Metabolische Profilerstellung zur Bestimmung bakterizider oder bakteridarischer Wirkungen neuer Naturprodukte mit isothermen Mikrokalorimetrie

Das Verständnis der Wirkungsweise neuartiger antibakterieller Verbindungen ist eine wichtige, aber schwierige Aufgabe. Diese Methode bietet Einblicke in solche Mechanismen und es ist einfach zu implementieren. Diese Technik ermöglicht eine Echtzeitbeobachtung antibakterieller Wirkungen auf nichtinvasive Weise, was eine weitere Probenanalyse ermöglicht.

Obwohl das Üben mit mikrobiologischen Techniken eine Voraussetzung ist, ist das Experiment einfach durchzuführen. Die Zeit mit der Datenanalyse ist sehr wichtig, wenn Sie zum ersten Mal Mikrokalorimetrie durchführen. Beginnen Sie mit einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 600 Nanometern, um die optische Dichte der Nachtkultur zu messen.

Verdünnen Sie die Kultur auf eine 5 mal 10 bis die 5. Kolonie bildende Einheiten pro Milliliter frischer MHB-mittlerer Konzentration und fügen Sie 150 Mikroliter Zellen in der Konzentration des Interesses zu jeder 1,5 Milliliter Tube Antibiotikum hinzu. Dann mischen Sie die Verbindung mit den Zellen durch Wirbeln. Zur Vorbereitung der Einsätze 120 Mikroliter jedes Bakterien-Antibiotikagemischs in einzelne Kunststoffeinsätze in den entsprechenden Brunnen einer 48-Well-Platte geben und mit einer Pinzette alle Titanfläschchen in die Halterungen legen.

Übertragen Sie die Einsätze vorsichtig in die Titanfläschchen in der Halterplatte und legen Sie Titandeckel lose auf alle Fläschchen. Wenn alle Einsätze übertragen wurden, legen Sie den Halter auf den vorgesehenen Bereich auf der Probenstation und verwenden Sie einen Drehmomentschlüssel, der auf 40 Centinewtonmeter eingestellt ist, um alle Deckel festzuziehen. Starten Sie in der Systemsoftware ein neues Experiment und ziehen Sie den Probeneinsteckarm vom Instrument ab.

Stellen Sie den Becherhalter auf die Brücke mit Dersäule acht gegenüber der Probeneinlageöffnung und drücken Sie den Becherhalter vorsichtig an Position eins in das Instrument. Warten Sie 10 Minuten, bis sich das System stabilisiert hat, bevor Sie die experimentellen Brunnen beschriften. Als nächstes drücken Sie den Probeneinsteckarm, bis sich der Becherhalter an Position zwei befindet.

Nachdem Sie das System 20 Minuten lang stabilisieren konnten, drücken Sie den Probeneinschubarm auf Position drei und ziehen Sie den Probeneinschubarm zurück, bis er sich an der Laufposition befindet. Markieren Sie alle Brunnen in der Software und wählen Sie den Reaktionsstart aus, und führen Sie dann das Experiment aus, bis die Wärmeemissionswerte stabil wieder bei Null liegen. Wählen Sie am Ende der Analyse Stopp aus.

Die Software wird dann fragen, ob Sie sicher sind. Wählen Sie ja aus, und speichern Sie das Experiment für die Datenanalyse. Legen Sie dann den Probeneinsteckarm vollständig in das Instrument ein und greifen Sie die Magnete an, um den Becherhalter zu erhalten.

Um die Daten zu analysieren, öffnen Sie die Software, und wählen Sie das offene Experiment aus. Wählen Sie im Popup-Fenster das Experiment aus, und klicken Sie auf Öffnen. Klicken Sie auf Alle auswählen, und definieren Sie die Basislinie, um die Daten an jeder Position zu normalisieren.

Wählen Sie im Popupfenster innerhalb der Verzögerungsphase einen Zeitraum von mehr als 30 Minuten aus. Nach der Auswahl wird die Basislinie im Thermogramm grün angezeigt. Schließen Sie das Fenster zum Definieren des Basislinienabschnitts, und klicken Sie dann auf Speichern und Schließen der Software.

Öffnen Sie anschließend die webbasierte SymCel-Berechnungsanalyseanwendung. Klicken Sie auf Navigieren, um die interessierte Datei hochzuladen, und wählen Sie das Experiment aus. Die metabolischen Parameter werden automatisch für die 32 Proben berechnet.

Um die Wärmeflussdaten an Gompertz- und/oder Richards Growth-Modelle anzupassen, klicken Sie auf die Wachstumsfunktion. Wachstumsmodelle werden im kumulativen Abschnitt zum Vergleich mit den Rohdaten im Flow-Abschnitt angezeigt. Um die berechneten Parameter herunterzuladen, klicken Sie auf Messgrößen herunterladen, wählen Sie den Speicherort der Datei aus und klicken Sie auf Speichern.

Die Datei wird zur weiteren Analyse in eine Kalkulationstabelle exportiert. Hier werden die Thermogramme angezeigt, die durch Aussetzen von A.baumannii DSM-30008 ciprofloxacin in serieller Verdünnung gewonnen wurden. Konzentrationen zwischen 0,005 und 0,1 Mikromolaren haben einen minimalen Einfluss auf das Wachstum und den Stoffwechsel von A.baumannii.

Die Behandlung der Zellen mit 0,5 mikromolarem Ciprofloxacin führt jedoch zu einer signifikanten Verschiebung der Verzögerungsphasendauer und zu einem geringeren maximalen Wärmestrom. Diese beiden Änderungen zusammen beeinflussen die Zeit bis zum Höhepunkt, was zu einer Erhöhung um etwa sechs Stunden führt. In dieser Abbildung wird die kumulativ eklamierte Wärme gegen die Zeit dargestellt, mit dem Effekt jeder Konzentration, die durch eine Steigung der Steigung reflektiert wird.

Die Quantifizierung der Thermogrammneigung ermöglicht die Berechnung der maximalen Stoffwechselrate von A.baumannii in Gegenwart von Ciprofloxacin mit einer gleichzeitigen Abnahme der Stoffwechselrate, die in Zellen beobachtet wird, die mit 0,5 mikromolarem Ciprofloxacin behandelt werden. Die Rifampicin-Behandlung hat eine dramatische Wirkung auf die Thermogramme von A.baumannii DSM-30008. Eine signifikante Verringerung der Wärmeemission im Zusammenhang mit einer Abnahme der metabolischen Aktivität wird auch beobachtet.

Beachten Sie die Erhöhung der Zeit bis zum Höhepunkt für alle getesteten Konzentrationen und die Abnahme der Stoffwechselrate durch die Abnahme der Steigung für alle Konzentrationen, die in der Regel auf eine bakterizide Wirkung zugeschrieben werden. Um optimale Ergebnisse zu gewährleisten, verwenden Sie die umgekehrte Pipettierung und verhindern Sie zusätzliche Flüssigkeit an den Seiten des Einsatzes, wenn Sie die Probe übertragen, stellen Sie außerdem sicher, dass die Deckel ordnungsgemäß geschlossen sind.