Anwendungen der Immobilisierung von Drosophila-Geweben mit Fibrin-Clots für Live Imaging

Dieses Protokoll beschrieb die Immobilisierung der Probe mit Fibringerinnseln. Die Proben werden in einen Tropfen fibrinogenhaltiges Kulturmedium auf der Oberfläche eines Deckglases überführt, wonach die Polymerisation durch Zugabe von Thrombin induziert wird. Verwenden Sie unter einem Seziermikroskop einen Pinsel, um L3-Larven in eine Borosilikatglasschale mit neun Vertiefungen zu übertragen, die PBS enthält.

Rühren Sie, um den größten Teil des Fliegenfutters von den Larven zu lösen, und geben Sie es in eine andere Vertiefung, die das Nährmedium enthält. Fassen Sie eine Larve mit einer Pinzette über ihren gesamten Durchmesser in der Mitte ihrer Körperlänge und übertragen Sie sie in eine andere Vertiefung der Borosilikatplatte, die 200 Mikroliter frisches Nährmedium enthält. Lassen Sie die Larve nicht frei.

Um die Larve über ihren gesamten Durchmesser in zwei Hälften zu schneiden, schleifen Sie entweder den gegriffenen Bereich mit einer seitlichen Bewegung der Pinzettenspitzen oder schieben Sie eine Spitze eines anderen Pinzettenpaares zwischen die beiden Pinzettenspitzen, die die Larve halten. Verwenden Sie die Pinzette, um die Larve an ihrer Kutikula zu halten, und eine weitere Pinzette, um die Nagelhaut auseinanderzunehmen, ohne am Gehirn zu ziehen. Wiederholen Sie dies, bis die vom Gehirn ausgehenden Nerven sichtbar sind und die Organe, die das Gehirn mit den Mundwerkzeugen verbinden, zugänglich sind.

Während Sie die Nerven, die aus dem Gehirn kommen, mit einer Zange festhalten, durchtrennen Sie mit der anderen Pinzette die Verbindung zwischen dem Gehirn und den Mundwerkzeugen und trennen Sie das Gehirn vom Rest der Nagelhaut. Halten Sie das Gehirn an den Axonen, die aus dem ventralen Nervenstrang kommen, und zupfen Sie die umgebenden Organe, indem Sie sie sanft vom Gehirn wegziehen. Fassen Sie dann mit der anderen Pinzette die Verbindung zwischen den Vorstellungsscheiben des Auges und dem Gehirn und durchtrennen Sie diese Verbindung, ohne am Gehirn zu ziehen.

Stellen Sie sicher, dass das Gehirn angemessen von anderen Geweben befreit und nicht beschädigt wird. Entsorgen Sie das Gehirn, wenn es Anzeichen von Schäden zeigt. Pipettieren Sie die Beschichtungslösung mit einem P20-Ein- und Ausgang, um die Pipettenspitze zu beschichten, aspirieren Sie dann das Gehirn mit der beschichteten Spitze zusammen mit drei Mikrolitern Medium und pipettieren Sie es in einer anderen Vertiefung mit 200 Mikrolitern sauberem Kulturmedium heraus.

Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis genügend Gehirne präpariert sind, und ersetzen Sie gelegentlich das Kulturmedium der Vertiefung, in der die Dissektionen durchgeführt werden. Verwenden Sie eine P20-Pipette mit beschichteter Spitze, um die präparierten Gehirne in eine andere Vertiefung der Borosilikatplatte zu übertragen, die 200 Mikroliter Kulturmedium und Fibrinogen enthält. Aspirieren Sie ein Gehirn zusammen mit neun Mikrolitern Kulturmedium und Fibrinogen.

Wenn das Ende der Spitze fast den Boden des Deckglases der Zellkulturschale berührt, pipettieren Sie den Inhalt so aus, dass das Kulturmedium unmittelbar nach dem Verlassen der Pipettenspitze den Deckglas berührt. Verwenden Sie eine Spitze einer Pinzette oder eine geschlossene Pinzette, um das Gehirn sanft in das Kulturmedium und den Fibrinogentropfen zu schieben und zu positionieren. Wenn der ventrale Teil des Gehirns abgebildet werden muss, induzieren Sie die Fibrinogengerinnung, um das Gehirn innerhalb des Gerinnsels richtig auszurichten.

Schieben Sie das Gehirn auf eine Seite des Tropfens. Berühren Sie mit der Pipettenspitze den Rand des Tropfens auf der gegenüberliegenden Seite des Gehirns und fügen Sie einen Mikroliter Thrombin hinzu. Warten Sie ein bis zwei Minuten, bis das Fibrinogen zu polymerisieren beginnt, was zur Bildung eines trüben Niederschlags an einer Seite des Tropfens führt, dann schieben und stecken Sie das Gehirn vorsichtig in das Fibringerinnsel, wobei Sie darauf achten, dass die ventrale Seite so nah wie möglich am Deckglas liegt, ohne das Gehirn zu verformen.

Pipettieren Sie einen Mikroliter Thrombinlösung in der Nähe der Seite des Gehirns aus, die nicht in das Fibringerinnsel gesteckt ist. Warten Sie zwei bis drei Minuten, bis das zweite Fibringerinnsel ausgehärtet ist, und drücken Sie dann auf die Ränder des Gerinnsels, damit es stärker auf dem Deckglas haftet, und achten Sie darauf, das Gehirn nicht zu verformen. Wenn das Gehirn zu weit vom Deckglas entfernt zu sein scheint, bringen Sie es näher, indem Sie das Fibringerinnsel näher an das Gehirn drücken.

Um das Fibringerinnsel für die Abbildung des dorsalen Teils des Gehirns zu induzieren, positionieren Sie das Gehirn in der Mitte des Tropfens, wobei der dorsale Teil dem Deckglas zugewandt ist. Berühren Sie mit einer P2-Pipette mit der Pipettenspitze den Rand des Tropfens auf der gegenüberliegenden Seite des Gehirns und pipettieren Sie einen Mikroliter Thrombin heraus. Warten Sie zwei bis drei Minuten, bis das Fibrinogen zu polymerisieren beginnt, was zur Bildung eines trüben faserigen Niederschlags führt, und drücken Sie dann auf die Ränder des Gerinnsels, damit es stärker am Deckglas haftet, und achten Sie darauf, das Gehirn nicht zu verformen.

Wobei das Ende der Spitze etwa 0,5 Zentimeter über dem Gerinnsel positioniert ist, pipettieren Sie vorsichtig 390 Mikroliter Nährmedium ohne Fibrinogen tropfenweise auf das Gerinnsel. Geben Sie das Nährmedium nicht an die Seiten des Gerinnsels, da es sich dadurch vom Deckglas lösen kann. Um das überschüssige Thrombin auszuwaschen, nehmen Sie 300 Mikroliter aus der Schale und fügen Sie dann 300 Mikroliter sauberes Nährmedium hinzu, wobei Sie darauf achten, dass die Gerinnsel vollständig eingetaucht bleiben.

Um Temperaturänderungen zu vermeiden, die zu Fokusänderungen führen, halten Sie die Lösung mit den Reagenzien auf der gleichen Temperatur wie die Kulturschale. Entfernen Sie den Deckel der Kulturschale, ohne die Schale selbst zu verschieben. Um die Entnahme zu erleichtern, legen Sie den Deckel der 35-Millimeter-Schale vor der Aufnahme kopfüber auf die Schale.

Positionieren Sie eine P1000-Pipettenspitze nahe an der Oberfläche des Mediums in der Kulturschale und geben Sie vorsichtig das ausreichende Volumen der Reagenzlösung darauf ab, ohne starke Flussmittel zu erzeugen, die die Gerinnsel ablösen könnten. Um die Lösung in der Kulturschale zu homogenisieren, pipettieren Sie mit einer P200-Pipette langsam eine kleine Menge der Lösung fünfmal hinein und heraus. Setzen Sie den Deckel wieder auf, ohne die Kulturschale zu verschieben, und setzen Sie die Bildgebung fort.

Als ein NAPP1 zu fibrinimmobilisierten Larvengehirnen hinzugefügt wurde, die GFP-markiertes Bazooka exprimierten, zeigten Gehirne, die eine analogsensitive Mutation von aPKC trugen, eine Kontraktion des neuralen Epithels sowie helle Cluster von Baz in Neuroblasten und ihren Nachkommen. Der Neuroblast teilte sich während des gesamten Zeitraffers weiter, was darauf hindeutet, dass das Gewebe gesund blieb. Und die Gehirne zeigten trotz des Wechsels des Kulturmediums nur eine geringe Drift

In ähnlicher Weise induzierte die Verabreichung eines NAPP1 an Eierstöcken, die GFP-markierte Bazooka exprimierten, die Kontraktion von analog sensitiven aPKC-mutierten follikulären Zellen, jedoch nicht von Kontrollen. Ein Hyperstack, der sowohl laterale als auch fokussierte Drift anzeigte, wurde zuerst um laterale Drift und dann um Fokusdrift korrigiert, was zu einer erheblichen Reduzierung der Bewegungen führte, die im ursprünglichen Hyperstack beobachtet wurden. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, ist es wichtig, das Gehirn in das teilweise polymerisierte Fibringerinnsel zu stecken, solange das Gerinnsel noch formbar, aber fest genug ist, um das Gehirn stabil zu halten.

Experimentieren Sie mit der Manipulation leerer Gerinnsel und untersuchen Sie das Gerinnsel vorsichtig, während es polymerisiert, um zu überprüfen, wie stabil es ist.