Kontrollierte Dehnung von 3D-Hydrogelen unter Live-Mikroskopie-Bildgebung

Biologisches Gewebe wächst in dreidimensionalen, weichen Umgebungen, in denen die Zellen verschiedenen mechanischen Impulsen ausgesetzt sind. Unsere Methode ermöglicht es, Hydrogele dreidimensional zu dehnen, um biomechanische Reaktionen zu untersuchen. Diese Technik ermöglicht die gleichmäßige Dehnung von Hydrogelen entlang ihrer Dicke, während die Live-Bildgebung durchgeführt wird.

Darüber hinaus kann die Geometrie des Hydrogels auf jede Größe und Form manipuliert werden. Das Wissen darüber, wie Zellen und die extrazelluläre Matrix auf Kräfte reagieren, ist wichtig, um aufzudecken, wie sich Gewebe entwickelt und Krankheiten fortschreiten. Dies kann zur potenziellen Entwicklung von Krebstherapien und Tissue-Engineering-Modellen führen.

Beginnen Sie mit einem Laser oder einem manuellen Cutter, um einen Gummistreifen mit einem Loch in der Mitte zu erstellen. Schneiden Sie ein Rechteck aus hydrophober Folie so ab, dass es breiter als die Silikonstreifen ist, und waschen Sie eine Plastikschale mit 70 % Ethanol. Legen Sie nach dem Trocknen mit fusselfreien Tüchern die Siegelfolie in die Schale und legen Sie einen Silikonstreifen, bei dem die Frischhaltefolie von einer Seite entfernt ist, in die Mitte jedes Stücks Siegelfolie.

Für die Fibringelbildung geben Sie gleichmäßig 2,5 Mikroliter kaltmarkiertes Fibrinogen in den Silikonausschnitt jedes Streifens, so dass der gesamte Umfang jedes Ausschnitts mit Fibrinogen in Kontakt kommt, wobei darauf zu achten ist, dass sich nirgendwo in den Lösungen Lufteinschlüsse oder Blasen bilden. Geben Sie sofort 2,5 Mikroliter abgekühltes Thrombin direkt zu jeder Fibrinogenlösung und mischen Sie die Lösungen schnell durch vorsichtiges Pipettieren, wobei Sie die Spitze um die gesamte Mischung herum bewegen, um eine möglichst homogene Lösung zu erhalten. Stellen Sie die abgedeckte Schale nach dem Mischen für 30 Minuten zur Gelpolymerisation in den Inkubator.

Geben Sie am Ende der Inkubation genügend PBS in die Schale, um die Gel-Silikon-Konstrukte einzutauchen, und heben Sie jede Probe vorsichtig aus der Schale, wobei Sie darauf achten, dass die Siegelfilmschicht auf dem Streifen haftet. Ziehen Sie das Silikon langsam von einem Ende zum anderen ab, lösen Sie vorsichtig die Dichtungsfolie von jedem Silikonstück, legen Sie dann den Streifen wieder in die Schale und stellen Sie die Schale auf den Tisch eines Lichtmikroskops, um den Zustand der Probe zu beurteilen. Um die Probe auf die Dehnungsvorrichtung zu laden, füllen Sie das Bad mit PBS und legen Sie den Silikonstreifen mit dem Probengel so über die Oberseite des Bades, dass die Enden des Streifens auf jeder Seite des Bades sitzen.

Platzieren Sie die Klammern und Stoffstreifen und ziehen Sie sie dann fest, so dass alle Teile zu einem geraden Streifen verbunden sind, mit dem Ausschnitt in der Mitte. Legen Sie das Material auf die Vertiefung und befestigen Sie einen Deckzettel am Boden der Vertiefung, dann geben Sie eine Aluminiumflüssigkeitsmulde in die Streckvorrichtung. Füllen Sie die Vertiefung mit ein bis zwei Millilitern PBS-Zellmedium und legen Sie das Streifengewebe-Gel-Konstrukt in das Gerät.

Klemmen Sie den Stoffstreifen so in die Halterung, dass sich der Ausschnitt des Gels in der Mitte befindet, bevor Sie den Pin-Down-Einsatz vorsichtig in das Gerät einsetzen und arretieren. Setzen Sie die andere Gewebeseite in die Spindel ein, verriegeln Sie sie und platzieren Sie die Streckvorrichtung und die daran befestigte Probe auf dem Tisch eines konfokalen Mikroskops. Verwenden Sie ein USB-Kabel, um den Mikrocontroller mit dem Computer und den Servomotor mit dem Mikrocontroller zu verbinden.

Öffnen Sie dann das Steuermodul des Dehnungsgeräts auf dem Computer, um die Probe abzubilden. Um festzustellen, ob die Probe für ein Experiment geeignet ist, verwenden Sie Live-Bildgebung mit niedriger Auflösung, um das gesamte Gel zu scannen und die niedrigste Z-Position zu bestimmen, an der eine vollständige Haftung an den Innenwänden des Ausschnitts ohne Risse oder Blasen sichtbar ist. Nachdem Sie die Z-Position des Mikroskops notiert haben, scannen Sie die Schnittstelle der Fluoreszenzmarkierung des Gels und des Silikonstreifens, um die vollständige Haftung des Gels auf dem Silikon über seinen gesamten Umfang zu bestimmen.

Bewegen Sie nach dem Scannen den Tisch in Z-Richtung, bis keine Kontinuität mehr im Gel vorhanden ist und beachten Sie die obere Grenze der Z-Position. Subtrahieren Sie dann die obere Grenze der Z-Richtung von der unteren Grenze, um die Probendicke zu berechnen. Um die Vorstreckposition der Probe zu bestimmen, klicken Sie in der Modulsoftware auf Go to Zero Servo POS, um sicherzustellen, dass sich der Servomotor in seiner Nullposition befindet, und befestigen Sie den Servomotor an der Streckvorrichtung, wobei Sie darauf achten müssen, dass die Probe nicht belastet wird.

Klicken Sie während der Aufnahme auf die Plus-Eins-Schaltfläche, um den Motor jeweils um ein Grad im Uhrzeigersinn zu bewegen. Wenn sich die rechte Seite des Ausschnitts bewegt, klicken Sie auf die Minus-Eins-Schaltfläche, um das Sample in die vorletzte Position umzudrehen und das Sample unter minimaler Spannung zu halten. Klicken Sie auf Minimale Servoposition festlegen, um die Referenzposition festzulegen und ein hochauflösendes einzelnes Z-Schichtkachelbild mit 40-facher Vergrößerung und einer einzelnen Z-Schicht-Kachel des gesamten Gelbereichs als Basisreferenz für die Nachbearbeitungsanalyse aufzunehmen.

Wenn alle Bilder aufgenommen wurden, schieben Sie den Servomotor um ein Grad pro Sekunde voran, bis die gewünschte Dehnungsgröße erreicht ist. Stellen Sie bei jeder Dehnungsgröße, für die eine Analyse gewünscht wird, sicher, dass sich das Gel an keiner Stelle seines Umfangs vom Silikon gelöst hat, indem Sie die Grenzfläche zwischen dem Gel und dem Silikon scannen, und erfassen Sie dann einen hochauflösenden Kachel-Z-Stapel-Bildsatz des gesamten Gelbereichs für die Nachbearbeitungsanalyse. Das Heranzoomen und manuelle Nachverfolgen von Bead-Aggregaten während der Geldehnung ermöglicht die Berechnung der lokalen Geldehnungen in axialer und senkrechter Richtung.

Typischerweise breiten sich die axialen Stränge relativ linear von der Silikonausschnittskante zur Mitte des Gels aus und sind größer als die senkrechten Druckdehnungen. Hier werden Bilder mit hoher Vergrößerung eines typischen ungedehnten und relativ isotropen Hydrogels und eines Wasserstoffs unter hoher 80%-Cutout-Dehnung gezeigt, die stark ausgerichtete Fasern in Dehnungsrichtung darstellen. Die Analyse der Faserumorientierung ergab eine annähernd lineare Abhängigkeit zwischen der Faserausrichtung und der äußeren Dehnung des Ausschnitts bis zu Dehnungen von 40 % mit mäßiger Sättigung bei Dehnungen über 40 %Wie in dieser Faserausrichtungsanalyse dargestellt, nimmt die Faserausrichtung mit zunehmender äußerer Dehnung des Ausschnitts zu, wobei eine nichtlineare Gesamtkurve folgt.

Beachten Sie, dass die Reaktion des Gels auf Dehnung entlang seiner Z-Dicke relativ gleichmäßig ist. Wie in dieser vorläufigen Finite-Elemente-Simulation, die an 2D-Endlosmaterial durchgeführt wurde, dargestellt, liegt die Farbmatte zwischen 38 und 42 %, was darauf hindeutet, dass die Gelstämme im gesamten kreisförmigen Gelbereich relativ homogen sind. Es ist wichtig sicherzustellen, dass das Hydrogel vollständig an den Innenwänden des geometrischen Ausschnitts haftet, da Adhäsion und Kontinuität für eine zuverlässige Dehnung der Proben entscheidend sind.

Durch Ändern der Geometrie des Silikonausschnitts können wir Gradienten in der Dehnung und Faserausrichtung programmieren, so dass wir beim Einbetten von Zellen die Reaktion auf diese Gradienten analysieren können.