Manipulation von einzelnen neuronalen Stammzellen und Neuronen in Gehirnscheiben mit Robotik-Mikroinjektion

Diese Technik ermöglicht es, einzelne Zellen im lebenden Gewebe genauer unter die Lupe zu geben. Durch die Verfolgung und Manipulation einzelner Zellen können wir die Gewebebildung während der Entwicklung besser verstehen. Durch die visuelle Demonstration dieser Methode können potenzielle Benutzer entscheiden, ob diese Technik für ihre Arbeit hilfreich sein könnte.

Darüber hinaus ermöglicht es Benutzern, zu sehen, wie die Anwendung ausgeführt wird, was allein aus dem Text schwer zu erfassen wäre. Dieses Protokoll kann auf jedes Gewebe mit einer bewertbaren Oberfläche angewendet werden. Wir haben verschiedene Zellen in den gleichen Geweben, verschiedene Gewebe in der gleichen Art und auch verschiedene Arten gezielt.

Beim Versuch dieses Protokolls ist es wichtig, fokussiert zu bleiben und schnell zu arbeiten. Alle Geräte sollten vor Beginn der Sezierung vorbereitet werden. Beginnen Sie mit der Installation der Auto-Injektor-Software und ziehen Sie die Mikroinjektionspipetten aus Borosilikatglaskapillaren mit dem Micropipette-Puller.

Bewahren Sie die Pipetten bis zu drei Tage staubgeschützt auf. Schmelzen Sie 3%breite Palette Agarose mit einer Mikrowelle. Lassen Sie die Agarose nicht erstarren, indem Sie sie in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius halten.

Tauen Sie einen Aliquot a SCM und warm 10 bis 12 Milliliter SIM und 20 Milliliter von Tyrodes Lösung auf 37 Grad Celsius mit einem Wasserbad. Mischen Sie den fluoreszierenden Tracer mit den anderen zu injizierenden Chemikalien, zentrifugieren Sie dann die Mikroinjektionslösung bei 16.000 mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand und übertragen Sie ihn in eine neue Röhre.

Halten Sie die Mikroinjektionslösung bis zur Anwendung auf Eis. Verwenden Sie die Köpfe von E13.5 bis E16.5 Mausembryonen, um organotypische Gewebescheiben des Telencephalons zuzubereiten. Entfernen Sie die Haut und öffnen Sie den Schädel mit Zangen entlang der Mittellinie.

Sezieren Sie das embryonale Gehirn aus dem offenen Schädel und entfernen Sie die Hirnhirngewebe von der ventralen Seite des Gehirns. Lassen Sie das sezierte ganze Gehirn in Tyrodes Lösung auf dem 37 Grad Celsius Heizblock. Gießen Sie die weiträumige geschmolzene Agarose in eine Einweg-Einbettform.

Wenn es auf 38 bis 39 Grad Celsius abkühlt, übertragen Sie vorsichtig bis zu vier Gehirne mit einer Pasteurpipette in die Agarose. Rühren Sie die Agarose um das Gewebe mit einem Spachtel oder einem Paar Dumont Nummer eins Zange, ohne das Gewebe zu berühren. Lassen Sie die Agarose bei Raumtemperatur erstarren.

Sobald sich die Agarose verfestigt hat, schneiden Sie den Überschuss um das Gewebe. Füllen Sie das Pufferfach mit PBS. Richten Sie das Gehirn mit der rostralen Kaudalenachse des Gewebes senkrecht zum Tablett aus und schneiden Sie 250 Mikrometer Scheiben mit einem Vibratom.

Füllen Sie eine 3,5 Zentimeter Petrischale mit zwei Millilitern vorgewärmter Medien, dann verwenden Sie eine Kunststoff Pasteur Pipette, um 10 bis 15 Scheiben auf diese Schale zu übertragen. Wenn Sie fertig sind, übertragen Sie die Petrischale mit den Scheiben in den Slice-Kultur-Inkubator. Bewahren Sie die Scheiben bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre auf.

Schalten Sie Computer, Mikroskop, Mikroskopkamera, Manipulatoren, Druckgerät und Drucksensor ein. Laden Sie die Anwendung, indem Sie auf die Datei klicken, starten Sie die App.py im Hauptordner, der von GitHub heruntergeladen wurde, und geben Sie die Geräteeinstellungen im Popup-Bildschirm an.

Um unerwünschte Verstopfungen zu vermeiden, erzeugen Sie einen Außendruck, bevor Sie die Pipette in die Lösung eintauchen. Schieben Sie den Kompensationsdruckbalken auf 24 bis 45 % und klicken Sie auf Werte festlegen. Als nächstes stimmen Sie den Druck ein, indem Sie den mechanischen Druckventilknopf auf ein bis zwei PSI drehen, wie durch den Drucksensor angegeben.

Übertragen Sie die Scheiben in die Mitte einer 3,5 Zentimeter großen Petrischale mit zwei Millilitern vorgewärmter SIM- und -Spritze, und legen Sie dann die auf 37 Grad Celsius vorgeheizte Petrischale auf die Mikroinjektionsstufe. Die Mikroinjektionspipette mit 1,4 bis 1,6 Mikroliter Mikroinjektionslösung mit einer Langspitzen-Kunststoffpipette beladen und die Mikroinjektionspipette in den Pipettenhalter einlegen. Mit der niedrigsten Vergrößerung auf dem Mikroskop, bringen Sie die Scheibe in den Fokus und führen Sie die Mikropipette zu diesem Sichtfeld, so dass es auf der gleichen Ebene wie das Scheibenziel konzentriert ist.

Schalten Sie den Ausgang des Mikroskops auf die Kamera, um den FOV und die Anwendung zu sehen. Klicken Sie auf die Vergrößerungsschaltfläche oben links in der Benutzeroberfläche, um die Gerätekalibrierung zu initiieren. Wenn ein Fenster aufgefordert wird, die Vergrößerung auszuwählen, wählen Sie das 10X aus, und drücken Sie OK. Die Software geht davon aus, dass die interne Objektivlinse 10X beträgt.

Richten Sie die Pipettenspitze mit dem mikrometrischen Rad des Mikroskops neu aus und klicken Sie mit dem Cursor auf die Pipettenspitze. Drücken Sie als Nächstes die Taste Schritt 1.1 und im Popup-Fenster auf OK. Die Pipette bewegt sich in y-Richtung.

Klicken Sie auf die Spitze der Pipette und drücken Sie die Taste Schritt 1.2. Geben Sie schließlich 45 in den Pipettenwinkelkasten ein und drücken Sie den eingestellten Winkel. Geben Sie die gewünschten Parameter in das bedienfelder automatisierter Mikroinjektion ein und legen Sie die Geschwindigkeit auf 100% fest, wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Werte festlegen.

Klicken Sie auf die Schaltfläche "Zeichnungskante", und ziehen Sie den Cursor entlang der gewünschten Flugbahn im Popupfenster, um die Injektionsbahn zu definieren. Für Mikroinjekton-Neuronen, Zielen Sie auf die Basalseite des Telencephalon. Bringen Sie die Pipette an den Anfang der Linie und klicken Sie auf ihre Spitze, und klicken Sie dann auf Laufbahn, um mit der Mikroinjektion zu beginnen.

Wiederholen Sie diesen Schritt für jede zielgerichtete Injektionsebene. Die Scheiben in die Kollagenmischung eintauchen und die Scheiben zusammen mit 200 bis 300 Mikrolitern des Kollagens in einen 14 Millimeter großen Brunnen einer 35 Millimeter Glasbodenschale übertragen. Stellen Sie sicher, dass die Scheiben in der geringstmöglichen Menge an Kollagen abgedeckt sind, was die optimale Voraussetzung für Nährstoffe und Sauerstoffaufnahme ist.

Richten Sie die Scheiben mit zwei Zangenpaaren aus und brüten Sie die Petrischale fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius auf einem Heizblock, damit sich das Kollagen erstarren lässt. Bewegen Sie die Petrischale für weitere 40 Minuten zurück in den Inkubator der Scheibenkultur, und fügen Sie dann zwei Milliliter vorgewärmten SCM hinzu. Am Ende der Kultur, nehmen Sie die Scheiben aus dem Slice-Kultur-Inkubator und aspirieren sie den SCM.

Waschen Sie die kollageneingebetteten Scheiben mit PBS, fügen Sie dann 4% Paraformaldehyd hinzu und lassen Sie das Gewebe bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Bewegen Sie es auf vier Grad Celsius für die Nachtfixierung. Am nächsten Tag die Paraformaldehydlösung ansaugen und die Scheiben mit PBS waschen.

Entfernen Sie die Scheiben aus dem Kollagen mit zwei Zangenpaaren unter einem Stereomikroskop. Verwenden Sie eine Mikrowelle, um den 3%niedrigen Schmelzpunkt Agarose zu schmelzen, dann gießen Sie es in eine Einweg-Einbettform und lassen Sie es auf etwa 38 oder 39 Grad Celsius abkühlen. Übertragen Sie die Gewebescheiben in diese Form, um sicherzustellen, dass die Schälseite der Scheibe nach oben gerichtet ist, dann lassen Sie die Agarose auf Raumtemperatur abkühlen und erstarren.

Trimmen Sie die zusätzliche Agarose, die die Scheiben umgibt. Richten Sie den Agaroseblock aus, um sicherzustellen, dass die Schnittfläche parallel zur Schneidklinge des Vibratom ist, und schneiden Sie 50 Mikrometer dicke Abschnitte. Füllen Sie eine 24-Well-Schale mit PBS und übertragen Sie die Abschnitte in diese Schale mit einem feinen Tip-Pinsel, dann führen Sie Immunfluoreszenz nach Standard-Protokolle.

Repräsentative Bilder von erfolgreich injizierten Vorläuferzellen und neugeborenen Neuronen werden hier gezeigt. Bei Injektion mit Dextran Alexa 488 erscheinen die Zellen vollständig mit dem Farbstoff gefüllt. Automatisierte Mikroinjektion kann im Vergleich zur manuellen Mikroinjektion einen deutlich höheren Durchsatz bieten.

Darüber hinaus bestätigt die EDU-Kennzeichnung, dass die Zelllebensfähigkeit durch die Automatisierung nicht beeinträchtigt wird. Die Beibehaltung der organotypischen Scheibe in der Kultur ermöglicht es, die Lineage Progression der mikroinjizierten Zellen zu folgen. Die Mikroinjektion in einzelne neuronale Stammzellen bietet eine ausgezeichnete Einzelzellauflösung.

Daher wurde es verwendet, um die Zellbiologie der neuronalen Stammzellprogression und Desschicksalsübergang zu sezieren. Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Junctional-Kopplung bei neugeborenen Neuronen zu untersuchen, indem Luzifergelb zusammen mit Dextran A555 injiziert wurde. Ein Teil der neugeborenen pyramidenförmigen Neuronen wurden über Lückenknoten mit benachbarten Neuronen gekoppelt, was mit der Idee übereinstimmt, dass unreife Neuronen über Lückenknoten kommunizieren.

Wir haben diese Technik verwendet, um die Zellbiologie der Gehirnentwicklung und Gehirnentwicklung zu untersuchen. Wir untersuchten mehrere Kandidatengene, die das Verhalten neuronaler Stammzellen beeinflussten, und wir konnten entdecken und verstehen, wie sie funktionieren, wie sie die Progression der neuronalen Stammzelllinien und die Neuronenproduktion während der Entwicklung des Gehirns beeinflussen.