Name: Vorbereitung von tunable Extracellular Matrix Microenvironments zur Bewertung der Schwann Cell Phänotyp Specification (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung abstimmbarer extrazellulärer Matrix-Mikroumgebungen zur Untersuchung der Schwann-Zell-Phänotypspezifikation. Diese kostengünstige Methode ermöglicht präzise Kontrolle von Substratsteifigkeit und Proteinzusammensetzung.

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Die Autoren danken der Förderung durch die Universität Cincinnati. Die Autoren danken auch Ron Flenniken von der University of Cincinnati Advanced Materials Characterization Laboratory für die Unterstützung.

Die Autoren berichteten über keinen möglichen Interessenkonflikt.

SCs können die Nervenregeneration aufgrund ihrer phänotypischen Transformation und des regenerativen Potenzials nach Einer Nervenverletzung fördern. Wie ECM-Cues diese regenerative Neutungsfähigkeit regulieren, bleibt jedoch weitgehend unklar, was möglicherweise nicht nur die Entwicklung von Biomaterialien behindert, die die Nervenregeneration fördern sollen, sondern auch das Verständnis der Mechanismen, die an der Nervenregeneration beteiligt sind. Um dieses Zusammenspiel zu untersuchen, wurden Zellkultursubstrate gesch...

Verletzungen des peripheren Nervensystems (PNS) stellen nach wie vor eine große klinische Herausforderung im Gesundheitswesen dar, da sie die Lebensqualität der Patienten gefährden und durch eine Vielzahl sozioökonomischer Faktoren eine signifikante Wirkung erzielen1,2. Schwann-Zellen (SC), als die wichtigsten Gliazellen im PNS, bieten notwendige molekulare und physikalische Hinweise, um die PNS-Regeneration zu induzieren und bei funktionellen Erholungen bei Kurzspaltverletzungen zu helfen. Dies ist auf die bemerkenswerte Fähigkeit von SCs zurückzuführen, sich in einen "Reparatur"-Zellphänotyp von einem myelinisierenden oder Remak-Phänotyp3zu unterscheiden. Die Reparatur SC ist ein unverwechselbarer Zellphänotyp in mehrfacher Hinsicht. Nach der Verletzung erhöhen SCs ihre Proliferationsrate, indem sie wieder in den Zellzyklus eintreten und mit der Expression mehrerer Transkriptionsfaktoren beginnen, um die Reinnervation zu erleichtern. Diese Faktoren, wie c-Jun und p75 NTR, sind hochreguliert, während myelinierende SC-Marker, wie Myelin-Basisprotein (MBP), nach unten reguliert werden4,5. Darüber hinaus ändern SCs die Morphologie, um sich zu verlängen und aufeinander auszurichten, um Büngner-Bänder über die Verletzungsstelle6zu bilden. Dies bietet einen physikalischen Leitmechanismus für die Axone, um sich auf das richtige distale Ziel7auszudehnen. Trotz der Fähigkeit, die SCs besitzen, um die Nervenregeneration bei Kurzstreckenverletzungen zu fördern, bleibt das Ergebnis der funktionellen Erholung bei schweren Verletzungen schlecht. Dies ist zum Teil auf den Verlust von extrazellulären Matrix (ECM) Leitfäden zurückzuführen, sowie die Unfähigkeit von SCs, den regenerativen Phänotyp über lange Zeiträume zu erhalten8.
Der Nervenregenerations- und Erholungsprozess ist eng mit dem Zustand der Basallamina nach verletzungen verbunden. Die Basallamina ist eine Schicht eCM um den Nerv, die die Führung erleichtert und ECM-gebundene Hinweise für Axone und SCs in Fällen liefert, in denen sie nach Verletzung intakt bleibt9. Der Zustand des ECM und seine Fähigkeit, Matrix gebundene Hinweise an Zellen zu liefern, ist von entscheidender Bedeutung und wurde zuvor in einer Vielzahl von verschiedenen Kontexten10,11,12,13,14untersucht. Beispielsweise wurde gezeigt, dass die Steifigkeit des ECM Zellfunktionen wie Proliferation und Differenzierung11,15,16steuern kann. Die Zusammensetzung des ECM kann auch zu einer deutlichen zellulären Reaktion führen und Zellverhalten wie Migration und Differenzierung durch intrazelluläre Signalwege17,18regulieren. Darüber hinaus spielt die Zellmorphologie, einschließlich Verbreitungsgebiet und zellulärer Dehnung, eine wichtige Rolle bei der Regelung der Funktion und kann durch ECM-gebundene Hinweise19,20geregelt werden. Viele frühere Studien haben sich auf Stammzellen konzentriert, die sich in definierte Abstammungslinien differenzieren, aber SCs besitzen eine ähnliche Fähigkeit, Phänotyp von einem homöostatischen, erwachsenen SC innerhalb eines gesunden Nervs zu einem Reparatur-SC zu verändern, der in der Lage ist, Proteine und Wachstumsfaktoren zu sezernieren, während das ECM nach einer Nervenverletzung5,21umgestaltet wird. Daher ist es besonders wichtig, Mechanismen zu identifizieren, die der Beziehung zwischen der angeborenen SC-Regenerationsfähigkeit und eCM gebundenen Hinweisen für die Einsicht zugrunde liegen, um diese Fähigkeit zur Nervenregeneration letztendlich zu nutzen.
Um diesem Problem zu begegnen, haben wir eine detaillierte Methodik entwickelt, um ein Zellkultursubstrat zu produzieren, bei dem mechanische Steifigkeit und Ligandentyp leicht in physiologisch relevanten Bereichen abgestimmt werden können. Polydimethylsiloxan (PDMS) wurde aufgrund seiner hochgradig einstellbaren Mechanik im Vergleich zu Polyacrylamid-Gel als Substrat gewählt, wobei der maximale Young-Modul etwa 12 kPa beträgt, der mit PDMS bei etwa 1000 kPa22,23,24kontrastiert wird. Dies ist von Vorteil für die vorstehende Arbeit, da neuere Studien gezeigt haben, dass der Young-Modul eines Kaninchen-Ischiasnervs während der Entwicklung 50 kPa überschreiten kann, was darauf hindeutet, dass der Steifigkeitsbereich der Nerven innerhalb des PNS größer ist als bisher untersucht. Verschiedene Proteine sind in der Lage, auf PDMS-Substrate natobieren, um die kombinatorische Regulierung von Mechanik und Liganden auf SC-Verhalten zu analysieren. Dies ermöglicht die Untersuchung mehrerer mikroökologischer Hinweise im PNS-Regenerationsprozess und den Vergleich eines hohen Grades an Tunabilität mit der Arbeit, die sich ausschließlich auf die Steifigkeit des Substrats25konzentriert. Darüber hinaus sind diese technisch entwickelten Zellkultursubstrate mit einer Vielzahl von quantitativen Analysemethoden wie Immunhistochemie, Western Blot und quantitative Polymerase-Kettenreaktion (q-PCR) kompatibel.
Diese entwickelte Zellkulturplattform eignet sich aufgrund der hohen individuellen Abstimmungsfähigkeit jedes ECM-gebundenen Signals hervorragend zur Analyse mechanistischer Bahnen. Darüber hinaus können auf den Substraten gängige Methoden für das Zellmikromusterung, einschließlich des Mikrokontaktdrucks, erreicht werden, um eine kontrollierte zelluläre Haftung zu ermöglichen, um die Zellform im Verhältnis zu anderen ECM-gebundenen Cues24zu analysieren. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da liniengemusterte Substrate, die die Dehnung in Zellpopulationen fördern, ein Werkzeug zur Nachahmung und Untersuchung von länglichen und regenerativen SCs innerhalb von Büngner-Bändern während der Nervenregeneration darstellen. Darüber hinaus ist die zelluläre Morphologie ein potenter Regler mehrerer Zellfunktionen und kann potenziell verwirrende experimentelle Ergebnisse liefern, wenn sie nicht kontrolliert26,27. Den Mechanismen, die den regenerativen Phänotyp SC gemäß den ECM-Cues28,29,30regeln, wird nun große Aufmerksamkeit geschenkt. Dies ist wichtig, um Einblicke in die Gestaltung von Biomaterialien zu geben, die als Nervenleitschläuche zur Unterstützung der PNS-Nervenregeneration eingesetzt werden können. Diese detaillierten Protokolle können letztlich als potenzielles Werkzeug zur Entschlüsselung der Mechanismen der SC- und anderer Zelltypfunktionen eingesetzt werden, wie sie durch ECM-gebundene Cues reguliert werden.

<table><tbody><tr><td>Albumin aus Rinderserum (BSA), Texas Rotes Konjugat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A23017</td><td>BSA-Färbung zur Darstellung von Mikromustern</td></tr><tr><td>Anti-Maus-IgG, HRP-linked Antikörper</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>7076S</td><td>Antikörper für die Western-Blot-Analyse</td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen-IgG, HRP-linked Antikörper</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>7074S</td><td>Antikörper für die Western-Blot-Analyse</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B23151</td><td>Reagenz zur Messung der Zellproliferation</td></tr><tr><td>BrdU-Primärantikörper, konjugiert mit Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B35130</td><td>Zur Visualisierung von BrdU in Zellproliferationsassays</td></tr><tr><td>Kollagen I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10483-01</td><td>Protein zur Beschichtung von Deckgläsern</td></tr><tr><td>Druckkraftprüfmaschine</td><td>TestResources</td><td></td><td>Instrument zur Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften von Polymeren</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td>Zellkulturmedium</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td><td>Zellkulturmedium ergänzend</td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33010-018</td><td>Protein zur Beschichtung von Deckgläsern</td></tr><tr><td>Fluoreszenz Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti2</td><td>Fluoreszenzmikroskop</td></tr><tr><td>Halt Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78440</td><td>Protease- und Phosphatase-Inhibitor</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23017015</td><td>Protein zur Beschichtung von Deckgläsern</td></tr><tr><td>Eindeckmedium mit DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36971</td><td>Deckglas-Eindeckmittel und Zellkernfärbung</td></tr><tr><td>Maus c-Jun Primärantikörper</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>711202</td><td>Primärantikörper zur Visualisierung des c-Jun-Proteins</td></tr><tr><td>Maus &beta;-Aktin-Primärantikörper</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3700S</td><td>Beladungskontrolle für Western-Blot-Experimente</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Zellkulturmedium ergänzend</td></tr><tr><td>Photoresist SU 2010</td><td>KAYAKU</td><td>SU8-2010</td><td>Photoresist</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-2443</td><td>Block unspezifische Proteinbindung</td></tr><tr><td>Kaninchen c-Jun primärer Antikörper</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9165S</td><td>Primärer Antikörper zur Visualisierung von c-Jun</td></tr> Protein <tr><td>Kaninchen Myelin basisches Protein Primärer Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab40390</td><td>Primärer Antikörper zur Visualisierung von MBP</td></tr><tr><td>Kaninchen p75NTR Primärantikörper</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8238S</td><td>Primärer Antikörper zur Visualisierung von p75NTR</td></tr><tr><td>Rhodamin Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R415</td><td>Visualisierung des Zellzytoskeletts</td></tr><tr><td>RIPA Puffer</td><td>Abcam</td><td>ab156034</td><td>Zelllysepuffer</td></tr><tr><td>RT4-D6P2T Schwann Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>CRL-2768</td><td>Zelllinie verwendet in Experimente</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 PDMS-Basis und Härter</td><td>Sigma Aldrich</td><td>761036</td><td>Tunables Polymer zur Beschichtung von Deckgläsern</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15090-046</td><td>Zelldissoziationsreagenz</td></tr><tr><td>UV-Ozon-Reiniger</td><td>Novascan</td><td></td><td>Erhöhung der Hydrophizilität von PDMS</td></tr><tr><td>Versene (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15040066</td><td>Zelldissoziation Reagenz</td></tr></tbody></table>

vorbereitung von tunable extracellular matrix microenvironments zur bewertung der schwann cell phänotyp specification

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Traumatische Verletzungen des peripheren Nervensystems (PNS) verfügen derzeit nicht über geeignete Behandlungen, um die volle funktionelle Genesung wiederzuerlangen. Schwann-Zellen (SCs), als die wichtigsten Gliazellen des PNS, spielen eine wichtige Rolle bei der Förderung der PNS-Regeneration, indem sie sich nach einer Verletzung zu einem regenerativen Zellphänotyp verleiten. Der dedifferenzierte Zustand von SCs ist jedoch eine Herausforderung für die Regeneration sanierbare Zeit und wird durch Veränderungen in der umgebenden extrazellulären Matrix (ECM) beeinflusst. Daher ist es von wesentlicher Bedeutung, das komplexe Zusammenspiel zwischen SCs und unterschiedlichem ECM zu bestimmen, um Hinweise auf das regenerative Potenzial von SCs zu liefern. Um diesem Problem zu begegnen, wurde eine Strategie entwickelt, bei der verschiedene ECM-Proteine auf ein abstimmbares Polydimethylsiloxan (PDMS)-Substrat adsorbiert wurden, das eine Plattform bot, auf der Steifigkeit und Proteinzusammensetzung moduliert werden können. SCs wurden auf die abstimmbaren Substrate gesät und kritische zelluläre Funktionen, die die Dynamik des SC-Phänotyps darstellen, wurden gemessen. Zur Veranschaulichung des Zusammenspiels zwischen SC-Proteinexpression und zellulärer Morphologie wurden neben individuellen mikrokontaktbedruckten Zellmustern auch unterschiedliche Sädichten von SCs verwendet und durch Immunfluoreszenzfärbung und Western Blot gekennzeichnet. Die Ergebnisse zeigten, dass Zellen mit einer kleineren Verbreitungsfläche und einem höheren Ausmaß der zellulären Dehnung höhere Konzentrationen von SC-regenerativen phänotypischen Markern förderten. Diese Methode beginnt nicht nur, die signifikante Beziehung zwischen dem ECM und der zellulären Funktion von SCs zu entwirren, sondern liefert auch Richtlinien für die zukünftige Optimierung von Biomaterialien in der peripheren Nervenreparatur.

Um das Zusammenspiel zwischen Substratsteifigkeit und Proteinzusammensetzung auf SC-Phänotyp zu analysieren und zu quantifizieren, wurde ein abstimmbares PDMS-Zellkultursubstrat entwickelt (Abbildung 1A). Kompressionsprüfung des Polymers auf unterschiedlicher Basis: Härtungsmittelverhältnisse wurden verwendet, um den Young-Modul (E) des Substrats zu quantifizieren (Abbildung 1B). Der resultierende Modulbereich stellt physiologisch relevante Substratbedingungen d...

Diese Methode soll die Mechanismen veranschaulichen, mit denen extrazelluläre Matrix-Cues wie Substratsteifigkeit, Proteinzusammensetzung und Zellmorphologie Schwann-Zell(SC)-Phänotyp regulieren.

Vorbereitung von tunable Extracellular Matrix Microenvironments zur Bewertung der Schwann Cell Phänotyp Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...

Dieses Protokoll bietet eine Zellkulturplattform, auf der die Eigenschaften der extrazellulären Matrix wie Steifigkeit, Proteinzusammensetzung und Zellmorphologie kostengünstig und einfach gesteuert werden können. Die Methode ist kostengünstig und erfordert keine spezielle Schulung oder Einrichtungen. Es ist auch kompatibel mit mehreren zellulären Quantifizierungsmethoden wie immunfluoreszierende Färbung und Western Blot.Diese Technik vermittelt ein mechanistisches Verständnis der Schwann-Zellbiologie. Mit zusätzlichen Einblicken in das Biomaterialdesign für die Regeneration des Nervensystems kann es auf jede verankerungsabhängige Zelle angewendet werden. Der schwierigste Teil dieses Protokolls ist der Mikrokontaktdruck.Vor Beginn des Protokolls wird der Mikrokontaktdruck auf substratisch mit einem Florescent verwendet, um das Protein zu markieren, um den endgültigen Druck visuell auf das Muster zu überprüfen. Beginnen Sie mit dem kräftigen Mischen des PDMS-Basiselastomers und der Härtungsmittel mit einer Pipettenspitze, bis Blasen in der Mischung homogen dispergiert werden. Dann entfernen Sie die Blasen mit Vakuum-Austrocknung.Legen Sie einen Tropfen der ausgetrockneten PDMS-Mischung auf einen quadratischen oder kreisförmigen Deckel, und drehen Sie den Deckelaufschlag auf einem Spincoater auf 2 500 U/min für 30 Sekunden. Inkubieren Sie den Deckel entweder in einem Ofen bei 60 Grad Celsius, für ein bis zwei Stunden oder bei Raumtemperatur über Nacht. Um ein mikrogemustertes Substrat herzustellen, legen Sie einen gemusterten Siliziumwafer in eine kreisförmige 150 Millimeter Durchmesser von 15 Millimeter Höhe Petrischale und gießen Entgasung PDMS auf den Wafer.Erstarrte das PDMS in einem Ofen bei 60 Grad Celsius über Nacht. Lassen Sie das PDMS auf Raumtemperatur abkühlen. Verwenden Sie dann ein chirurgisches Skalpell, um Stempel von 30 mal 30 Millimeter Quadraten zu schneiden, die die richtigen Muster enthalten, wobei darauf geachtet wird, den Siliziumwafer nicht zu beschädigen.Sterilisieren Sie die PDMS-Stempel und abstimmbaren Deckelzettel, indem Sie sie 30 Minuten lang in 70% Ethanol eintauchen. Um die Wirksamkeit des Mikromusters zu bestätigen, trocknen Sie die Oberfläche der PDMS-Stempel mit einem gefilterten Luftstrom und einer Pipette mit 15 Mikrogramm pro Milliliter BSA-Lösung, um die gesamte gemusterte Seite des Stempels abzudecken. Inkubieren Sie die Stempel mit der BSA-Lösung für eine Stunde bei Raumtemperatur, um eine Proteinadsorption zu ermöglichen, und trocknen Sie dann die Stempel lufttrocken, um die BSA-Lösung zu entfernen.Verwenden Sie den gefilterten Luftstrom, um die Oberfläche der abstimmbaren Abdeckschlips zu trocknen. Bringen Sie die gemusterte Seite des Stempels in konformen Kontakt mit dem abstimmbaren Deckblatt, um eine BSA-Adsorption auf der Deckslip-Oberfläche zu ermöglichen, und drücken Sie den Stempel vorsichtig fünf Minuten lang gegen den Deckelzettel. Untersuchen Sie das Mikromuster mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einem FITC-Filter.Zum Drucken von Zellklebstoffbereichen anstelle von fluoreszierenden Mustern ersetzt Laminin für BSA-Protein. Entfernen Sie die Stempel aus den Deckelscheinen und übertragen Sie die Deckelschlipse in eine sterilisierte Sechs-Brunnen-Platte. Fügen Sie zwei Milliliter 0,2%Pluronische F-127-Lösung in jeden Brunnen ein, um die Oberfläche des Deckschlupfs zu bedecken und die Platte für eine Stunde bei Raumtemperatur zu inkubieren.Die F-127-Lösung ansaugen und die Abdeckung fünfmal mit PBS waschen, einmal mit dem Zellkulturmedium, säen Sie dann die Schwann-Zellen mit einer Saatdichte von 1000 Zellen pro Zentimeter quadratisch. 45 Minuten nach dem Aussaat der Zelle entfernen Sie das Zellkulturmedium und waschen Sie die Abdeckungsrutschen zweimal mit PBS, um zu verhindern, dass mehrere Zellen am gleichen Muster haften. Bewahren Sie Zellen in der gewünschten Zellkulturumgebung 48 Stunden vor der Quantifizierung auf.Um liniengemusterte Zellkultursubstrate für die Untersuchung ausgerichteter Zellen zu erstellen, erstellen Sie die Stempel entsprechend den Manuskriptrichtungen und schneiden sie auf die gewünschten Dimensionen. Bereiten Sie zwei Petrischalen vor, die wie zuvor mit einer abstimmbaren PDMS-Oberfläche beschichtet sind, und führen Sie Mikrokontaktdruck durch, um liniengemusterte Zellklebstoffbereiche auf einem der Gerichte zu drucken. Nach dem Entfernen der Stempel die Petrischale mit vier Millilitern 0,2%Pluronischer F-127-Lösung füllen und eine Stunde lang inkubieren.Spülen Sie jede Seite der PDMS-Marke dreimal mit 70% Ethanol und trocknen Sie sie mit Luft. Drehen Sie die PDMS-Stempel und drucken Sie den ungemusterten Zellklebstoffbereich auf der zweiten Petrischale, wie zuvor beschrieben. Nach dem Inkubieren der Gerichte mit der F-127-Lösung die Lösung entfernen und das Geschirr dreimal mit PBS und einmal mit frischzelligem Kulturmedium waschen.Dann Samenzellen auf den Tellern, und halten Sie sie zu den gewünschten Bedingungen für 48 Stunden vor der Zubereitung von Lysaten. Um Lysate vorzubereiten, waschen Sie die Zellen mit eiskaltem PBS für zwei Minuten, fügen Sie dann 80 Mikroliter RIPA-Lösung, die nach den Manuskriptanweisungen zubereitet wird, auf jeden Zellklebstoffbereich ein und inkubieren Sie die Zellen auf einem Eisblock für 25 Minuten. Die Schwann-Zellen mit dem Zellschaber fünf Minuten lang zerkleinern und das Lysat in einem beschrifteten 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr sammeln.Zentrifugieren Sie das Lysat für 15 Minuten bei 12 tausendmal G und vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand und übertragen Sie ihn in ein sauberes Mikrozentrifugenrohr. Lamininbeschichtete Substrate führten zu einer höheren Proliferationsrate im Vergleich zu Kollagen- und Fibronectin-beschichteten Substraten.Schwann-Zellen auf Substraten mit Lamininbeschichtung und unterschiedlichen Moduli zeigten, dass relativ weichere Substrate die Zellproliferationsraten verringerten. Die Zellen wurden auch auf Proteinexpression analysiert. Der Transkriptionsfaktor c-Jun-Expression wurde hochreguliert, da Substrate weicher wurden.Auf den weichsten Substraten wurde es jedoch deutlich nach unten reguliert. Auf steifen Substraten ergaben kollagenbeschichtete Substrate den höchsten c-Jun-Ausdruck, da Substrate weicher wurden, zeigte Laminin die höchsten Konzentrationen von c-Jun. Die Zellen wurden dann mit Rhodaamin-Phalloidin gefärbt, um die Rolle der Zellausbreitung und der Fläche in der c-Jun-Expression zu erforschen.Beim Erstellen von Zellklebelinien auf den Zellkultursubstraten nahm das Kernwertverhältnis der zellen, die auf dem Mustersubstrat gesät wurden, im Vergleich zu dem von Zellen auf ungemusterten Substraten zu. Die Expression von c-Jun und p75 Neurotrophin-Rezeptor wurden in dichten Zellen mit einem kleineren Verbreitungsgebiet hochreguliert. Liniengemusterte Zellen führten auch zu einer höheren Expression von c-Jun und p75 NTR im Vergleich zu nicht gemusterten Zellen.Mikrokontakt-gedruckte Zellklebstoffgeometrien wurden entwickelt, um Zellstreufläche und Dehnung präzise zu steuern und gleichzeitig Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen zu eliminieren. Die Erhöhung des zellulären Seitenverhältnisses führte zu einer Erhöhung der nuklearen Dehnung. Die Expression von c-Jun wurde sowohl durch zelluläre Dehnung als auch durch Zellausbreitungshemmung hochreguliert.Die Immunfluoreszenzfärbung sowohl für Kerne als auch für Actin bestätigte, dass Zellstreufläche und Dehnung durch diese Mikromustermethode genau kontrolliert wurden. Diese Technik ebnete einen Weg, unsere abstimmbaren Substrate als Methode zur mechanistischen Analyse der Schwann-Zellbiologie und der Signalisierung im Kontext von Regeneration und Krebs zu nutzen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir zeigen, wie zu sezieren und Kultur chick E4 statoacoustic Ganglion und E6 Rückenmark Explantate. Explantate unter serumfreien Bedingungen in 3D-Kollagen-Gele für 24 Stunden kultiviert. Neuriten Reaktionsfähigkeit ist mit Wachstumsfaktor-ergänzt mittel-und mit Protein-beschichteten Beads getestet.

Dissection und Kultur von Chick Statoacoustic Ganglion und Rückenmark Explantate in Kollagengelen für Neuritenwachstum Assays

Eine kombinatorische funktionelle Screening-Methode für Einblicke in die Auswirkungen der molekularen Zusammensetzung der Mikroumgebung auf zelluläre Funktionen beschrieben. Das Verfahren nutzt bestehende Biochip-basierten Technologien, um Arrays von definierten kombinatorischen Mikroumgebungen, dass Zelladhäsion und funktionelle Analyse unterstützt generieren.

Herstellung und Verwendung von Mikroumgebung Microarrays (MEArrays)

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Gewinnung von Schwann-Zell-ähnlichen Zellen aus multipotenten Knochenmark-Stromazellen (BMSCs). Zunächst werden die BMSCs einer Hypoxiebehandlung unterzogen, gefolgt von einer gerichteten Differenzierung in neuronale Vorläuferzellen. Anschließend werden spezifische Medien und Kulturbedingungen eingesetzt, um die Transformation dieser Vorläuferzellen in Schwann-Zell-ähnliche Zellen zu induzieren.

Erzeugung von Schwann-Zell-ähnlichen Zellen aus Stromazellen des Knochenmarks

Das Video zeigt die Co-Kultivierung von Neuronen des dorsalen Wurzelganglions (DRG) mit Schwann-Zellen. DRG-Neuronen werden zunächst auf einer vorgedehnten Membran gezüchtet, um das Axonwachstum auszurichten. Dann werden Schwann-Zellen eingeführt, die sich an die Axone anheften, sie isolieren und das Überleben und die Funktion der Nervenzellen fördern.

Co-Kultur von Schwann-Zellen mit DRG-Neuronen auf einer vorgedehnten Membran

Das Video beschreibt die Vorbereitung eines mikrostrukturierten Substrats, um die Spezifikation des Zellphänotyps zu untersuchen. Ein proteinbeschichteter PDMS-Stempel mit Mikrostruktur wird verwendet, um das Mikromuster auf ein PDMS-beschichtetes Deckglas zu übertragen. Das Deckglas wird dann mit einem Tensid behandelt, um die Zelladhäsion an den unerwünschten Oberflächen zu verhindern. Anschließend werden Zellen hinzugefügt, um sich im Muster anzusiedeln, und für die weitere Analyse inkubiert.

Vorbereitung eines mikrostrukturierten Substrats zur Untersuchung von Schwann-Zell-Phänotypen

Hier beschreiben wir eine Schwann-Zellen (SC) Migration Assay, in dem SCs sind in der Lage zu entwickeln entlang erstreckt Axone.

Analyse Murine Schwann Zell Entwicklung entlang wachsenden Axone

Der Übergang von Epithel zu Mesenchym (EMT) ermöglicht es Krebserkrankungen, invasiv zu werden. Zur Untersuchung der EMT wird ein auf neuralen Stammzellen (NSC) basierendes In-vitro-Modell beschrieben, das frei von Serum und Enzymen ist. Dieses standardisierte System ermöglicht die quantitative und qualitative Bewertung der Zellmigration, der Gen- und Proteinexpression. Das Modell eignet sich für die Wirkstoffforschung.

Ein Enzym- und Serumfreie Neural Stem Cell Culture Modell für EMT Investigation Geeignet für Drug Discovery

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Neuronen des dorsalen Wurzelganglion (DRG), die aus Ratten isoliert wurden, und die Kultivierung von DRG-Neuronen auf einem statischen, vorgedehnten Zellkultursystem, um die Axonausrichtung zu verbessern, mit anschließender Co-Kultur von Schwann-Zellen (SCs), um die Myelinisierung zu fördern.

Ein Ansatz zur Verbesserung der Ausrichtung und Myelinisierung von Dorsalwurzelganglion Neurons

Marrow Stromazellen (MSCs) mit neuronalen Potenzial gibt es im Knochenmark. Unser Protokoll bereichert diese Population von Zellen durch hypoxische Vorkonditionierung und leitet sie dann zu reifen Schwann-Zellen.

Hypoxische Vorkonditionierung von Marrow-abgeleiteten Progenitor-Zellen als Quelle für die Erzeugung von reifen Schwann-Zellen

Dieser Artikel beschreibt die detaillierte Methode ein Array gemultiplext künstliche zellulären Mikroumgebung (MACME) Vorbereitung für Hochdurchsatz-Manipulation von physikalischen und chemischen imitiert in Vivo zellulären Mikroumgebungen Queues und Identifizieren Sie die optimale zelluläre Umgebung für menschliche pluripotenten Stammzellen (hPSCs) mit einzelligen profiling.

Herstellung eines Multiplex künstliche zellulären Mikroumgebung Arrays

Hier bieten wir eine Methode zur Analyse des Verhaltens wachsender Axone in 3D-Matrizen, die ihre natürliche Entwicklung imitieren.

Generation von 3-D-Kollagen-basierten Hydrogelen zur Analyse des axonalen Wachstums und Verhaltens während der Entwicklung des Nervensystems

Erfahren Sie die Herstellung abstimmbarer extrazellulärer Matrix-Mikroumgebungen zur Untersuchung der Schwann-Zell-Phänotypspezifikation. Diese kostengünstige Methode ermöglicht präzise Kontrolle von Substratsteifigkeit und Proteinzusammensetzung.

Vorbereitung von tunable Extracellular Matrix Microenvironments zur Bewertung der Schwann Cell Phänotyp Specification

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