Kristallisation und strukturelle Bestimmung eines Enzyms: Substratkomplex durch serielle Kristallisation in einem vielseitigen mikrofluidischen Chip

Hallo und herzlich willkommen in der Laborarchitektur und Reaktivität von RNA am Institut für Molekulare und Zellbiologie in Straßburg. Das Wachsen gut defrierender Kristalle ist ein entscheidender Schritt in jeder kristallographischen Studie. In diesem Video zeigen wir den Einsatz eines neuen mikrofluidischen Werkzeugs, um Kristalle eines Biomoleküls zu züchten und seine 3D-Struktur durch In-situ-Röntgenbeugung zu bestimmen.

Das mikrofluidische Gerät ChipX bietet mehrere Vorteile. Es wurde entwickelt, um Kristallisationsressourcen durch die Methode der Gegendiffusion zu miniaturisieren und zu erleichtern. Die Einrichtung ist einfach und wird mit Standard-Labormaterial durchgeführt.

Es ist auch für die direkte Charakterisierung von Kristallen optimiert, die im Chip durch serielle Röntgenkristallographie angebaut werden. ChipX eliminiert Kristallhandhabung und Kryokühlschritte und bewahrt die intrinsische Qualität der Kristalle, die vor Ort und bei Raumtemperatur analysiert werden. ChipX hat das Format eines Mikroskopschlittens, 7,5 x 2,5 Zentimeter.

Es enthält acht mikrofluidische Kanäle, die als Kristallisationskammern mit einem Abschnitt von 80 mal 18 Mikrometern und einer Länge von vier Zentimetern verwendet werden. Der Einlass auf der linken Seite ermöglicht die manuelle Injektion der Biomoleküllösung, die die acht Kanäle bis zu den Reservoirs füllt. Kristallisationslösungen werden in diesen Reservoirs auf der rechten Seite abgelagert.

Die Kristallisation wird durch ein Phänomen namens Gegendiffusion ausgelöst. Wenn das Kristallisationsmittel in die Biomoleküllösung diffundiert und eine Konzentration und einen Supersättigungsgradienten erzeugt. Etiketten und Bost entlang der Kanäle helfen, die Kristalle leichter zu lokalisieren.

Die Einrichtung eines Chips erfordert fünf bis sechs Mikroliter Biomoleküllösung bei einer typischen Konzentration von fünf bis zehn Milligramm pro Milliliter. Ein Mikroliter Paraffinöl, fünf Mikroliter Kristallisationslösung pro Reservoir und Klebeband. Das Beladen von ChipX erfolgt manuell mit einer Mikropipette und Standardspitzen.

In diesem Beispiel wird eine blaue Probenlösung für eine bessere Visualisierung des Injektionsprozesses verwendet. Um Leckagen zu vermeiden, wird die Spitze senkrecht zum Chip in den Probeneinlass eingesetzt. Ein Mikroliter Paraffinöl wird nach der Probe geladen, um die Kanäle voneinander zu trennen.

Der Probeneinlass wird dann mit Klebeband versiegelt. Die acht Reservoirs werden einzeln mit fünf Mikrolitern Kristallisationsmittellösung beladen. Dazu wird die Pipettenspitze in einem Winkel von etwa 45 Grad am Ende des Kanals platziert.

Dies verhindert die Bildung einer Luftblase zwischen der Probe und dem Kristallisationsmittel. Reservoirs können mit Cocktails gefüllt werden, die verschiedene Puffer, Polymere oder Salze, et cetera, zum Screening oder zur Optimierung enthalten. Reservoirs sind mit Klebeband versiegelt.

Wie hier gezeigt, ist das Einrichten eines Chips einfach und dauert nur wenige Minuten. In ChipX erfolgt die Kristallisation durch Gegendiffusion. In den Reservoirs abgelagerte Kristallisationsmittel diffundieren in die Kanäle, die das Biomolekül enthalten.

Dadurch entstehen Konzentrationsgradienten und Supersättigung, die eine Kristallisation auslösen. Dies sind Beispiele für Kristalle eines Enzyms, das in den Kanälen erhalten wird. Sie können wachsen, um die Kanäle zu füllen, die einen Querschnitt von 80 mal 80 Mikrometern haben.

Kristalle sind in ChipX durch Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung der natürlichen Fluoreszenz von Tryptophan-Rückständen unter UV-Licht oder, wie hier mit einem fluoreszierend markierten Protein gezeigt, leicht nachweisbar. Dieser Abschnitt zeigt eine Chris telegraphische Analyse, die an der Schweizer Lichtquelle in filaggrins Schweiz durchgeführt wurde. Die Chips können ohne zusätzliche Ausrüstung oder besondere Pflege zum Synchrotron getragen werden.

Betreten wir den Saal der Schweizer Lichtquelle. Elektronen zirkulieren im zentralen Ring und erzeugen ein breites Spektrum elektromagnetischer Wellen, einschließlich Röntgenstrahlen, die an verschiedenen Strahllinien genutzt werden. Dieses Video wurde bei X06 aufgenommen, einer Strahllinie, die der makromolekularen Kristallographie gewidmet ist.

Das Protokoll kann von einer Synchrotron-Anlage zur anderen wechseln, aber das Gesamtprinzip bleibt gleich. ChipX ist auf einem 3D-gedruckten Halter montiert. Dieser Halter wird dann am Magneten eines Standard-Goniometers befestigt.

Die serielle Analyse konsistent es sammeln Daten aus einer Reihe von Kristallen im Chip gewachsen. Listen von Kristallpositionen werden mit den Etiketten und Bost entlang der Chipkanäle erstellt. Die Forscher bewegen den Chip, um die Kristalle im Röntgenstrahl zu zentrieren, der durch das gelbe Fenster symbolisiert wird.

Ein schnelles Zentrieren wird mit dem Röntgenstrahl gestartet. Der Strahlanschlag geht an Ort und Stelle und der Detektor bewegt sich auf die Probe zu. Das Rasterscreening wird durchgeführt, um sicherzustellen, dass der Kristall mit dem Strahl ausgerichtet ist.

Das gleiche Verfahren wird nach dem Drehen des Chips um 30 Grad wiederholt. Der zweite Schritt ist wichtig, da das Spanmaterial einen Parallaxeneffekt erzeugt, der zu einer Verschiebung des Beugungsmaximums in Bezug auf die beobachtete Kristallposition führt. Sobald der Kristall im Strahl zentriert ist, beginnt die Datensammlung.

Diese Sequenz zeigt die Datenerfassung in Echtzeit an. Der Chip dreht sich um 30 Grad. In der Zwischenzeit werden entsprechende Beugungsbilder vom Detektor gesammelt.

Die Charakterisierung dieses Kristalls ist abgeschlossen. Der Chip in den nächsten Kristall im Kanal übersetzt und das ganze Verfahren wird wiederholt. Beachten Sie, dass diese Analyse vor Ort ohne direkte Handhabung des Kristalls und bei Raumtemperatur durchgeführt wird.

Die in einer Reihe von Kristallen gesammelten Daten werden dann zusammengeführt, um ein vollständiges Beugungs-Dataset zu erhalten, das zur Berechnung einer in Blau dargestellten Elektronendichtekarte und zum Erstellen des Atommodells verwendet wird. Das in diesem Video beschriebene Verfahren wurde im Rahmen der strukturellen Charakterisierung des enzymmodifizierenden Enzyms tRNA angewendet. Das CCA-addierte Enzym aus dem kalt angepassten Bakterium, Planococcus halocryophilus.

ChipX wurde verwendet, um das Enzym durch Gegendiffusion in Gegenwart von Ammoniumsulfid als Kristallisationsmittel zu kristallisieren. By-pyramidale Kristalle erschienen entlang der Kanäle, nach ein paar Tagen der Inkubation bei 20 Grad Celsius. Die fluoreszierende Kennzeichnung des Proteins erleichterte die Identifizierung von Proteinkristallen und deren Diskriminierung von Salzkristallen.

Eine Reihe von Kristallen wurde vor Ort und bei Raumtemperatur analysiert. Ihre Beugungsdaten wurden zusammengeführt und führten zur Kristallstruktur des APOE-Enzyms mit einer Auflösung von 2,5 Angstrom. Darüber hinaus wurde die diffuse Umgebung in Chipkanälen genutzt, um dem Enzym, das die Kristalle aufbaut, ein Substrat zu liefern.

Im vorliegenden Fall wurde den Reservoirlösungen zwei Tage vor der Synchrotronanalyse ein CTP-Analog hinzugefügt. Dadurch konnte die Verbindung diffus wirken und die katalytische Stelle des Enzyms erreichen. Wie in der Kristallstruktur des Komplexes gesehen, mit einer Auflösung von 2,3 angstrom bestimmt.

Das in diesem Video gezeigte Protokoll ist allgemein anwendbar und wurde an einer Vielzahl von Biomolekülen getestet. Zum Schluss kommt, dass ChipX ein Lab-Chip-Tool ist, das alle Schritte einer kristallographischen Studie integriert und es Ihnen ermöglicht, von der biomedizinischen Lösung zur Kristallstruktur in einem einzigartigen mikrofluidischen Gerät zu gelangen. Vielen Dank, dass Sie sich dieses Video angeschaut haben.

und wir hoffen, dass wir Sie von den Vorteilen der Verwendung von ChipX überzeugt haben, um die Kristallstruktur Ihrer Favoriten durch Biomolekül zu kristallisieren und zu bestimmen.