und CCA erneut aus(Abbildung 5, Schritt 1). Wie bei den Schlaganfalloperationen, bestimmen Sie den Injektionsweg basierend auf der Art. Verwenden Sie die CCA für NSC-Injektion in der Maus und die ECA für die Ratte23.</li>
	</ol></li>
	<li>Intraarterielle Injektion durch das CCA in der Maus<ol>
<li>Platzieren Sie zwei 6-0 geflochtene NylonNähte unter dem CCA. Erstellen Sie einen lockeren Slipknot mit jedem von ihnen zwischen der Bifurkation und unteren Knoten aus der vorherigen Schlaganfall-Operation(Abbildung 5, Schritt 2).</li>
		<li>Ziehen Sie den oberen Slipknot fest und machen Sie dann einen kleinen Schnitt über dem unteren Knoten(Abbildung 5,Schritt 3). Legen Sie einen MRE010-Katheter durch den Einschnitt ein (Abbildung 5, Schritt 4) und sichern Sie ihn mit dem mittleren Knoten, ohne den Einspritzfluss zu blockieren(Abbildung 5, Schritt 5). Der Blutrückfluss sollte im Katheter sichtbar sein, wenn der obere Knoten losgelassen und die Katheterposition angepasst wird.</li>
		<li>Legen Sie einen Gefäßclip auf die ECA, injizieren Sie 1 x 106 GFP-NSCs durch diesen Katheter bei 20 l/min für 5 min mit einer Spritzenpumpe, gefolgt von einem Flush mit 50-100 l PBS bei gleicher Geschwindigkeit.</li>
		<li>Nach der Injektion den CCA über den Schnitt mit dem oberen Schlupfknoten legen und den MRE010-Katheter zurückziehen (Abbildung 5,Schritt 6). Ziehen und trimmen Sie den mittleren Knoten und den oberen Knoten. Entfernen Sie den Behälterclip aus dem EuRH. Siehe das endgültige Bild in Abbildung 5, Schritt 7.</li>
		<li>Schließen Sie die Wunde mit 4-0 chirurgische Naht.</li>
		<li>Nach ausreichender Erholung auf einem Heizkissen und subkutaner schmerzlindernder Injektion, kehren Sie die Tiere in ihren heimischen Käfig zurück.</li>
	</ol></li>
	<li>Intraarterielle Injektion durch den EuRH bei Ratten<ol>
<li>Vorübergehend den EuRH und CCA mit Gefäßclips ausblenden(Abbildung 5, Schritt 2).</li>
		<li>Machen Sie einen kleinen Schnitt an der proximalen Seite des ECA (Abbildung 5, Schritt 3), legen Sie den MRE010-Katheter ein und sichern Sie ihn mit einem Knoten(Abbildung 5, Schritt 4).</li>
		<li>Entfernen Sie beide Behälterclips, injizieren Sie 5 x 106 NSCs in 100 l PBS bei 50 l/min für 2 min, gefolgt von einem Flush mit 50-100 l PBS (Abbildung 5, Schritt 5) bei gleicher Geschwindigkeit, mit einer motorisierten Spritzenpumpe.</li>
		<li>Nach der Injektion die CCA und ECA mit Gefäßclips wieder abblenden und den ECA an der proximalen Seite des zweiten Einschnitts nach Abzug des Injektionskatheters aufstellen(Abbildung 5,Schritt 6).</li>
		<li>Entfernen Sie die beiden Gefäßclips(Abbildung 5, Schritt 7) und schließen Sie die Wunde mit 4-0 chirurgischen Naht.</li>
		<li>Nach ausreichender Erholung auf einem Heizkissen und subkutaner schmerzlindernder Injektion, kehren Sie die Tiere in ihren heimischen Käfig zurück.</li>
	</ol></li>
	<li>Histologischer Assay<ol>
<li>Sammeln Sie Gehirne von Mäusen und Ratten, die einen ischämischen Schlaganfall erhalten haben, gefolgt von einer Injektion von NSCs oder Fahrzeuglösung nach Euthanasie und intrakardialer Perfusion mit 4% Paraformaldehyd bei 1 d (Maus und Ratte), 7 d (Maus) und 30 d (Maus) nach der Injektion. Jede dieser vier Gruppen bestand aus 5 NSC und 5 injizierten Tieren.</li>
		<li>Fix Gehirne über Nacht und kryopreserve in 30% Saccharose für 3 d.</li>
		<li>Die Gehirne in OCT einbetten, mit einer Dicke von 40 m schneiden und die Verteilung von NSCs nach der Immunfärbung mit zellspezifischen Markern untersuchen, einschließlich glialfibrillären sauren Proteins (GFAP, Astrozyten), Tuj1 (reife Neuronen) und Doublecortin (DCX, unreife Neuronen). HINWEIS: Aufgrund des Fehlens eines Rattenstamms, der GFP ausdrückt, haben wir DiI, ein transientes fluoreszierendes Etikett, für Ratten-NSCs verwendet, das nur eine relativ kurzfristige Beobachtung ermöglicht. Daher wurde die NSC-Verteilung erst bei 1 d nach einem Schlaganfall bei Ratten untersucht.</li>
	</ol></li>
</ol>

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Die Stammzelltherapie bei neurologischen Erkrankungen befindet sich noch in einem frühen explorativen Stadium. Ein großes Problem ist, dass es keine etablierte Methode für eine ausreichende Bereitstellung von SCs oder NSCs in das Gehirn gibt.
Obwohl exogene SCs/NSCs im Gehirn nach intravenöser (IV), intraperitonealer (IP) oder intraparenchymaler/intracerebraler Injektion nachgewiesen werden können, hat jeder Verabreichungsansatz Nachteile. Die nachweisbare Population im Gehirn wird mit einer p...

Die Stammzelltherapie (SC) birgt ein enormes Potenzial zur Behandlung neurologischer Erkrankungen wie Schlaganfall, Kopftrauma und Demenz1,2,3,4,5,6., Eine effiziente Methode zur Lieferung exogener SCs an das erkrankte Gehirn bleibt jedoch problematisch2,6,7,8,9,10,11,12,13. SCs, die über periphere Verabreichungswege, einschließlich intravenöser (IV) oder intraperitonealer (IP) Injektionen, geliefert werden, unterliegen einer Erstpassfilterung in der Mikrozirkulation, insbesondere in der Lunge, Leber, Milz und Muskel8,9,13,14, erhöhung der Wahrscheinlichkeit der Ansammlung von Zellen in Nicht-Ziel-Bereichen. Die invasive intracerebrale Injektionsmethode führt zu lokalisierten Hirngewebeschäden und einer sehr eingeschränkten Verteilung von SCs in der Nähe der Injektionsstelle2,6,8,14,15,16. Wir haben vor kurzem eine katheterbasierte intraarterielle Injektionsmethode eingeführt, um exogene neuronale SCs (NSCs) zu liefern, die hier in einem Nagetiermodell des fokalen ischämischen Schlaganfalls beschrieben wird. Wir induzieren vorübergehende (1 h) Ischämie-Reperfusionsverletzung in einer Hemisphäre mit einem Silikongummi beschichteten Filament, um die linke mittlere Hirnarterie (MCA) in der Maus oder Ratte17,18,19zu verschließen. In diesem Modell haben wir reproduzierbar etwa 75-85% Depression des zerebralen Blutflusses (CBF) in der ipsilateralen Hemisphäre mit Laser Doppler oder Laser speckle Imaging17,19beobachtet, was konsistente neurologische Defizite17,18,19ergibt.
Aus zeitsparenden Gründen wird das Video mit doppelter Normalgeschwindigkeit abgespielt und routinemäßige chirurgische Eingriffe wie Hautvorbereitung und Wundverschluss mit Naht und die Verwendung und Einrichtung der motorisierten Spritzenpumpe werden nicht dargestellt. Die Methode der intraarteriellen Abgabe von NSCs wird im Kontext des mittleren zerebralen Arterienverschlussmodells (MCAO) des experimentellen Schlaganfalls bei Nagetieren demonstriert. Daher schließen wir das transiente ischämische Schlaganfallverfahren ein, um später zu zeigen, wie die zweite Operation, die intraarterielle Injektion, mit der vorherigen chirurgischen Stelle am selben Tier durchgeführt wird. Die Durchführbarkeit der intraarteriellen NSC-Verabreichung in Nagetierschlagmodellen wird durch die Bewertung der Verteilung und des Überlebens exogener NSCs demonstriert. Die Wirksamkeit der NSC-Therapie zur Dämpfung der Hirnpathologie und neurologischen Dysfunktion wird separat berichtet.

<table><tbody><tr><td>20 G Nadel</td><td>Becton & Dickinson</td><td>BD PrecisionGlide 305175</td><td>Vorbereitung des Injektionskatheters</td></tr><tr><td>26 G Nadel</td><td>Becton & Dickinson</td><td>BD PrecisionGlide 305111</td><td>Vorbereitung des Injektionskatheters</td></tr><tr><td>27 G Nadel</td><td>Becton & Dickinson</td><td>BD PrecisionGlide 305136</td><td>Vorbereitung des Injektionskatheters</td></tr><tr><td>4-0 NFS-2 Naht mit Nadel</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56905</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>6-0 Nylonnaht</td><td>Teleflex/Braintree Scientific</td><td>104-s</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7922</td> Klinge <td>für Zellablösungslösung</td></tr><tr><td></td><td>Bard-Parker</td><td>10</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Buprenorphin-SR Lab</td><td>ZooPharm</td><td>Buprenorphin-SR Lab&reg;</td><td>Analgesie (0,6-1 mg/kg über 3 d)</td></tr><tr><td>Calcium/Magnisum-frei PBS</td><td>VWR</td><td>02-0119-0500</td><td>NSC-Dissoziation</td></tr><tr><td>DCX-Antikörper</td><td>Millipore</td><td>AB2253</td><td>Immunfärbung</td></tr><tr><td>GFAP-Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>180063</td><td>Immunfärbung</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>50562-1</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>MCAO-Filament für Maus</td><td>Doccol</td><td>702223PK5Re</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>MCAO-Filament für Ratten</td><td>Doccol</td><td>503334PK5Re Chirurgie</td><td></td></tr><tr><td>MRE010 Katheter</td><td>Braintree Scientific</td><td>MRE010</td><td>Vorbereitung des Injektionskatheters</td></tr><tr><td>MRE025 Katheter</td><td>Braintree Scientific</td><td>MRE025</td><td>Vorbereitung des Injektionskatheters</td></tr><tr><td>MRE050 Katheter</td><td>Braintree Scientific</td><td>MRE050</td><td>Vorbereitung des Injektionskatheters</td></tr><tr><td>Nu-Tears Salbe</td><td>NuLife Pharmaceuticals</td><td>Nu-Tears Salbe</td><td>Augenpflege während der</td></tr><tr><td>Operation S& T Pinzette - SuperGrip Tips JF-5TC Abgewinkelte</td><td>Fine Science Tools</td><td>00649-11</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgie S& T-Pinzette - SuperGrip-Spitzen JF-5TC Gerade</td><td>Feinmechanik-Werkzeuge</td><td>00632-11</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Sekundenkleber</td><td>Pacer Technologie</td><td>15187</td><td>Vorbereitung der Injektionskatheter-Spritzenpumpe</td></tr><tr><td></td><td>Kent Scientific</td><td>GenieTouch</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Tuj1 Antikörper</td><td>Millipore</td><td>MAb1637</td><td>Immunfärbung</td></tr><tr><td>Zweikomponenten-5-Minuten-Epoxidharz</td><td>Devcon</td><td>20445</td><td>Vorbereitung des Injektionskatheters</td></tr><tr><td>Vannas Federschere Fine</td><td>Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgie Gefäßklemmen</td><td>Fine Science Tools</td><td>00400-03</td><td>Chirurgie</td></tr><tr><td>Zeiss Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axio Imager 2</td><td>Mikroskopie</td></tr></tbody></table>

intra-arterielle lieferung von neuronalen stammzellen an das ratten- und maushirn: anwendung auf zerebrale ischämie

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Die Therapie mit neuronalen Stammzellen (NSC) ist eine neue innovative Behandlung bei Schlaganfall, traumatischen Hirnverletzungen und neurodegenerativen Erkrankungen. Im Vergleich zur intrakraniellen Verabreichung ist die intraarterielle Verabreichung von NSCs weniger invasiv und erzeugt eine diffusere Verteilung von NSCs innerhalb des Gehirnparenchyms. Darüber hinaus ermöglicht die intraarterielle Abgabe den Erstpasseffekt in der Hirnzirkulation, wodurch das Potenzial für das Einfangen von Zellen in peripheren Organen, wie Leber und Milz, verringert wird, eine Komplikation, die mit peripheren Injektionen verbunden ist. Hier beschreiben wir die Methodik, sowohl bei Mäusen als auch bei Ratten, für die Lieferung von NSCs durch die gemeinsame Halsschlagader (Maus) oder externe Halsschlagader (Ratte) an die ipsilaterale Hemisphäre nach einem ischämischen Schlaganfall. Anhand von GFP-markierten NSCs veranschaulichen wir die weitverbreitete Verteilung, die in der ipsilateralen Hemisphäre des Nagetiers bei 1 d, 1 Woche und 4 Wochen nach der postischen Verabreichung erreicht wird, mit einer höheren Dichte an oder in der Nähe der ischämischen Verletzungsstelle. Neben dem Langzeitüberleben zeigen wir Nachweise für eine Differenzierung von GFP-markierten Zellen nach 4 Wochen. Der hier für NSCs beschriebene intraarterielle Verabreichungsansatz kann auch für die Verabreichung therapeutischer Verbindungen verwendet werden und hat somit eine breite Anwendbarkeit auf verschiedene ZNS-Verletzungs- und Krankheitsmodelle über mehrere Arten hinweg.

GFP-markierte NSCs wurden im ischämischen Gehirn leicht nachgewiesen, vor allem in der ipsilateralen Hemisphäre, insbesondere im Penumbra und entlang des Verletzungsrands (Abbildung 6). Der Prüfer wurde während der Bildgebung und Analyse einmalig blind.
Zum Beispiel wurden bei 1 d nach der Injektion NSCs innerhalb des Maus-Hippocampus nachgewiesen. Eine Teilmenge von NSCs zeigte die Koexpression des unreifen Neuronenmarkers DCX im Dentate-Gyrus bereits zu diesem f...

Eine Methode zur Abgabe neuronaler Stammzellen, anpassungsfähig für Injektionslösungen oder Suspensionen, durch die gemeinsame Halsschlagader (Maus) oder externe Halsschlagader (Ratte) nach ischämischem Schlaganfall wird berichtet. Injizierte Zellen sind breit über das Gehirn Parenchym verteilt und kann bis zu 30 d nach der Geburt nachgewiesen werden.

Intra-arterielle Lieferung von neuronalen Stammzellen an das Ratten- und Maushirn: Anwendung auf zerebrale Ischämie

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Schlaganfall ist weltweit die Hauptursache für Sterblichkeit und Behinderung. Obwohl Thrombolyse und chirurgische Entfernung von zerebralen Gefäßverschlüssen bei ausgewählten Patienten durchgeführt werden können, besteht nach wie vor ein dringender Bedarf an wirksamen Therapien gegen Schlaganfall. Hier zeigen wir eine katheterbasierte, intraarterielle Versorgung der ischämischen Hemisphäre als potenzielles Therapieschema für die Schlaganfalltherapie.Zuerst stellen wir vor, wie man den Injektionskatheter und chirurgische Haken vorbereitet. Wir haben zwei Arten von Injektionskathetern für die intraarterielle Injektion entwickelt. Design eins wird für die Injektion einer Lösung oder Suspension verwendet, die keine Spülung des Rohres erfordert.Design zwei ermöglicht die Injektion von neuronalen Stammzellen, gefolgt von einer Spülung des toten Volumens, um das volle Volumen zu liefern. Um einen Satz Von Injektionskathetern zu bauen, benötigen Sie 26 Gauge- und 20-Meter-Nadeln, eine Länge von 10 bis 15 Zentimetern MRE 25 Katheter und drei Zentimeter Länge von MRE 50 und MRE 10 Katheter. Schneiden Sie beide Nadelspitzen ab und polieren Sie das Metallende auf Schleifpapier, um das Rohr wieder zu öffnen und die Kanten zu glätten und dann mit destilliertem Wasser zu spülen, um die Bohrung zu reinigen und Schmutz abzuwaschen.Die Abbildung zeigt ein geschlossenes Ende einer 20-Meter-Nadel nach dem Abschneiden der Nadelspitze, die nach dem Polieren mit einer glatten Bohrung wieder geöffnet wird. Setzen Sie unter dem Mikroskop die 20-Spur-Nadel in das Ende der MRE 50-Schläuche ein. Biegen Sie die 26-Spur-Nadel und durchdringen Sie dann die Schläuche unter dem Ende der 20-Meter-Nadelspitze.Sichern Sie die 26-Spur-Nadel mit Superkleber. Dann betten Sie die beiden Nadelnaben und die Schläuche und Epoxid, um einen festen Block zu bauen, um die Festigkeit zu erhöhen. Sie benötigen auch drei chirurgische Haken, um das Gewebe in Position zu halten, um die chirurgischen Stellen besser zu belichten.Eine eineinhalb bis zwei Zentimeter lange Nadelwelle von einer 27-Spur-Nadel schneiden und beide Enden auf Schleifpapier polieren, bis sie stumpf sind. Verwenden Sie eine kleine hämostatische Klemme, um die Welle in einen Haken an einem Ende und eine ringförmige am anderen Ende zu biegen. Legen Sie einen 10 bis 15 Zentimeter langen MRE 25 Katheter durch den Ring und sichern Sie ihn mit klarem Operationsband.Erstellen Sie zwei weitere Hooks mit der gleichen Methode. Die Haken und das Kathetersystem sollten über Nacht in 70 Prozent Ethanol zur Sterilisation eingeweicht werden. Alle Verfahren, die tiertierische Themen betreffen, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Kentucky genehmigt.Wir verwenden HNO embryonale Maus Gehirn, um GFP zu kulturieren, positive neuronale Stammzellen. GFP-positive Embryonen können im FITC-Kanal leicht auf einem Fluoreszenzmikroskop visualisiert werden. Während Wildtyp-Embryonen zeigen keine Fluoreszenz mit der gleichen Exposition.Die Autofluoreszenz von Wildenembryonen ist nur sichtbar, wenn die Belichtungszeit um das 100-fache erhöht wird. Embryonale Kortex wird gesammelt und verwendet, um neuronale Stammzellkulturen nach dem Herstellerprotokoll zu etablieren. Diese neuronalen Stammzellen können Neurosphären bilden und können über 10 Generationen durchgehen und sie können sich in Glia unterscheiden sind Neuronen.Panel von embryonalen Stammzellmarkern wie Nanog, SSEA1, Oct4 und Sox3 kann verwendet werden, um die Stammzelleigenschaften in Neurosphären zu identifizieren. Neurosphären wurden in den Medien kultiviert, nach dem Herstellerprotokoll und verwendung zwischen den Passagen drei und fünf für die Neuronalstammzellabgabe. Der ischämische Schlaganfall wurde in der linken Hemisphäre sowohl für Mäuse als auch für Ratten induziert, wobei eine filamentbasierte, mittlere Zerebrale Arterienverschluss, MCAO mit einigen Modifikationen je nach Art verwendet wurde.Bei Mäusen wird das Filament durch die gemeinsame Halsschlagader, CCA, eingeführt und in die innere Halsschlagader ICA vorgeschoben. Bei Ratten wird das Filament durch die äußere Halsschlagader ECA in die ICA eingeführt, da der größere Arbeitsbereich größer ist. Hier zeigen wir die Mauschirurgie.Nach einem Mittellinienschnitt entlang des Halses, trennen Sie die darunter liegenden Gewebe mit stumpfer Sezierung. Verwenden Sie die drei mikrochirurgischen Haken aus 27-Spur-Nadelwellen, um ein besseres Gesichtsfeld zu erreichen. Das schwarze Quadrat zeigt den Operationsbereich für den nächsten Schritt an.Die Muskelschicht über dem linken CCA ist sorgfältig geöffnet, um den linken CCA und vagus Nerv zu belichten. Folgen Sie dem CCA, bis Sie die Bifurkation erreichen und identifizieren. Vorsicht sollte geboten werden, um diesen CCA- oder Vagusnerv nicht zu dehnen, zu verdrängen oder zu drücken.Öffnen Sie vorsichtig das klare Bindegewebe und decken Sie den CCA- und Vagusnerv ab. Befreien Sie den Raum unter diesem CCA mit einer Spitze der Zange und isolieren Sie den CCA-Stamm so weit wie möglich. Fädeln Sie eine doppelsträngige sechs O geflochtene Nylon chirurgische Naht unter dem CCA.Schneiden Sie den Mittelpunkt, um die Nähte zu verlassen, die dem CCA zugrunde liegen. Legen Sie eine weitere Nylon-Nähte unter die CCA. Binden Sie einen Slipknot auf die obere Naht, halten Sie es locker.Trennen Sie die beiden unteren Nähte. Binden Sie einen Schlupfknoten mit der mittleren Naht, halten Sie es für den Moment locker. Binden Sie den Knoten eines Chirurgen mit einer niedrigeren Naht und bewegen Sie ihn so weit wie möglich an das proximale Ende.Trimmen Sie die Nähtenachlten nach unten. Setzen Sie die CCA über die Bifurkation hinaus weiter aus. Drücken Sie den oberen lockeren Slipknot auf die Bifurkation und ziehen Sie ihn fest, um einen Blutrückfluss zu verhindern.Legen Sie die silikongummibeschichtete 70 Nylon MCAO Naht neben die CCA. Schneiden Sie mit einer Mikroschere einen kleinen Schnitt auf dem CCA neben dem unteren Knoten. Setzen Sie die Spitze der MCAO-Nähte durch diesen Schnitt in die CCA ein und bringen Sie sie auf den oberen Knoten vor.Passen Sie die Position des mittleren Knotens an und ziehen Sie ihn fest, bis er die MCAO-Naht in Position halten kann. Den Knoten nicht übermäßig festigen. Lösen Sie den oberen Knoten, aber machen Sie einen weiteren lockeren Schlupfknoten an der gleichen Stelle.Fördern Sie die MCAO-Nähte in die ICA. Bestätigen Sie, dass die MCAO-Naht die Bifurkation in die ICA übergibt. Der Pfad der Naht sollte relativ gerade sein und tiefer in das Gewebe eindringen, während es voranschreitet.Überprüfen Sie den silbern Marker am Nahtende. Stellen Sie sicher, dass es die Bifurkation erreicht. Überprüfen Sie die Richtung der MCAO-Nähte erneut.Passen Sie die oberen und mittleren Knoten an, um keine Blutleckszugung zu gewährleisten. Weitere Fortschritte der MCAO Naht, ziehen Sie die beiden oberen Knoten, um die MCAO Naht an Ort und Stelle zu sichern. Beginnen Sie die Aufnahmezeit für eine Stunde Ischämie.Nach einer Stunde Ischämie befeuchten wir das Tier und öffnen die Hautwunde wieder. Setzen Sie den operationschirurgischen Bereich aus. Suchen Sie obere und mittlere Slipknots.Lösen Sie den oberen Knoten vorsichtig. Ziehen Sie die MCAO-Nähte vorsichtig heraus, bis das weiße Silikonkautschukteil den mittleren Knoten erreicht. Ziehen Sie den oberen Knoten fest, um die MCAO-Naht an Ort und Stelle zu halten, um Blutungen zu vermeiden.Lassen Sie den mittleren Slipknot vorsichtig los. Ziehen Sie die MCAO-Nähte heraus, bis ihr Ende den oberen Knoten passiert. Ziehen Sie den oberen Knoten fest.Platzieren Sie den mittleren Slipknot direkt über dem Schnitt auf dem CCA. Ziehen Sie den mittleren Slipknot an. Entfernen Sie den oberen Knoten.Trim Nahtenen des mittleren Knotens. Schließen Sie die Hautwunde und lassen Sie das Tier sich erholen. Basierend auf unserer Erfahrung, neuronale Stammzellen sicher durch diese arterielle Route zwischen einem und drei Tagen nach dem Schlaganfall injiziert.Auch hier gibt es geringfügige Unterschiede zwischen Maus- und Rattenoperationen für die neuronale Stammzellinjektion. Und hier zeigen wir die Mauschirurgie. Am dritten Tag nach dem Schlaganfall, beantieren Sie das Tier, öffnen Sie die Wunde wieder und setzen Sie die CCA wieder frei.Legen Sie eine doppelsträngige chirurgische Naht unter die CCA und schneiden Sie sie in der Mitte, um zwei Nähte zu erhalten. Legen Sie die beiden Nähte richtig. Machen Sie einen Slipknot mit der oberen Naht.Platzieren Sie es direkt unter der Bifurkation. Ziehen Sie den oberen Slipknot fest. Machen Sie einen weiteren Slipknot mit der mittleren Naht.Schneiden Sie einen kleinen Schnitt direkt über dem gestutzten Knoten, der von der Schlaganfalloperation übrig geblieben ist. Schneiden Sie die Spitze des MRE 10 Katheters mit einem Winkel von ca. 45 Grad. Verwenden Sie dieses scharfe Ende, um den Schnitt auf dem CCA einzugeben.Achten Sie darauf, den Einstiegswinkel und die Kraft, die zum Einsetzen des Katheters verwendet wird, richtig einzustellen. Andernfalls kann der Katheter nicht in das CCA gelangen oder es durchstechen. Legen Sie den Katheter ein und rücken Sie vor, bis die Spitze den oberen Knoten erreicht.Ziehen Sie den mittleren Slipknot fest, um den Katheter an Ort und Stelle zu halten und keine Blutverbindung zu gewährleisten. Lösen Sie den oberen Knoten. Machen Sie einen Schlupfknoten mit der oberen Naht.Passen Sie den Winkel des Katheters innerhalb des CCA und die Positionen beider Knoten an, bis ein schneller Blutrückfluss sichtbar ist, was auf eine erfolgreiche Kommunikation zwischen Katheter und CCA-Fluss hindeutet. Starten Sie die Spritzenpumpe. Das Blut im Katheter wird zurück in den CCA gespült.Beenden Sie die Injektion nach fünf Minuten. Ligate den oberen Knoten. Lösen Sie den mittleren Knoten und ziehen Sie den Katheter zurück.Ligate den mittleren Knoten. Trimmen Sie alle Knoten. Schließen Sie die Wunde und lassen Sie das Tier sich erholen.Nach intraarterieller Injektion sind GFP-markierte neuronale Stammzellen meist in der ipsilateralen Hemisphäre zu finden. Hier zeigen wir die Verteilung im Hippocampus Dentate Gyrus an einem Tag nach der Injektion. In der ipsilateralen Hemisphäre, einige der GFP positive neuronale Stammzellen in der Kortex und Striatum lokalisiert, Exprimat Doppelkort, ein Marker von unreifen Neuronen.Dies sind repräsentative Bilder von Schein- und Schlaganfalltieren mit oder ohne neuronale Stammzellinjektion nach sieben Tagen nach der Injektion. 30 Tage nach der Entbindung kann nur eine geringfügige Autofluoreszenz über den FITC-Kanal bei den Tieren, die eine Fahrzeuginjektion erhalten, nachgewiesen werden. Während in Stammzellen injizierte Tiere, GFP-markierte neuronale Stammzellen können im verletzten Gehirn mit Derexpression von verschiedenen Zellmarkern wie dem Gleo-Marker GFP oder dem neuronalen Marker Tujuan gefunden werden.Die weißen Pfeile in jedem Bild zeigen neuronale Stammzellen an, die GFP- bzw. Tujuan-Marker exzieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die intraarterielle Injektion eine praktikable Methode zur Abgabe von neuronalen Stammzellen zur Schlaganfalltherapie ist. Neuronale Stammzellen können überleben und sich in verschiedene Zelltypen innerhalb des verletzten Gehirns differenzieren.Und schließlich kann die hier eingeführte intraarterielle Injektionsmethode auch für die Lieferung von Lösungen und Suspensionen eingesetzt werden.

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