Name: Anwendungen der Immobilisierung von Drosophila-Geweben mit Fibrin-Clots für Live Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Lernen Sie die Immobilisierung von Drosophila-Geweben mit Fibrin-Clots für Live-Imaging. Diese Methode minimiert Drift und ermöglicht die dynamische Beobachtung neuronaler Prozesse in Echtzeit.

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Die Arbeit im Januschke-Labor wird von Wellcome Trust Grants 100031/Z/12/A und 1000032/Z/12/A unterstützt. Die Gewebebildgebungseinrichtung wird durch das Stipendium WT101468 von Wellcome unterstützt.

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<li>Hannaford, M. R., Ramat, A., Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((aPKC-mediated+displacement+and+actomyosin-mediated+retention+polarize+Miranda+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">aPKC-mediated displacement and actomyosin-mediated retention polarize Miranda in Drosophila neuroblasts.</a> eLife. 7, 166(2018).</li>
<li>Hannaford, M., Loyer, N., Tonelli, F., Zoltner, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical-genetics+approach+to+study+the+role+of+atypical+Protein+Kinase+C+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A chemical-genetics approach to study the role of atypical Protein Kinase C in Drosophila.</a> Development. 146 (2), (2019).</li>
<li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+last-born+daughter+cell+contributes+to+division+orientation+of+Drosophila+larval+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3745(2018).</li>
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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Live-Bildgebung der gesamten Mount D. melanogaster Larvengehirne bietet die Möglichkeit, asymmetrische neuronale Stammzellteilungen in Bedingungen in der Nähe eines physiologischen Kontextes zu beobachten. Der erste Teil unseres Protokolls stellt unseren Ansatz zur Zerlegung von Larvenhirnen vor. Wie bereits erwähnt13, ist ein kritischer Aspekt der Vorbereitung zu vermeiden, das Gehirn zu beschädigen. Die schwierigste Aspekt dieser ist es, das Gehirn von den benachbarten imaginären Scheiben zu trennen, ohne übermäßig auf das Gehirn zu ziehen. Unser Ansatz zum "Schneiden ohne Ziehen" besteht darin, entweder eine Schleifbewegung mit den Spitzen eines Zangenpaares durchzuführen oder eine Zangenspitzen entlang zweier anderer Zangenspitzen zu schieben, die die Verbindung zwischen Geweben halten (Abbildung 1A), während Lerit et al. sägeartige Bewegungen mit einem Trennstift beschreiben. Wir raten dem Experimentator, alle Ansätze auszuprobieren und die am besten geeigneten für sich zu übernehmen. Wir empfehlen auch, BSA- oder FCS-beschichtete Pipettenspitzen anstelle von Sezierwerkzeugen zu verwenden, um isolierte Gehirne zu übertragen. Die Beschichtung verhindert, dass Gewebe am Kunststoff kleben und ermöglicht den sicheren Transfer von Geweben, während sie immer vollständig eingetaucht werden, ohne sie einer möglichen vorübergehenden Verformung zu unterwerfen, da sie während des Transfers am Sezierwerkzeug kleben. Beschichtete Spitzen haben andere Vorteile, um die Übertragung mehrerer Gehirne auf einmal zu ermöglichen, was besonders nützlich ist, wenn es wichtig ist, die Aufenthaltszeit der Proben innerhalb eines bestimmten Mediums zu kontrollieren; sie eignen sich für den Transfer anderer Gewebe, auch zerbrechlicher Gewebe wie z. B. Fettkörper; Sie können eine breite Palette von verschiedenen Probengrößen aufnehmen, indem sie größere Spitzen verwenden oder die Extremität der Spitze schneiden.
Als nächstes beschreibt dieses Protokoll die Verwendung von Fibrinogen-Gerinnung, um Larvengehirne auf dem Deckblatt einer Kulturschale zu immobilisieren. Ein Gehirn ist innerhalb eines Tropfens von Kulturmedium + Fibrinogen ausgerichtet, nach dem die Gerinnung durch die Zugabe von Thrombin induziert wird. Die Fibrin-Bildung erfolgt schrittweise und bietet ein Zeitfenster, in dem die Ausrichtung der Probe gegebenenfalls verfeinert werden kann(Abbildung 2C). Wenn eine leichte Kompression der Probe erforderlich ist - wovon wir bei Larvenhirnen raten -, kann sie auch fein eingestellt werden, indem das Gerinnsel in den Schritten 3.4.4 und 3.5.2 mehr oder weniger nahe an der Probe gedrückt wird. Der Hauptvorteil dieser Fibrinogen-Gerinnung gegenüber dem in Lerit et al. beschriebenen Protokoll, in dem Gehirne zwischen einer gasdurchlässigen Membran und einem Abdeckrutsch montiert sind, ist die Fähigkeit, das Kulturmedium während der Live-Bildgebung zu ersetzen. Ein möglicher Vorteil der Verwendung einer gasdurchlässigen Membran gegenüber unserem Protokoll könnte sein, dass sie eine optimale Sauerstoffversorgung der Proben bietet, die mit unserem Ansatz eingeschränkter sein könnte, da Gehirne durch das Gerinnsel und ein Medium von der Luft getrennt werden. Aus diesem Grund, obwohl wir nicht die Wirkung der Menge der Kulturmedium innerhalb der Kultur Gericht bewertet, schlagen wir vor, die Menge der Kultur Medium auf den Gerinnseln zu begrenzen, während die Gerinnsel vollständig eingetaucht.
Da die Manipulation der Gerinnsel experimentell schwierig und zeitaufwändig sein kann, empfehlen wir dem Experimentator, zunächst Gerinnsel ohne Proben zu manipulieren. Die Modulation des Volumens des Tropfens kulturmittel + Fibrinogen auf dem Deckel, die Konzentration von Fibrinogen oder das Volumen und die Konzentration von Thrombin könnte dazu beitragen, die Vorbereitung zu erleichtern und könnte wichtig sein, wenn das Protokoll an andere Arten von Geweben angepasst werden. Mit genügend Erfahrung bei der Manipulation der Gerinnsel können bei Bedarf mehrere Gehirne in einem Gerinnsel immobilisiert werden, obwohl dies die Feinabstimmung der Ausrichtung erschwert. Auf dem Deckblatt können mehrere Gerinnsel gebildet werden, so dass z.B. Proben verschiedener Genotypen abbilden können. Es ist auch möglich, verschiedene Gerinnsel auf dem gleichen Coverslip verschiedenen Kulturmedien auszusetzen, obwohl darauf geachtet werden muss, niemals die Tropfen des Kulturmediums zu mischen, das die verschiedenen Gerinnsel bedeckt. Sobald Larvengehirne immobilisiert sind und bereit für Live-Bildgebung, empfehlen wir, die Empfehlungen von Lerit et al.13 zu folgen, um übermäßige Photoschäden zu vermeiden. Wir fügen diesen Empfehlungen nur hinzu, um das Gehirn nicht nur bei 25 °C während der Live-Bildgebung mit einem Bühneninkubator zu halten, sondern auch, um dieses Stadium mindestens 30 min vor Beginn der Bildgebung vorzuheizen. Wenn wir dies nicht systematisch tun, führt dies zu einer starken Fokusdrift.
Es kann in einigen Kontexten vorteilhaft sein, korrelierte Mikroskopie durchzuführen und eine Probe nach Live-Bildgebung zu fixieren und zu immunstainieren. Eine Einschränkung der Verwendung von Fibrin-Gerinnseln ist jedoch, dass es fast unmöglich ist, ein Gehirn mechanisch von einem Gerinnsel zu isolieren, ohne es zu beschädigen. Ein möglicher Weg, diese Einschränkung zu überwinden, könnte darin bestehen, Methoden zu entwickeln, um Fibrin-Gerinnsel mit Plasmin zu abbauen oder die Gerinnseldemontage durch Zugabe eines Peptids zu induzieren, das die Knöpfe imitiert, was die Fibrin-Polymerisationermöglicht 28. Wir verwenden in der Regel Fibrin-Gerinnsel auf Proben von Einzelzellen bis zu 200 M langen Geweben, aber wir könnten auch erfolgreich in Gerinnseln und Bildgehirnen von erwachsenen Hummeln über 3 mm Breit immobilisieren. Die Obergrenze des Stichprobenumfangs, der in Gerinnsel immobilisiert werden kann, muss noch ermittelt werden. In ähnlicher Weise, obwohl wir in der Regel immobilisierte Proben für 4 bis 5 h abbilden, haben wir neuroblasten in der Primärkultur für bis zu 3 Tage erfolgreich ababgebildet, was darauf hindeutet, dass das Gerinnsel zumindest die längerfristige Lebensfähigkeit nicht beeinträchtigt. Im Gegenteil, Gerinnsel können den regelmäßigen Austausch des Mediums erleichtern, eine Voraussetzung für eine längerfristige Bildgebung, ohne dass geräte wie peristaltische Pumpen für diesen Zweck benötigt werden. Während wir die Permeabilitätsparameter von Fibringer nicht gemessen haben, scheint die faserige gelartige Natur der Gerinnsel durch zelldurchlässige Moleküle durchdrungen zu sein. Wir fanden heraus, dass Latrunculin A, Colcemid oder 1-NAPP1, HALO-Tag Liganden und andere Standardfarbstoffe, die in der Zellbiologie verwendet werden, die Zellen im Fibringer problemlos erreichen und bisher keine Moleküle gefunden haben, die durch das Gerinnsel zurückgehalten würden, was jedoch eine Möglichkeit ist, die empirisch getestet werden muss.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Verwendung von Fibrin-Gerinnseln eine zuverlässige und relativ einfache Implementierung einer Möglichkeit bietet, lebende Gewebe für die Live-Bildgebung zu immobilisieren. Über seine Nützlichkeit bei der Begrenzung des seitlichen Driftens hinaus hat sich die Fähigkeit, das Kulturmedium während der Live-Bildgebung zu verändern, als von unschätzbarem Wert für unseren ansatzbereiten Ansatz der chemischen Genetik erwiesen, die asymmetrische Zellteilung von D. melanogaster Neuroblasten zu untersuchen21. Wir gehen davon aus, dass diese Technik für Studien in einer Vielzahl unterschiedlicher Gewebe von Vorteil sein wird, insbesondere wenn sie chemische Genetik oder beispielsweise die Protein-Selbstkennzeichnung29beinhalten.
Unser MultiHyperStackReg-Makro basiert auf dem TurboReg ImageJ-Plugin, das aufeinander folgende Frames oder Slices eines Stacks ausrichtet, und dem MultiStackReg ImageJ-Plugin, das es ermöglicht, die Transformationen auf andere Stacks anzuwenden. MultiHyperStackReg ermöglicht es einfach, diese Transformationen auf Hyperstacks anzuwenden (Stapel mit mindestens vier Dimensionen). Da die Verwendung von MultiHyperStackReg, wie wir es beschreiben, viele Aktionen erfordert und ziemlich zeitaufwändig werden kann, haben wir auch das AutoHyperStackReg-Makro geschrieben, das automatisch alle in den Schritten 6.2 und 6.3 beschriebenen Schritte ausführt. Im Gegensatz zu MultiHyperStackReg fehlt AutoHyperStackReg derzeit jedoch die Möglichkeit, die Ausrichtung eines Stacks basierend auf einer Subregion dieses Stacks zu berechnen, eine Option, die wir gefunden haben, ist manchmal entscheidend für eine befriedigende Ausrichtung. Eine weitere Einschränkung von AutoHyperStackReg besteht darin, dass seine Verwendung auf Übersetzungen beschränkt ist und nicht auf die anderen Transformationen, die von TurboReg und MultiStackReg vorgeschlagen werden, während MultiHyperStackReg auf einen Hyperstack jeden Transformationstyp anwenden kann, wenn der Benutzer ihn benötigt. Zukünftige Versionen werden diese Funktionen implementieren und auf GitHub30verfügbar sein. Schließlich bietet unser rotierendes Linecan-Makro eine einfache Möglichkeit, kortikale Signale im Zeitraffer schnell zu messen, auch wenn der Kortex seine Position oder Ausrichtung im Laufe der Zeit ändert. Ob der Tracking-Modus oder der Nicht-Tracking-Modus für die Analyse am besten geeignet ist, hängt von der Qualität und Konsistenz des kortikalen Signals ab. Der Tracking-Modus ist einfacher zu verwenden, da der Benutzer nicht berücksichtigen muss, wo sich der Kortex für jeden Zeitpunkt befindet und große Positions- und Orientierungsänderungen im Laufe der Zeit aufnehmen kann. Es ist jedoch nur dann geeignet, wenn das kortikale Signal während des gesamten Films stark genug bleibt, um es zu detektieren: Ein Versäumnis, etwas anderes als den Kortex zu erkennen (z. B. ein helles zytoplasmatisches Fach in der Nähe des Kortex), kann die Detektion für jeden folgenden Zeitpunkt beeinträchtigen (z. B. bewegt sich das zytoplasmatische Fach vom Kortex weg und die kortikalen Linien können ihm für den Rest des Zeitraffers folgen). Der Nicht-Tracking-Modus hat diese Falle nicht, da die Erkennung auf die ursprünglich vom Benutzer gezeichnete Linie beschränkt ist (z. B. kann ein helles zytoplasmatisches Fach dazu führen, dass die Erkennung für einige Zeitpunkte fehlschlägt, aber da sich das zytoplasmatische Fach von der Detektionszone entfernt, wird die korrekte Erkennung des Kortex fortgesetzt), verhält sich aber nicht gut, wenn sich die Kortexposition oder -ausrichtung im Laufe der Zeit stark ändert. Das nächste Feature (das auf GitHub30verfügbar sein wird), das für den Tracking-Modus entwickelt werden soll, ist die Option, nur bestimmte Zeitpunkte zu analysieren und einen Referenzzeitpunkt (anstelle des ersten Zeitpunkts) zu definieren, vor dem und nach dem die Erkennung durchgeführt wird, wodurch der Benutzer zumindest problematische Zeitpunkte vermeiden kann.

Drosophila ist nach wie vor ein wichtiges Modellsystem, um eine Vielzahl biologischer Fragen zu untersuchen und hat sich seit Jahrzehnten in der Weiterentwicklung von Wissen in vielen Disziplinen hervorgetan. Ein Merkmal, das es besonders auszeichnet, ist, dass es besonders gut für Live-Bildgebung geeignet ist. Die Fähigkeit, subzelluläre Prozesse oder das Verhalten von Zellen und Geweben in Echtzeit zu überwachen, trägt weiterhin zur Generierung von Schlüsselkonzepten bei, die für die Zell- und Entwicklungsbiologie relevant sind. Viele erfolgreiche Protokolle wurden von verschiedenen Gruppen entwickelt, um solche Drosophila-Proben lebendig und gesund zu halten, um das Verhalten der Probe und der fluoreszierenden Moleküle zu studieren. Organe und Gewebe aus der Fliege wie imaginäre Scheiben1,2, das Larvenhirn3,4,5,6, oder Eikammern von erwachsenen Weibchen7,8,9, oder der adulte Darm10 zum Beispiel kann extrahiert und in Kultur für die Bildgebung mit Zeitraffermikroskopie gehalten werden. Eine zentrale Herausforderung für die Live-Bildgebung besteht darin, sicherzustellen, dass die Probe für eine optimale Auflösung und unbeweglich in der Nähe der Bildfläche gehalten wird, ohne die Probenintegrität zu beeinträchtigen, die empfindlich auf mechanische Stöße reagieren kann. Um neuronale Stammzellen, sogenannte Neuroblasten oder Neuronen im Drosophila Larvenhirn, zu untersuchen, kann beispielsweise die Aufbewahrung von Proben in der Nähe der bildgebenden Oberfläche erreicht werden, indem man sie mit Kulturmedien in versiegelten Bildkammern11,12,13bedeckt. Dieser Ansatz lässt den Medienaustausch jedoch nicht so einfach zu und schränkt so den versuchsfreudigen Handlungsspielraum ein. Alternativ können Proben vorbereitet und auf Abdeckungen platziert werden, die behandelt werden, um die Haftung von Zellen zu erhöhen und Multi-Point-Besuchsmikroskopie und erweiterte Live-Zell-Bildgebung in offenen Kulturgerichten zu ermöglichen, die potenziell einen Medienaustausch ermöglichen, aber keine einfachen Mittel bieten, um Probendrift oder Verlust während des Medienaustauschs zu verhindern14,15.
Die Fibrin-Gerinnselmethode, die ursprünglich entwickelt wurde, um Meiose in lebenden Kranich-Fliegen-Spermatozyten16 zu untersuchen, ist speziell geeignet, um diese Probleme zu überwinden. Fibrinogen wird in einem relevanten Kulturmedium gelöst, die Proben, die in einem Tropfen dieser Lösung auf einer geeigneten Glas-Oberflächen-Bildkammer platziert und ausgerichtet sind, bevor Thrombin hinzugefügt wird, was zur schnellen Bildung eines unlöslichen Fibrin-Gerinnsels führt, eines klebrigen faserigen Netzes, das an der Glasoberfläche und den Proben haftet und gleichzeitig den Zugang der Probe zum Kulturmedium gewährleistet. Das Medium kann dann ausgetauscht werden, ohne die Gerinnsel- oder Probenposition zu stören. Der Austausch von Kulturmedien während der Bildgebung ist beispielsweise wünschenswert, wenn Inhibitoren wie bei der ursprünglichen Methode oder zum Auswaschen oder Pulsjagdexperimenten zugesetzt werden sollen oder wenn fluoreszierende Farbstoffe während der Livezellbildgebung zugesetzt werden sollen, während Zellen und Gewebe an Ort und Stelle gehalten werden. Fibrin-Gerinnsel eignen sich zur Abbildung von Drosophila-Geweben sowie einzelnen Zellen13,17. Fibrin-Gerinnsel können weiter verwendet werden, um Proben zu orientieren, die aufgrund ihrer Form oder anderer Eigenschaften normalerweise nicht in der gewünschten Weise durch Modulation der Probenposition innerhalb des Fibrin-Gerinnsels und der Form des Gerinnsels selbst ausgerichtet würden.
Hier stellen wir ein Update zu unseren aktuellen Fibrin Gerinnsel-basierten Bildgebungsmethoden zur Verfügung und stellen Werkzeuge für die segmentierungsbasierte Bildanalyse zur Verfügung und konzentrieren uns auf den Einsatz dieser Methode zur Untersuchung von Neuroblastenteilungen im sich entwickelnden Fliegenhirn. Wir verwenden routinemäßig die Fibrin Gerinnsel-Methode, um mehrere Proben in verschiedenen Gerinnseln in der gleichen Kulturschale zu folgen. Dies ermöglicht i) Die Bildgebung subzellulärer Ereignisse wie Zentromomverhalten oder mRNA-Lokalisierung live18,19, ii) Überwachung des Verhaltens von Proben bei der pharmakologischen Behandlung verschiedener Genotypen unter den gleichen bildgebenden Einstellungen mit Multipunkt-Besuchsmikroskopie20, iii) Untersuchung der Auswirkungen der akuten Hemmung der Enzyme21 und iv) Minimierung von Driften zur Untersuchung von Veränderungen in der Ausrichtung der Zellteilung von Zellen in ihrer physiologischen Umgebung auf gezielte Laser-Abl2. Während unerwünschte Wirkungen von Thrombin und Fibrinogen und dem Fibrin-Gerinnsel empirisch für jede Probe getestet werden müssen, Diese Methode ist grundsätzlich geeignet, jede Art von Probe zu immobilisieren, die durch Live-Zell-Bildgebung analysiert werden soll und in Drosophila wurde erfolgreich verwendet, um mehrere Aspekte der Neuroblasten Biologie5,19,20, sondern auch die Dynamik der zytosensorischen Projektionen der weiblichen Keimbahn Stammzellen23 und Veränderungen der Polarität bei akuter aPKC Hemmung der Follikelzellen von Drosophila weiblichen Eikammern21zu studieren.
Zeitrafferfluoreszenz-Bildgebung führt zur Generierung komplexer zeitaufgelöster 3D-Datensätze, die Methoden zum Extrahieren dieser quantitativen Informationen erfordern. Hier beschreiben wir unsere Weiterentwicklung von ImageJ-basierten24 Makros, die verwendet werden können, um das Driften in Hyperstacks und maßgeschneiderten ImageJ-Makros zu korrigieren, die eine halbautomatische Quantifizierung der Mehrkanalfluoreszenz am Zellkortex ermöglichen, die zur Quantifizierung kortikaler Proteine in Neuroblasten von Drosophila-Larval-Gehirnen oder von individuellen Strahlneuronen in der primären Zellkultur entwickelt wurde.

<table><tbody><tr><td>Albumin Rinderserum, BSA</td><td>Merck</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovie Serum, geeignet für Zellkultur</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen aus humanem Plasma</td><td>Sigma</td><td>F3879</td><td></td></tr><tr><td>Fluorschale für Zellkulturen - 35 mm, 23 mm Vertiefung</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>PP1 Analog (1NA-PP1)</td><td>Merck Millipore</td><td>529579</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex Spotplatte mit neun</td><td>Vertiefungen Sigma</td><td>CLS722085-18EA</td><td></td></tr><tr><td>Schneider's Insect</td><td>Medium Sigma</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin aus Rinderplasma</td><td>Merck</td><td>T4648</td><td></td></tr></tbody></table>

anwendungen der immobilisierung von drosophila-geweben mit fibrin-clots für live imaging

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Drosophila ist ein wichtiges Modellsystem, um eine Breite von biologischen Fragen zu studieren. Verschiedene Organe und Gewebe aus verschiedenen Entwicklungsstadien der Fliege wie imaginäre Scheiben, das Larvenhirn oder Eikammern von erwachsenen Weibchen oder der adulte Darm können extrahiert und in Kultur zur Bildgebung mit Zeitraffermikroskopie gehalten werden, was wertvolle Einblicke in die Zell- und Entwicklungsbiologie bietet. Hier beschreiben wir detailliert unser aktuelles Protokoll zur Zerlegung von Drosophila Larvenhirnen und stellen dann unseren aktuellen Ansatz zur Immobilisierung und Orientierung von Larvenhirnen und anderen Geweben auf einem Glasdeckel mit Fibrin-Gerinnseln vor. Diese Immobilisierungsmethode erfordert nur die Zugabe von Fibrinogen und Thrombin zum Kulturmedium. Es eignet sich für hochauflösende Zeitraffer-Bildgebung an invertierten Mikroskopen mehrerer Proben in derselben Kulturschale, minimiert das seitliche Driften, das häufig durch Bewegungen der Mikroskopstufe in der Multipoint-Besuchsmikroskopie verursacht wird, und ermöglicht das Hinzufügen und Entfernen von Reagenzien während der Bildgebung. Wir präsentieren auch maßgeschneiderte Makros, die wir routinemäßig verwenden, um sie beim Driften zu korrigieren und spezifische quantitative Informationen aus der Zeitrafferanalyse zu extrahieren und zu verarbeiten.

Immobilisierung von Drosophila Gewebe mit Fibrin Gerinnseln und Kultur Medium Austausch während der Live-Bildgebung. Nach der Zerlegung nach dem in Schritt 2 (Abbildung 1) vorgestellten Verfahren und immobilisierten Fibrin-Gerinnsel auf demselben Deckzettel nach dem in Schritt 3 (Abbildung 2) vorgestellten Verfahren wurden Larvenhirne, die GFP-markierte Bazooka (Baz::GFP) exdrücken, der Fliegenortholog des Polaritätsproteins Par-3 3 30 min in zeitrafferiger multilinker konfokaler Bildgebung abgebildet. Baz::GFP wird mit apkcas4kombiniert, einem Allel, das eine akute Hemmung der atypischen Proteinkinase C (aPKC) durch Zugabe des kleinen ATP-Analogs 1-NAPP120ermöglicht. 1-NAPP1 wurde daher nach dem in Schritt 4 vorgestellten Verfahren dem Kulturmedium hinzugefügt und die Live-Bildgebung für 2,5 h wieder aufgenommen. Kontrollgehirne, die eine wilde Version der Kinase aPKC trugen, reagierten nicht auf das ATP-Analog, während Gehirne, die zusätzlich eine analog-empfindliche Mutation von aPKC (apkcas4) trugen, eine Kontraktion des Neuroepithels und helle Cluster von Baz in Neuroblasten und deren Nachkommen zeigten ( Abbildung6, Video 1). Neuroblasten teilen sich während des Zeitraffers weiter, was darauf hindeutet, dass das Gewebe gesund bleibt, und das Gehirn zeigt trotz des Kulturmediumwechsels wenig Drift, was darauf hindeutet, dass sie gut immobilisiert sind. In ähnlicher Weise wurden nach der Seziertheit nach dem in27vorgestellten Verfahren Ovariole, die Baz::GFP ausdrückend in Fibrin-Gerinnseln auf demselben Deckzettel immobilisiert und für 8 min abgebildet wurden, woraufdurch die Anwendung von 1-NAPP1 die Kontraktion von apkcas4 mutierten Follikelzellen, aber nicht von Kontrollen induzierte (Abbildung 7, Video 2).
Korrektur der Seiten- und Fokusdrift mit MultiHyperstackReg. Ein Hyperstack, der sowohl die Seiten- als auch die Fokusdrift(Video 3, linkes Panel) anzeigt, wurde zuerst für die seitliche Drift korrigiert (Schritt 6.2, Abbildung 3, MittleresPanel), dann Fokusdrift (Schritt 6.3, Abbildung 4, Video 3, rechtes Panel) mit dem MultiStackReg-Plugin und dem MultiHyperstackReg-Makro, was zu einer erheblichen Reduzierung der im ursprünglichen Hyperstack beobachteten Bewegungen führt.
Kortikale Signalmessung mit rotierenden Linecans Ein Neuroblast, der Baz ausdrückt::GFP (grün) und das Transmembranprotein CD4, das mit einem Infrarotfluoreszenzprotein (CD4::mIFP, rot) markiert ist, wurde während einer Mitose abgebildet. Das CD4::mIFP-Signal wurde als Referenz verwendet, um den Kortex an verschiedenen Teilen des Neuroblasts mit Linescans zu erkennen (Schritt 7, Abbildung 5, Abbildung 8A–C) und das Baz::GFP-Signal wurde an den erkannten Positionen gemessen Abbildung 8D). Während ihrer Teilung polarisierten Neuroblasten vorübergehend, indem sie unterschiedliche und entgegengesetzte kortikale Domänen aufstellen: den apikalen Pol und den Basalpol. Baz definiert den apikalen Pol und konsequent das Baz::GFP-Signal am apikalen Pol des Neuroblasten und verringerte sich während der Teilung am Basalpol (Abbildung 8C,D). Die Position des Kortex wurde während des gesamten Zeitraffers zufriedenstellend nachverfolgt (Abbildung 8C, Video 4). Die Drosophila-Linien und Genotypen werden in der Zusatztabelle 1–2referenziert.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig06.jpg"> Abbildung 6: Anwendung eines ATP-Analogs auf immobilisierte Larvengehirne während der Live-Bildgebung. (A) Live-Bildgebung von zwei Larvengehirnen, die Baz exexzessiver exallert::GFP auf demselben Deckzettel immobilisiert. Das Kulturmedium wird bei 0 min auf eine Konzentration von 10 m des ATP-Analogs 1-NAPP1 umgestellt. Kontrollgehirne reagieren nicht sichtbar auf das ATP-Analog, während Gehirne, die eine analogempfindliche Mutation von aPKC (aPKCAS4) tragen, eine Kontraktion des Neuroepithels (Pfeilspitzen) und helle Ballhaufen von Baz in Neuroblasten und ihrer Nachkommen zeigen. Maximale Intensitätsprojektion von 33 Scheiben für eine Tiefe von 23 m. Skalenbalken: 20 M. (B) Vergrößerung des Neuroepithels. Maßstabsleiste: 10 M. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig07.jpg"> Abbildung 7: Anwendung eines ATP-Analogs auf immobilisierten Eikammern während der Live-Bildgebung. Live-Bildgebung von zwei Ovariolen, die Baz exzessiieren::GFP auf dem gleichen Deckschein immobilisiert. Das Kulturmedium wird bei 0 min auf eine Konzentration von 10 m des ATP-Analogs 1-NAPP1 umgestellt. Kontrolleierkammern reagieren nicht sichtbar auf das ATP-Analog, während Eikammern, die eine analogempfindliche Mutation von aPKC (aPKCAS4) tragen, eine Kontraktion des Epithels (Pfeilspitzen) zeigen, was schließlich zum scheinbaren Abbau von Haftknotenführt führt. Maximale Intensitätsprojektion von 33 Scheiben für eine Tiefe von 27 m. Maßstabsleiste: 20 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig08.jpg"> Abbildung 8: Messung des kortikalen Signals mit rotierenden Linecans. (A) Live D. melanogaster neuroblast expressing Baz::GFP (grün) und CD4::mIFP (rot). Cyan-Linien: anfängliche Scanlinien, die senkrecht zu verschiedenen kortikalen Zonen verfolgt werden, um sie zu messen. Maßstabsleiste: 5 m. (B) Identifikation des Kortex (dunkelblaue Linie) mit kortikalen Linien und CD4::mIFP (rot) als Referenzkanal. Cyan-Linie: Fläche, die durch den Parameter "Ummessen" definiert wird (hier 2 Pixel), wobei das Signal nach der Kortexerkennung gemessen wird. Skala bar: 2 m. (C) Cyan: kortikale Bereiche, die während einer Neuroblastenteilung durch die rotierende Linecans-Methode aus den anfänglichen Scanlinien identifiziert werden, die in (A) angezeigt werden, mit CD4::mIFP (rot) als Referenzkanal. Maßstabsleiste: 5 m. Pfeil: apikaler Pol. Pfeilspitze: Basalpol. (D) Messung der Baz::GFP-Signalintensität im Zeitverlauf in den beiden entsprechenden Zonen, die durch rotierende Linien in (C )identifiziert werden. Während der Mitose, Baz::GFP wird vorübergehend an der apikalen Pol des Neuroblasten angereichert und wird vom gegenüberliegenden Basalpol erschöpft. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig08large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Video 1: Anwendung des Medienaustauschs auf immobilisierte Larvengehirne während der Live-Bildgebung, um einen Inhibitor hinzuzufügen, dargestellt in Abbildung 6,Maßstabsleiste: 20 m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_1_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Video 2: Anwendung des Medienaustauschs auf immobilisierten Eikammern während der Live-Bildgebung, um einen Inhibitor hinzuzufügen, dargestellt in Abbildung 7,Maßstabsleiste: 20 m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_2_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Video 3: Korrektur von Seiten- und Fokusdrift mit MultiHyperStackReg. Live-Bildgebung eines Neuroblasten, der die Membransonde PH::GFP exzessither ausdrückt. Xy: einzelne Fokusebene. Xz: orthogonales Reslice. Links: vor Korrektur der Drift. Mitte: nach Korrektur der seitenseitigen Drift. Rechts: nach Korrektur die Seiten- und Fokusdrift, Skalenleiste: 10 m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_3_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Video 4: Erkennung des Kortex mit rotierenden Linien, dargestellt in Abbildung 8, Maßstabsleiste: 5 m. Bitte klicken Sie <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_4_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 1: Genotypen von abgebildeten Drosophila Gewebe. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_1_genotypes.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 2: Ursprung der verwendeten Transgene. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_2_origine_of_transgenes.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzende Codierungsdatei 1: Ursprung der verwendeten Transgene. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code1_MultiHyperstackReg.ijm" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Codierungsdatei 2: Ursprung der verwendeten Transgene. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code2_AutoHyperstackReg.ijm" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Codierungsdatei 3: Ursprung der verwendeten Transgene. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code3_RotatingLineScan.ijm" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Dieses Protokoll beschreibt Anwendungen der Probenimmobilisierung mit Fibrin-Gerinnseln, die Begrenzung des Driftens und das Hinzufügen und Auswaschen von Reagenzien während der Live-Bildgebung. Die Proben werden auf einen Tropfen Fibrinogen übertragen, der das Kulturmedium auf der Oberfläche eines Deckslips enthält, nach dem die Polymerisation durch Zugabe von Thrombin induziert wird.

Anwendungen der Immobilisierung von Drosophila-Geweben mit Fibrin-Clots für Live Imaging

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

Dieses Protokoll beschrieb die Immobilisierung der Probe mit Fibringerinnseln. Die Proben werden in einen Tropfen fibrinogenhaltiges Kulturmedium auf der Oberfläche eines Deckglases überführt, wonach die Polymerisation durch Zugabe von Thrombin induziert wird. Verwenden Sie unter einem Seziermikroskop einen Pinsel, um L3-Larven in eine Borosilikatglasschale mit neun Vertiefungen zu übertragen, die PBS enthält.Rühren Sie, um den größten Teil des Fliegenfutters von den Larven zu lösen, und geben Sie es in eine andere Vertiefung, die das Nährmedium enthält. Fassen Sie eine Larve mit einer Pinzette über ihren gesamten Durchmesser in der Mitte ihrer Körperlänge und übertragen Sie sie in eine andere Vertiefung der Borosilikatplatte, die 200 Mikroliter frisches Nährmedium enthält. Lassen Sie die Larve nicht frei.Um die Larve über ihren gesamten Durchmesser in zwei Hälften zu schneiden, schleifen Sie entweder den gegriffenen Bereich mit einer seitlichen Bewegung der Pinzettenspitzen oder schieben Sie eine Spitze eines anderen Pinzettenpaares zwischen die beiden Pinzettenspitzen, die die Larve halten. Verwenden Sie die Pinzette, um die Larve an ihrer Kutikula zu halten, und eine weitere Pinzette, um die Nagelhaut auseinanderzunehmen, ohne am Gehirn zu ziehen. Wiederholen Sie dies, bis die vom Gehirn ausgehenden Nerven sichtbar sind und die Organe, die das Gehirn mit den Mundwerkzeugen verbinden, zugänglich sind.Während Sie die Nerven, die aus dem Gehirn kommen, mit einer Zange festhalten, durchtrennen Sie mit der anderen Pinzette die Verbindung zwischen dem Gehirn und den Mundwerkzeugen und trennen Sie das Gehirn vom Rest der Nagelhaut. Halten Sie das Gehirn an den Axonen, die aus dem ventralen Nervenstrang kommen, und zupfen Sie die umgebenden Organe, indem Sie sie sanft vom Gehirn wegziehen. Fassen Sie dann mit der anderen Pinzette die Verbindung zwischen den Vorstellungsscheiben des Auges und dem Gehirn und durchtrennen Sie diese Verbindung, ohne am Gehirn zu ziehen.Stellen Sie sicher, dass das Gehirn angemessen von anderen Geweben befreit und nicht beschädigt wird. Entsorgen Sie das Gehirn, wenn es Anzeichen von Schäden zeigt. Pipettieren Sie die Beschichtungslösung mit einem P20-Ein- und Ausgang, um die Pipettenspitze zu beschichten, aspirieren Sie dann das Gehirn mit der beschichteten Spitze zusammen mit drei Mikrolitern Medium und pipettieren Sie es in einer anderen Vertiefung mit 200 Mikrolitern sauberem Kulturmedium heraus.Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis genügend Gehirne präpariert sind, und ersetzen Sie gelegentlich das Kulturmedium der Vertiefung, in der die Dissektionen durchgeführt werden. Verwenden Sie eine P20-Pipette mit beschichteter Spitze, um die präparierten Gehirne in eine andere Vertiefung der Borosilikatplatte zu übertragen, die 200 Mikroliter Kulturmedium und Fibrinogen enthält. Aspirieren Sie ein Gehirn zusammen mit neun Mikrolitern Kulturmedium und Fibrinogen.Wenn das Ende der Spitze fast den Boden des Deckglases der Zellkulturschale berührt, pipettieren Sie den Inhalt so aus, dass das Kulturmedium unmittelbar nach dem Verlassen der Pipettenspitze den Deckglas berührt. Verwenden Sie eine Spitze einer Pinzette oder eine geschlossene Pinzette, um das Gehirn sanft in das Kulturmedium und den Fibrinogentropfen zu schieben und zu positionieren. Wenn der ventrale Teil des Gehirns abgebildet werden muss, induzieren Sie die Fibrinogengerinnung, um das Gehirn innerhalb des Gerinnsels richtig auszurichten.Schieben Sie das Gehirn auf eine Seite des Tropfens. Berühren Sie mit der Pipettenspitze den Rand des Tropfens auf der gegenüberliegenden Seite des Gehirns und fügen Sie einen Mikroliter Thrombin hinzu. Warten Sie ein bis zwei Minuten, bis das Fibrinogen zu polymerisieren beginnt, was zur Bildung eines trüben Niederschlags an einer Seite des Tropfens führt, dann schieben und stecken Sie das Gehirn vorsichtig in das Fibringerinnsel, wobei Sie darauf achten, dass die ventrale Seite so nah wie möglich am Deckglas liegt, ohne das Gehirn zu verformen.Pipettieren Sie einen Mikroliter Thrombinlösung in der Nähe der Seite des Gehirns aus, die nicht in das Fibringerinnsel gesteckt ist. Warten Sie zwei bis drei Minuten, bis das zweite Fibringerinnsel ausgehärtet ist, und drücken Sie dann auf die Ränder des Gerinnsels, damit es stärker auf dem Deckglas haftet, und achten Sie darauf, das Gehirn nicht zu verformen. Wenn das Gehirn zu weit vom Deckglas entfernt zu sein scheint, bringen Sie es näher, indem Sie das Fibringerinnsel näher an das Gehirn drücken.Um das Fibringerinnsel für die Abbildung des dorsalen Teils des Gehirns zu induzieren, positionieren Sie das Gehirn in der Mitte des Tropfens, wobei der dorsale Teil dem Deckglas zugewandt ist. Berühren Sie mit einer P2-Pipette mit der Pipettenspitze den Rand des Tropfens auf der gegenüberliegenden Seite des Gehirns und pipettieren Sie einen Mikroliter Thrombin heraus. Warten Sie zwei bis drei Minuten, bis das Fibrinogen zu polymerisieren beginnt, was zur Bildung eines trüben faserigen Niederschlags führt, und drücken Sie dann auf die Ränder des Gerinnsels, damit es stärker am Deckglas haftet, und achten Sie darauf, das Gehirn nicht zu verformen.Wobei das Ende der Spitze etwa 0,5 Zentimeter über dem Gerinnsel positioniert ist, pipettieren Sie vorsichtig 390 Mikroliter Nährmedium ohne Fibrinogen tropfenweise auf das Gerinnsel. Geben Sie das Nährmedium nicht an die Seiten des Gerinnsels, da es sich dadurch vom Deckglas lösen kann. Um das überschüssige Thrombin auszuwaschen, nehmen Sie 300 Mikroliter aus der Schale und fügen Sie dann 300 Mikroliter sauberes Nährmedium hinzu, wobei Sie darauf achten, dass die Gerinnsel vollständig eingetaucht bleiben.Um Temperaturänderungen zu vermeiden, die zu Fokusänderungen führen, halten Sie die Lösung mit den Reagenzien auf der gleichen Temperatur wie die Kulturschale. Entfernen Sie den Deckel der Kulturschale, ohne die Schale selbst zu verschieben. Um die Entnahme zu erleichtern, legen Sie den Deckel der 35-Millimeter-Schale vor der Aufnahme kopfüber auf die Schale.Positionieren Sie eine P1000-Pipettenspitze nahe an der Oberfläche des Mediums in der Kulturschale und geben Sie vorsichtig das ausreichende Volumen der Reagenzlösung darauf ab, ohne starke Flussmittel zu erzeugen, die die Gerinnsel ablösen könnten. Um die Lösung in der Kulturschale zu homogenisieren, pipettieren Sie mit einer P200-Pipette langsam eine kleine Menge der Lösung fünfmal hinein und heraus. Setzen Sie den Deckel wieder auf, ohne die Kulturschale zu verschieben, und setzen Sie die Bildgebung fort.Als ein NAPP1 zu fibrinimmobilisierten Larvengehirnen hinzugefügt wurde, die GFP-markiertes Bazooka exprimierten, zeigten Gehirne, die eine analogsensitive Mutation von aPKC trugen, eine Kontraktion des neuralen Epithels sowie helle Cluster von Baz in Neuroblasten und ihren Nachkommen. Der Neuroblast teilte sich während des gesamten Zeitraffers weiter, was darauf hindeutet, dass das Gewebe gesund blieb. Und die Gehirne zeigten trotz des Wechsels des Kulturmediums nur eine geringe Drift.In ähnlicher Weise induzierte die Verabreichung eines NAPP1 an Eierstöcken, die GFP-markierte Bazooka exprimierten, die Kontraktion von analog sensitiven aPKC-mutierten follikulären Zellen, jedoch nicht von Kontrollen. Ein Hyperstack, der sowohl laterale als auch fokussierte Drift anzeigte, wurde zuerst um laterale Drift und dann um Fokusdrift korrigiert, was zu einer erheblichen Reduzierung der Bewegungen führte, die im ursprünglichen Hyperstack beobachtet wurden. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, ist es wichtig, das Gehirn in das teilweise polymerisierte Fibringerinnsel zu stecken, solange das Gerinnsel noch formbar, aber fest genug ist, um das Gehirn stabil zu halten.Experimentieren Sie mit der Manipulation leerer Gerinnsel und untersuchen Sie das Gerinnsel vorsichtig, während es polymerisiert, um zu überprüfen, wie stabil es ist.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir beschriebenen strukturellen Merkmale der Glia-neuromuskuläre Synapsen in einem Roman Inside-out Gewebe Vorbereitung der Live-Larven unter Verwendung von fluoreszierenden Farbstoffen mit der konfokalen Mikroskopie. Wir gekennzeichnet leben Neuronenendigungen mit fluoreszierenden primären Antikörper gegen HRP und auch visualisiert die perisynaptic Raum mit fluoreszierenden Dextrane.

Visualisierung der Live- Drosophila Glial-neuromuskulären Synapse mit Fluoreszenzfarbstoffen

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Mit Mikrofluidik-Chips für Live-Imaging-und Studienverletzungs Antworten in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

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Lernen Sie die Immobilisierung von Drosophila-Geweben mit Fibrin-Clots für Live-Imaging. Diese Methode minimiert Drift und ermöglicht die dynamische Beobachtung neuronaler Prozesse in Echtzeit.

Anwendungen der Immobilisierung von Drosophila-Geweben mit Fibrin-Clots für Live Imaging

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