Name: Bildgebung und Analyse von ölrot-o-gefärbten ganzen Aortenläsionen in einem Aneurysma-Hyperlipidämie-Mausmodell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Lernen Sie die Bildgebung und Analyse von atherosklerotischen Läsionen in hyperlipidämischen Mäusen. Diese Methode ermöglicht die quantitative Bewertung von Plaques und unterstützt die Erforschung genetischer Faktoren sowie neuer Therapien.

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Diese Arbeit wurde zum Teil durch einen Joint Biology Consortium Microgrant unterstützt, der im Rahmen des NIH-Zuschusses P30AR070253 (P.-Y.C.) und HL135582 (M.S.) bereitgestellt wurde. Wir danken R. Webber und L. Coon für die Aufrechterhaltung der in dieser Studie verwendeten Mäuse.

mT/mG (Lagernummer 007676) und Apoe-/- (Lagernummer 002052) Mäuse wurden vom Jackson Laboratory gekauft. Myh11-CreERT2-Mäuse waren ein Geschenk von Stefan Offermanns (erhältlich im Jackson Laboratory als Lagernummer 019079). Tgfbr2fl/fl-Mäuse wurden von Harold L. Moses (Vanderbilt University) gewonnen. Alle Tierverfahren wurden unter Verwendung von Protokollen durchgeführt, die vom Yale University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt wurden.
1. Mäuse
<ol><li>Produzieren Sie MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/- und MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/- Mäuse wie zuvor beschrieben7. Rassemutanten stützen sich seit mehr als zehn Generationen auf den C57BL/6J-Hintergrund. HINWEIS: Die Myh11-CreERT2 Cre-Mauslinie bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Rolle glatter Muskelzellen bei der vaskulären Homöostase und Gefäßpathologie. Das Cre-Allel wird in das Y-Chromosom eingefügt; Daher drücken weibliche Mäuse dieses Konstrukt nicht aus.</li>
</ol>2. Maus-Genotypisierung, Tamoxifen-Induktion und cholesterinreiche fettreiche Diät Fütterung
<ol><li>Führen Sie eine Mausgenotypisierung mit Mausohr-DNA- und PCR-Analysen durch. Mausohr-DNA sollte mit dem DNA-Isolationskit für Blut und Gewebe (Table of Materials) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert werden. PCR-Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt.</li>
	<li>Induzieren Sie die Cre-Lox-Rekombination durch Tamoxifen-Injektion bei 1 mg / Tag i.p. für 5 Tage in 6 Wochen alten MYH11-CreERT2; mT/mGf/f; Apoe-/- und MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/- männliche Mäuse.</li>
	<li>Induzieren Sie Atherosklerose, indem Sie 8 Wochen alte männliche Mäuse (2 Wochen nach der Tamoxifen-Behandlung) 16 Wochen lang auf eine HCHF-Diät (40% kcal Fett, 1,25% Cholesterin, 0% Cholsäure) setzen.</li>
</ol>3. Reagenzien und Vorbereitung von Sezierwerkzeugen
<ol><li>Zubereitung der Rot-O-Lösung des Stammöls: 1 g Öl Red O in 100 ml Isopropylalkohol auflösen.</li>
	<li>Arbeitsöl Red O Lösung Zubereitung: Mischen Sie 24 ml Stammöl Red O Lösung mit 16 ml dH2O. Filtern Sie das verdünnte Oil Red O mit 0,45 μm sterilen Spritzenfiltern (die Lösung ist nur für 1–2 h gut).</li>
	<li>60% Isopropylalkohol-Zubereitung: Mischen Sie 60 ml Isopropylalkohol mit 40 ml dH2O.</li>
	<li>4% Formaldehyd in 1x DPBS-Zubereitung: 10 ml 16% Formaldehyd in 30 ml 1x DPBS verdünnen.</li>
	<li>Reinigen Sie alle Sezierwerkzeuge mit 70 % Ethanol (Abbildung 1).</li>
</ol>4. Euthanasie (Abbildung 2A)
<ol><li>Messen Sie das Gewicht der Maus vor der Euthanasie.</li>
	<li>Euthanasie die Maus durch intraperitoneale Injektion von Ketamin und Xylazin (jeder Milliliter enthält 10 mg / ml Ketamin und 2 mg / ml Xylium).</li>
	<li>Stellen Sie die Maus in Rückenlage (Bauchseite nach oben).</li>
</ol>5. Öffnung der Brust- und Bauchhöhle und Herzperfusion (Abbildung 2B)
<ol><li>Bereiten Sie eine 10-ml-Spritze mit 10 ml 1x DPBS vor. Kappe mit einer 25 G Nadel. Die Spritze wird verwendet, um das Herz zu spülen.</li>
	<li>Die Haut mit einer Pinzette (Style 5) hochhalten und mit einer feinen Schere von der Bauchbasis bis zur Halsoberseite schneiden.</li>
	<li>Öffnen Sie die Bauchdecke unterhalb des Brustkorbs.</li>
	<li>Heben Sie das Brustbein mit einer Pinzette an (Stil 5) und schneiden Sie das Zwerchfell ab, schneiden Sie dann den Brustkorb weg, um die Brusthöhle freizulegen.</li>
	<li>Machen Sie einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof des Herzens.</li>
	<li>Durchbluten Sie die apikale linksventrikuläre Punktion, indem Sie langsam 10 ml 1x DPBS injizieren. Einmal gründlich durchblutet, werden Leber und Niere hellbraun in der Farbe.</li>
	<li>Reinigen Sie die Brusthöhle von Fremdblut und Flüssigkeit, indem Sie einen Vliesschwamm verwenden, um das Material zu absorbieren.</li>
</ol>6. Isolierung von Aorta und Zweigen (Abbildung 2C)
<ol><li>Entfernen Sie Organe (d. H. Lunge, Leber, Milz sowie Magen-Darm- und Fortpflanzungsorgane) und schneiden Sie das Schlüsselbein mit einer Pinzette (Stil 5) und einer feinen Schere, während Herz, Niere und Aorta in situ intakt bleiben. HINWEIS: Achten Sie darauf, das Herz oder größere Blutgefäße nicht zu zerreißen.</li>
	<li>Legen Sie die Maus unter ein Stereomikroskop.</li>
	<li>Sezieren Sie Aorta und Aortazweige einschließlich brachiozephaler Arterie, Halsschlagadern, Hinterhauptverkehrsadern, Nierenarterien, gemeinsame Beckenarterien und Oberschenkelarterien mit einer Pinzette (Stil 4) und einer Federschere. HINWEIS: Bedecken Sie die Aorta mit einem nassen, nicht gewebten Schwamm, um Austrocknung zu vermeiden, während Sie die Aortenzweige sezieren.</li>
	<li>Sezieren und entfernen Sie vorsichtig zufälliges Fett- und Bindegewebe um die Aorta- und Aortenzweige mit einer Pinzette (Stil 4) und einer Federschere. HINWEIS: Da die Entzündung bei der Aneurysma-Hyperlipidämie-Maus prominent ist, ist es schwierig, Adventitia zu entfernen. Achten Sie darauf, die Aorta- und Aortenzweige nicht zu zerreißen oder zu durchbohren. Dieser Schritt erfordert Übung und Geduld.</li>
</ol>7. Fixierung von Herz und Aorta (Abbildung 2D,E)
<ol><li>Bereiten Sie eine 10-ml-Spritze mit 10 ml 4% Formaldehyd in 1x DPBS vor. Kappe mit einer 25 G Nadel. ACHTUNG: Formaldehyd ist gefährlich. Lesen Sie das Sicherheitsdatenblatt, bevor Sie mit dieser Chemikalie arbeiten. Tragen Sie Handschuhe und Schutzbrillen und produzieren Sie die Verdünnungslösungen in einem Abzug. HINWEIS: 4% Formaldehydlösung wird im Laufe der Zeit abgebaut. Es ist wichtig, frisch hergestelltes 4% Formaldehyd zur Fixierung zu verwenden.</li>
	<li>Fixieren Sie den Gefäßbaum durch apikale linksventrikuläre Punktion, indem Sie langsam 10 ml 4% Formaldehyd injizieren. HINWEIS: Die Formaldehydfixierung stört mehrere nachgelagerte Anwendungen wie Zellkultur, FACS-Analyse und Einzelzell-RNA-Sequenzierungsanalyse. Überspringen Sie diesen Schritt, wenn die Aorta für eine dieser Anwendungen verwendet wird.</li>
	<li>Reinigen Sie die Brusthöhle von Fremdflüssigkeit mit einem Vliesschwamm, um das Material zu absorbieren.</li>
	<li>Trennen Sie das Herz von der Aorta, indem Sie das Herz mit einer Pinzette (Stil 4) halten und eine Mikrosezierungs-Federschere verwenden. HINWEIS: Um nach diesem Schritt eine Oil Red O-Färbung durchzuführen, wird empfohlen, die Aorta an Ort und Stelle statt ex vivo aufzuschneiden und mit Abschnitt 8 fortzufahren. Dies erleichtert es der gegenüberliegenden Aorta, flach zu liegen.</li>
	<li>Isolieren und entfernen Sie die Aorta und ihren Major von 1 mm über der Halsschlagader bis zum Ende der Oberschenkelarterie mit einer Pinzette (Stil 4) und einer Federschere.</li>
	<li>Geben Sie das Gefäß in eine Wachs-Petrischale oder ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und füllen Sie es mit 1x DPBS, bis es die Aorta bedeckt. HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.</li>
</ol>8. Öl-Rot-O-Färbung und Abbildung ungeöffneter ganzer Aorten (Abbildung 3)
<ol><li>Heften Sie das Gefäß mit winzigen Stiften auf eine Wachs-Petrischale (Abbildung 3A).</li>
	<li>Spülen Sie das Gefäß einmal mit 1x DPBS ab.</li>
	<li>Gießen Sie 25 ml frische Oil Red O-Lösung in die Petrischale (Abbildung 3B). HINWEIS: (1) Isopropanol ist gefährlich und eine brennbare Flüssigkeit. Verwenden Sie die richtige persönliche Schutzausrüstung. (2) Oil Red O Lösung kann leicht ausfallen. Die ausgefällten Partikel können die nachfolgende Färbung stören. Es ist wichtig, den Niederschlag zu entfernen, indem die Oil Red O-Lösung vor dem Gebrauch durch einen 0,45-μm-Filter filtriert wird. (3) Es ist am besten, frische Oil Red O-Lösung vorzubereiten und jede nicht verwendete Lösung zu entsorgen. (4) Neben Oil Red O ist Sudan IV eine weitere chemische Verbindung, die zur Färbung von Lipiden, Triglyceriden und Lipoproteinen verwendet wird. Oil Red O hat jedoch Sudan IV allmählich ersetzt, da die von Oil Red O erzeugte rote Farbe intensiver ist und somit Fett viel leichter zu sehen machen kann.</li>
	<li>Färben Sie die Aorta für 60 min bei Raumtemperatur (RT). Oil Red O färbt lipidreiche Plaque rot und hinterlässt andere nicht plaquehaltige Bereiche, die eine blasse Farbe haben.</li>
	<li>Einmal für 20 min mit 60% Isopropanol bei RT waschen. HINWEIS: Übermäßiges Spülen kann die Plakette verschmutzen.</li>
	<li>Spülen Sie die Aorta 3x mit dH2O für 5 Minuten, um Isopropanol zu entfernen.</li>
	<li>Reinigen Sie unter einem Stereomikroskop vorsichtig das gesamte perivaskuläre Fettgewebe um die Aorta herum mit einer Pinzette (Stil 4) und einer Federschere (Abbildung 3C, D). HINWEIS: Es ist wichtig, das gesamte perivaskuläre Fettgewebe um die Aorta und ihre Äste nach der Färbung zu reinigen, da ölrotes O-gefärbtes perivaskuläres Fettgewebe einen falschen Hintergrund ergeben und die Plaquemorphometrie und die Plaquebereichsquantifizierung beeinträchtigen kann. Achten Sie darauf, keinen Teil der Aortenwand zu entfernen. Füllen Sie die Wachsschale mit dH2O, bis sie während der Reinigung die gefärbte Aorta bedeckt. Dieser Schritt erfordert Übung und Geduld.</li>
	<li>Übertragen Sie das Gefäß auf einen sauberen Objektträger aus Glas.</li>
	<li>Erfassen Sie digitale Mikroaufnahmen mit einer Kamera, die an ein Lichtmikroskop angeschlossen ist. Speichern Sie hochauflösende Bilder, vorzugsweise im TIFF-Format (Tagged Image File Format) (Abbildung 3E). HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Um ein Austrocknen der Aorta zu verhindern, geben Sie das Gefäß in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und füllen Sie es mit 1x DPBS, bis es die Aorta bedeckt. Bei 4 °C lagern.</li>
</ol>9. Stufenlose Aortenmontage (Abbildung 4, Abbildung 5)
<ol><li>Das Gefäß in eine Wachs-Petrischale geben und mit 1x DPBS füllen, bis es die Aorta bedeckt.</li>
	<li>Durchtrennen Sie die Halsschlagadern, die subclaviafarbenen Arterien des Aortenbogens und der Beckenarterien in der Bauchaorta 1–2 mm nach Bifurkationen. Durchtrennen Sie die Nierenarterien. (Abbildung 4A)</li>
	<li>Längsschnitt die Aortenvorbereitung entlang der inneren Krümmung (Abbildung 4B1) und allein der Beckenarterien (Abbildung 4B2) mit einer mikrodissektierenden Federschere auf.</li>
	<li>Schneiden Sie die drei Zweige des Aortenbogens (d. h. innominate, linke gemeinsame Halsschlagader, linke Arteria subclavia) entlang der größeren Krümmung bis zum Basisniveau der inneren Krümmung (x-Markierung) (Abbildung 4B3–B8) mit einer mikrodissektierenden Federschere auf.</li>
	<li>Die Aorta flach (Lumenseite nach oben) in eine Wachsschale mit winzigen Stiften stecken und 1x DPBS auftragen, bis sie die Aorta bedeckt, um ein Austrocknen zu verhindern (Abbildung 4C). HINWEIS: (1) Es ist wichtig, die aufgerollte Aorta flach zu machen und sie ohne Dehnung in die Fläche zu stecken. Dieser Schritt dauert je nach Schwere der Atherosklerose einige Tage. (2) Bei Aorten von Apoe-/- oder Ldlr-/- Tieren wird empfohlen, die Aorta für 24 h flach zu befestigen. (3) Das Protokoll kann hier pausiert werden.</li>
	<li>Reinigen Sie die Objektträger des Glasmikroskops mit 70% Ethanol und empfindlichen Scheibenwischern (Abbildung 5A).</li>
	<li>Übertragen Sie die Aorta in einen Objektträger mit Reinglasmikroskop und geben Sie 15 Tropfen OCT-Verbindung (Optimal Cutting Temperature) auf einen anderen Objektträger mit Reinglasmikroskop (Abbildung 5B).</li>
	<li>Legen Sie den Objektträger des Glasmikroskops mit OCT-Verbindung vorsichtig über die Aorta und vermeiden Sie, dass Luftblasen auf dem Objektträger eingeschlossen werden (Abbildung 5C).</li>
	<li>Beschriften Sie die Folien mit Beispielnamen (Abbildung 5D). HINWEIS: Die montierten En-Face-Aorta-Dias können mehrere Monate in der Feuchtekammer bei 4 °C gelagert werden.</li>
</ol>10. Bildgebung und Läsionsquantifizierung der Enface-Aorta (Abbildung 6)
<ol><li>Erfassen Sie digitale Mikroaufnahmen mit einer Kamera, die an ein Lichtmikroskop angeschlossen ist. Speichern Sie hochauflösende Bilder, vorzugsweise im Tagged-Image-Dateiformat (TIFF) (Abbildung 6A).</li>
	<li>Übertragen Sie Bilder der mit dem Gesicht gefärbten ganzen Aorta auf einen Computer, der mit der ImageJ-Software ausgestattet ist.</li>
	<li>Wählen Sie in ImageJ das Werkzeug "Freihandauswahl" und umkreisen Sie alle Ölrot-O-gefärbten Plaketten manuell (intensive rote Flecken), während Sie die "Alt"-Taste (für Windows-PC) oder die "Shift"-Taste (für Mac) drücken. Klicken Sie dann im Menü "Analysieren" auf "Messen", um Läsionsbereiche im Ergebnisfenster anzuzeigen (Abbildung 6B links). HINWEIS: Es gibt mehrere Fallstricke bei der Quantifizierung von atherosklerotischen Läsionen: (1) Alle kleinen Stücke von gefärbtem Adventitialfett, die ab Schritt 8.7 an der Aorta haften, können zu einem falschen Hintergrund führen und die Plaquequantifizierung beeinträchtigen; (2) Das Entfernen eines Teils der Aortenwand oder die Beschädigung der Aorta durch die Schritte 6.4 und 8.7 kann die Plaquequantifizierung beeinträchtigen; (3) Blasen und Falten, die sich nach der Montage in der Aorta bilden (Schritt 9.8), können die Plaquequantifizierung stören; und (4) atherosklerotische Plaque ist ein 3D-Phänomen, und Messungen, die in einer 2D-Ebene durchgeführt werden, spiegeln möglicherweise nicht das wahre Ausmaß der Plaque wider. Zusätzlich zur Analyse des Plaquebereichs der Aorta wird empfohlen, die Plaquegröße in der Aortenwurzel, der Arteria brachiocephalica, der aufsteigenden Aorta und der Bauchaorta separat zu analysieren8.</li>
	<li>Kreisen Sie die äußere Randlinie der Aorta ein und klicken Sie im Menü "Analysieren" auf "Messen", um den Aortenbereich im Ergebnisfenster anzuzeigen (Abbildung 6B rechts).</li>
	<li>Exportieren Sie alle Messungen in eine Excel-Datei.</li>
	<li>Berechnen Sie das Verhältnis der Plaquefläche aus der gesamten Aortenfläche und normalisieren Sie den Wert als Prozentsatz der gesamten Oil Red O-Oberfläche.</li>
	<li>Berechnen Sie das Verhältnis der Plaquefläche in 8–10 Apoe-/- und 8–10 TGFβR2iSMC-Apoe-Mäusen. Präsentieren Sie die Daten als Mittelwert ± SEM (Abbildung 6C).</li>
	<li>Führen Sie einen ungepaarten Student's t-Test zur statistischen Analyse des Verhältnisses von Plaque-Area-Daten im Vergleich zu einer anderen Mausgruppe durch. Betrachten Sie die Unterschiede in den Mittelwerten als signifikant bei p < 0,05.</li>
</ol>

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<li>Andres-Manzano, M. J., Andres, V., Dorado, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oil+Red+O+and+Hematoxylin+and+Eosin+Staining+for+Quantification+of+Atherosclerosis+Burden+in+Mouse+Aorta+and+Aortic+Root%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Oil Red O and Hematoxylin and Eosin Staining for Quantification of Atherosclerosis Burden in Mouse Aorta and Aortic Root.</a> Methods in Molecular Biology. 1339, 85-99 (2015).</li>
<li>Chen, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+TGF-beta+signalling+drives+vascular+inflammation+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Endothelial TGF-beta signalling drives vascular inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Metabolism. 1, 912-926 (2019).</li>
<li>Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+neutral+lipids+by+oil+red+O+for+analyzing+the+metabolic+status+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease.</a> Nature Protocols. 8, 1149-1154 (2013).</li>
<li>Ferruzzi, J., Madziva, D., Caulk, A. W., Tellides, G., Humphrey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compromised+mechanical+homeostasis+in+arterial+aging+and+associated+cardiovascular+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biomechanics+and+Modeling+Mechanobiology%22%5BJournal%5D)">Compromised mechanical homeostasis in arterial aging and associated cardiovascular consequences.</a> Biomechanics and Modeling Mechanobiology. 17, 1281-1295 (2018).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Apolipoprotein E (Apoe) und Low Density Lipoprotein Rezeptor (Ldlr) defiziente Mäuse sind nützlich für die Untersuchung der Entwicklung und Behandlung von Atherosklerose. Forscher können die Auswirkungen von Genetik und therapeutischen Manipulationen auf die Initiierung, Progression und Regression von Atherosklerose-bedingten Krankheiten unter Verwendung der Öl-Rot-O-Färbung der gesamten Aorta bewerten9. Aorta Oil Red O Färbung und Läsionsquantifizierung ist der Goldstandard-Endp...

Koronare Herzkrankheit, eine der Haupttodesursachen in den USA, wird in der Regel durch Atherosklerose verursacht, ein Prozess, der zur Bildung von Plaque in den Arterienwänden führt1. Hyperlipidämie-anfällige Apoe- und Ldlr-defiziente Mäuse sind von zentraler Bedeutung für die Untersuchung von Atherosklerose und ihren Komplikationen und die Entwicklung von Therapien2,3,4,5. Die Quantifizierung atherosklerotischer Läsionen aus einer En-face-Aorta ist eine wichtige Endpunktanalyse zur Bewertung der Auswirkungen genetischer Manipulation in verschiedenen Zelltypen. Es hilft auch, neuartige Therapien zu untersuchen, die die Initiierung, Progression und Regression atherosklerotischer Erkrankungen beeinflussen sollen. Atherosklerotische Läsionen können sich überall in der Aorta und ihren Ästen bilden (d. h. brachiozephalis, Halsschlagadern und Subclavia-Arterien in der Brust sowie Nieren-, gemeinsame Becken- und Oberschenkelarterien unterhalb des Zwerchfells)6. Eine umfassende Bewertung der Atherosklerosebelastung und eine geeignete Therapie erfordern eine Beurteilung der Krankheitslast an verschiedenen Orten, eine Herausforderung, die oft übersehen wird.
Dieses Protokoll beschreibt, wie eine umfassende Analyse von atherosklerotischen Läsionen, beginnend mit einer ungeöffneten ganzen Aorta und bis zur Vorbereitung des Gesichts, in einer einzigen Maus durchgeführt wird. Die ungeöffnete Färbung der gesamten Aorta Oil Red O ermöglicht eine schnelle, qualitative Beurteilung von lipidbeladenen Plaques in der gesamten Aorta und ihren Ästen, während die Flächenvorbereitung eine quantitative Beurteilung der atherosklerotischen Läsionsverteilung in der Mausaorta ermöglicht.
Die Technik verwendet 8 Wochen alte Mäuse mit einer glatten Muskelzell-spezifischen TGFβR2-Deletion auf dem Apoe-/- hyperlipidämischen Hintergrund (MYH11-CreERT2; Tgfbr2f/f;mT/mGf/f; Apoe-/-; im Folgenden als TGFβR2iSMC-Apoe-Mäuse bezeichnet) und Littermate Apoe-/- Kontrollen (MYH11-CreERT2;mT/mGf/f; Apoe-/-; im Folgenden als Apoe-/- Mäuse bezeichnet). Die Tiere werden 16 Wochen lang mit einer cholesterinreichen fettreichen Diät (HCHFD) als Studienmaterial gehalten7. Am Ende der Studie werden die ungeöffneten ganzen Aorten gefärbt und (einschließlich aller Hauptzweige) mit Oil Red O zur qualitativen Beurteilung von lipidbeladenen Plaques abgebildet. Die Aorten werden durch En-Face-Vorbereitung aufgeschnitten und alle atherosklerotischen Läsionen werden abgebildet und quantifiziert. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die atherosklerotische Läsionsentwicklung in Apoe-/- oder Ldlr-/- Hyperlipidämie-Mäusemodellen zu untersuchen und auf allgemeine aortabezogene vaskuläre Biologieanwendungen auszudehnen.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Eppendorf Tube</td><td>DENVILLE</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Spritze</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>16% Formaldehyd</td><td>Polysciences</td><td>18814-10</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>VWR</td><td>RC2546.70-5</td><td>Zur Reinigung der Sezierwerkzeuge</td></tr><tr><td>Schwarzes Sezierwachs</td><td>CR Scientific</td><td>C3541</td><td></td></tr><tr><td>Maisöl</td><td>Sigma</td><td>C8267</td><td>Lösungsmittel für Tamoxifen</td></tr><tr><td>DNeasy Blut & Taschentuch-Set</td><td>QIAGEN</td><td>69506</td><td>Zur Isolierung von DNA aus dem Mausohr</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1X DPBS), pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Feine Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14059-11</td><td>Zum Schneiden der Maushaut und zum Öffnen des Brustkorbs</td></tr><tr><td>Fisherbrand Economy Plain Glass Mikroskop Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterinreiche Ernährung mit hohem Fettgehalt</td><td>Forschung Diäten</td><td>D12108</td><td>Zur Induktion von Arteriosklerose</td></tr><tr><td>Bildgebung Software</td><td>National Institutes of Health</td><td>Image J</td><td>Quantifizierung von Aortenläsionen</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>VWR</td><td>JT9079-5</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td>Zum Reinigen der Glasobjektträger</td></tr><tr><td>McPherson-Vannas Micro Dissecting Federschere</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5602</td><td>Zum Trennen des Herzens und der Aorta und des Aufschneidens der Aorta und der Aortenäste</td></tr><tr><td>Steuerungssoftware für Mikroskope</td><td>Olympus</td><td>DP Controller</td><td>Für die Aortenbildgebung</td></tr><tr><td>Minutien pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Needle-25G</td><td>BD</td><td>305124</td><td></td></tr><tr><td>NonWoven Sponge</td><td>McKesson</td><td>94442000</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma</td><td>O-0625</td><td>Zum Färben von Atherosklerose-Läsionen</td></tr><tr><td>Pall Acrodisc Sterile Spritze Filter mit Supermembran</td><td>VWR</td><td>28143-312</td><td>Zum Filtern von Arbeitsöl Rot O Lösung</td></tr><tr><td>Federschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15021-15</td><td>Zum Sezieren und Reinigen der Aorta</td></tr><tr><td>Statistische Software</td><td>GraphPad</td><td>Prism 8</td> Stereomikroskop für <td>die statische Analyse</td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>SMZ1000</td><td>Für die Dissektion der Aorta</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>Für die Bildgebung der Aorta</td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td>Zur Induktion der Cre-loxP-Rekombination</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound, Sakura Finetek</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette Style 4</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>0302-4-PO</td><td>Zum Schneiden der Maushaut und zum Öffnen des Brustkorbs</td></tr><tr><td>Pinzette Style 5</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>0302-5-PO</td><td>Zum Präzieren und Reinigen Die Aorta</td></tr></tbody></table>

bildgebung und analyse von ölrot-o-gefärbten ganzen aortenläsionen in einem aneurysma-hyperlipidämie-mausmodell

Imaging and Analysis of Oil Red O-Stained Whole Aorta Lesions in an Aneurysm Hyperlipidemia Mouse Model

Apolipoprotein E (Apoe)- oder Low Density Lipoprotein Receptor (Ldlr)-defiziente hyperlipidämische Mäuse sind die beiden am häufigsten verwendeten Modelle für die Atheroskleroseforschung. Sie werden verwendet, um den Einfluss verschiedener genetischer Faktoren und verschiedener Zelltypen auf die atherosklerotische Läsionsbildung zu untersuchen und die Entwicklung neuer Therapien zu testen. Isolierung, Exzision der gesamten Aorta und Quantifizierung von Oil Red O-gefärbten atherosklerotischen Läsionen sind grundlegende morphometrische Methoden zur Bewertung der atherosklerotischen Belastung. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine optimierte, schrittweise chirurgische Methode zu beschreiben, um atherosklerotische Läsionen in Mausaorten mit Oil Red O zu sezieren, zu fixieren, zu isolieren, zu färben, abzubilden und zu analysieren. Da sich atherosklerotische Läsionen überall im gesamten Aortenbaum bilden können, hat diese gesamte Aorta-Öl-Rot-O-Färbemethode den Vorteil, dass lipidbeladene Plaques in der gesamten Aorta und allen Zweigen in einer einzigen Maus bewertet werden. Zusätzlich zur Öl-Rot-O-Färbung können frisch isolierte ganze Aorten für eine Vielzahl von In-vitro- und In-vivo-Experimenten und Zellisolierungen verwendet werden.

In diesem Protokoll wurden atherosklerotische Läsionen in TGFβR2iSMC-Apoe-Mäusen nach 4 Monaten mit einer HCHF-Diät analysiert7. Neben einer ausgedehnten Atherosklerose entwickelten diese Mäuse, wie bereits berichtet, sowohl thorakale als auch abdominale Aortenaneurysmen. Im Vergleich zu Apoe-/- Mäusen zeigten die Aortenwände der TGFβR2iSMC-Apoe-Mäuse eine schwere Atherosklerose, was die Sezierung der Läsionen erschwerte (Abbildung 2C,D,E...

Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Analyse der atherosklerotischen Belastung bei Mäusen. Ermittler können dieses Protokoll verwenden, um die Häufigkeit, den Ort und die Größe von atherosklerotischen Läsionen bei verschiedenen Tieren zu vergleichen.

Bildgebung und Analyse von ölrot-o-gefärbten ganzen Aortenläsionen in einem Aneurysma-Hyperlipidämie-Mausmodell

Apolipoprotein E (Apoe)- or low density lipoprotein receptor (Ldlr)-deficient hyperlipidemic mice are the two most commonly used models for ...

Die Quantifizierung atherosklerotischer Läsionen in apoE und anderen Arten von hyperlipidämischen Mäusen ist der Schlüssel zur Beurteilung verschiedener genetischer Faktoren und neuer Therapien. Unser Protokoll bietet Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Analyse der atherosklerotischen Belastung in qualitativer und quantitativer Weise in einer einzigen Maus. 16 Wochen nach der Induktion von Atherosklerose, bevor Sie das Herz durchbluten, laden Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit 10 Millilitern DPBS und befestigen Sie eine 25-Gauge-Nadel.Heben Sie die Bauchhaut der experimentellen Maus mit einer Pinzette an und schneiden Sie mit einer feinen Schere die Haut von der Bauchbasis bis zur Halsspitze. Öffnen Sie die Bauchdecke unterhalb des Brustkorbs und heben Sie mit der Pinzette das Brustbein an, um Zugang zum Zwerchfell zu erhalten. Schneiden Sie die Membran ab und schneiden Sie den Brustkorb weg, um die Brusthöhle freizulegen.Als nächstes machen Sie einen kleinen Schnitt in den rechten Vorhof des Herzens und injizieren Sie langsam das gesamte Volumen von DPBS in die apikale linke ventrikuläre Punktion. Die Leber und die Niere färben sich hellbraun. Wenn die gesamte Kochsalzlösung d

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Research

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JoVE Journal

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Die Ex-vivo-Analyse von arteriellen Läsionen aus Tiermodellen für Herz-Kreislauf-Erkrankungen stützt sich klassischerweise auf histologische und immunhistochemische Techniken. Diese ermöglichen 2-dimensionale Messungen in 3-dimensionalen Läsionen. Dieses Manuskript beschreibt die Erzeugung von arteriellen Läsionen für die quantitative Analyse in 3-Dimensionen mittels optischer Projektionstomographie.

Generation und 3-Dimensional Quantifizierung der arterielle Läsionen in Mäuse mit optischen Projektionstomographie

Wir beschreiben Verfahren zur Quantifizierung und Charakterisierung atherosklerotischer Läsionen in Mausmodellen durch Präzisionsschnitte der Aortenhöhle und der aufsteigenden Aorta in Kombination mit histochemischer und immunhistochemischer Analyse.

Quantitative Analyse und Charakterisierung atherosklerotischer Läsionen im murinen Aortensinus

Dieses Video zeigt zwei Modelle der Intima Plaqueentwicklung in murinen Arterien und betont die Unterschiede in myointimale Hyperplasie und Atherosklerose.

Induktion Myointimale Hyperplasie Versus Atherosklerose in Mäuse: Eine Einführung von zwei gültigen Modelle

Tiermodellen erwiesen haben wertvolle Werkzeuge bei der Definition von Wirt und Pathogen-spezifische Mechanismen, die zur Entstehung der chronischen Entzündung beitragen. Hier beschreiben wir ein Mausmodell der oralen Infektion mit dem menschlichen Erreger Porphyromonas gingivalis und Detail Methoden, um das Fortschreiten der Entzündung an lokalen und systemischen Websites zu beurteilen.

Einem Mausmodell für Pathogen-induzierten chronischen Entzündung an lokalen und systemischen Seiten

Wir beschreiben ein Protokoll zur Atherosklerose in die Aortenwurzel von ApoE- / - Mäusen gefüttert mit einem atherogenen Diät durch eine kontinuierliche Freisetzung von Aldosteron zu induzieren. Methoden zur Charakterisierung von Plaque Zusammensetzung werden ebenfalls beschrieben.

Induktion von atherosklerotischen Plaques durch Aktivierung von Mineralocorticoid-Rezeptoren im Apolipoprotein E-defizienten Mäusen

Wir schlagen ein standardisiertes Protokoll zur Charakterisierung der zellulären Zusammensetzung der Spätphase murinen atherosklerotische Läsionen einschließlich systematische Methoden der tierischen Dissektion, Gewebe einbetten, schneiden, Färbung und Analyse der Brachiocephalic Arterien Atheroprone glatten Muskulatur Zelle Abstammung Ablaufverfolgung Mäuse.

Quantitative Analyse der zellulären Zusammensetzung in fortgeschrittene atherosklerotische Läsionen der glatten Muskulatur Zelle Abstammung-Tracing Mäuse

Murine Modelle der Arteriosklerose sind nützliche Werkzeuge, um pathogene Pfade auf molekularer Ebene zu untersuchen, erfordern aber eine standardisierte Quantifizierung der Läsionsentwicklung. Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zur Bestimmung der Läsionsgröße in den hauptartiellen Gefäßen, einschließlich der Aortenwurzel, des Aortenbogens und der brachiocephalen Arterie.

Quantifizierung von Atherosklerose bei Mäusen

In dieser Arbeit stellen wir optimierte Gewebe-Clearing-Protokolle vor, um die murine Aorta in drei Dimensionen (3D) abzubilden. Wir beschreiben modernste Verfahren zur Immunfärbung, optischen Klärung und Bildgebung mit dem Ziel, die anatomische Nähe des peripheren Nervensystems zu atherosklerotischen Plaques und die Adventitia bei Atherosklerose zu definieren.

Dreidimensionale Bildgebung von Aortengewebe bei Atherosklerose

Dieses Protokoll bietet eine umfassende Methodik für die quantitative Analyse von atherosklerotischen Plaques, um eine tiefergehende Erforschung der Mechanismen und des Fortschreitens der Atherosklerose zu ermöglichen.

Isolierung und Analyse von Aortenbogen- und Wurzelläsionen in einem atherosklerotischen Mausmodell

Ein experimentelles Mausmodell von Knochenmetastasen wurde nach intrakardialen Lieferung von Luciferase exprimierenden Mammatumorzellen gegründet. Tumorentstehung und führte Osteolyse wurden in Längsrichtung mit Biolumineszenz-und Mikro-CT-Bildgebung überwacht.

Überwachung Tumormetastasen und Osteolysen mit Biolumineszenz und Micro-CT Imaging

Lernen Sie die Bildgebung und Analyse von atherosklerotischen Läsionen in hyperlipidämischen Mäusen. Diese Methode ermöglicht die quantitative Bewertung von Plaques und unterstützt die Erforschung genetischer Faktoren sowie neuer Therapien.

Bildgebung und Analyse von ölrot-o-gefärbten ganzen Aortenläsionen in einem Aneurysma-Hyperlipidämie-Mausmodell

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