Verfeinerte CLARITY-basierte Gewebereinigung für die dreidimensionale Fibroblastenorganisation in gesunden und verletzten Mäuseherzen

Dieses neuartige Gewebereinigungsprotokoll verbessert die bestehende Technologie, um eine genauere In-vivo-Untersuchung bestimmter Zelltypen im Herzen und ihres Verhaltens unter Verletzungsbedingungen zu ermöglichen. Dieses Protokoll ist schnell und ziemlich einfach. Es ermöglicht die Aufrechterhaltung der Marca-Fluoreszenz mit minimaler Interferenz durch die automatische Hintergrundfluoreszenz des Hintergrundgewebes, ohne dass eine Zell- oder Gewebefärbung erforderlich ist.

Beginnen Sie mit der Verwendung eines mit 70% Ethanol getränkten Mullpads, um die ventrale Oberfläche der experimentellen Maus zu reinigen. Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen drei Zentimeter großen Querschnitt zu machen, etwa drei Meter unter dem Xiphoid-Prozess, und deglove die Maus vom Bauch zum Xiphoid-Prozess, um die Haut vom darunter liegenden Bauchwandgewebe zu trennen. Machen Sie einen zwei Zentimeter großen Querschnitt in das subkutane Bauchwandgewebe, drei Zentimeter unter dem Xiphoid-Prozess und machen Sie einen vertikalen Schnitt von diesem Schnitt bis zur Mittellinie durch den Brustkorb.

Stecken Sie den Brustkorb zurück, um das Herz freizulegen. Und verwenden Sie eine 10-Milliliter-Spritze, die mit einer 27-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um kaltes PBS in die obere Hohlvene und Aorta zu injizieren. Wenn das gesamte Blut aus dem Herzen gespült wurde, geben Sie 10 Milliliter kalte 4% PFA in die obere Hohlvene und Aorta, um den Fixierungsprozess zu beginnen.

Wenn das gesamte Fixiermittel geflasht wurde, schneiden Sie das Herz heraus und verwenden Sie ein gerades Klingenskalpell, um die Vorhöfe, den rechten Ventrikel und das Septum sowie den linken Ventrikel zu trennen. Legen Sie das Herz in ein 15-Milliliter-Konikusrohr mit kaltem 4% PFA für eine Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Nutator. Am nächsten Morgen eine 0,25% ige Photoinitiatorlösung zu einer frisch zubereiteten Hydrogellösung hinzufügen und das Herz auf das Hydrogel übertragen.

Wickeln Sie das konische Rohr in Folie für eine Nächtlichekubation bei vier Grad Celsius ohne körperliche Störung. Am nächsten Morgen erwärmen Sie die Tube in einem 37 Grad Celsius Perlenbad für 2,5 Stunden, bevor Sie das Herz mit einer Zinnen vorsichtig in eine 15-Milliliter-Tube PBS überführen. Waschen Sie das Herz dreimal in PBS für eine Stunde pro Wäsche bei 37 Grad Celsius auf einem Nutator und übertragen Sie das Herz in den Korb einer aktiven Elektrophoresemaschine.

Befestige den Deckel an Ort und Stelle und fülle den aktiven Elektrophoresekammerbehälter mit Elektrophorese-Clearing-Lösung. Sobald die Kammer voll ist, tauchen Sie den Korb in die Lösung und ziehen Sie die Kappe der Elektrophoresemaschine fest. Dann lassen Sie die Elektrophoresemaschine bei 1,5 Ampere und 37 Grad Celsius für 1,5 Stunden laufen.

Überprüfen Sie nach der Elektrophorese das Herz visuell, um sicherzustellen, dass kein undurchsichtiges Gewebe zurückbleicht. Waschen Sie das gereinigte Herz dreimal in einem 15-Milliliter-Zweifachen für eine Stunde in frischem PBS bei 37 Grad Celsius pro Waschgang auf einem Nutator. Vor dem Eintauchen des Herzens in ein Entfärbungsmittel, um die automatische Hämfluoreszenz zu reduzieren.

Waschen Sie das Herz nach 48 Stunden dreimal in PBS, wie gezeigt, und gleichen Sie das Herz in frisch zubereiteten RIMS für 48 Stunden vor der Bildgebung aus. Für die 3D-Bildgebung des gereinigten Herzens legen Sie zunächst eine dünne Schicht Vakuumfett auf den Boden eines 3D-gedruckten Bodenreservoirs, die gleiche Höhe wie die abgebildete Probe. Füllen Sie den Behälter mit RIMS und verwenden Sie eine Pipettenspitze, um Blasen zu entfernen.

Legen Sie das Herz vorsichtig mit der linksventrikulären Wand nach oben in die RIMS und achten Sie darauf, dass keine Blasen in die Lösung eingeführt werden. Verwenden Sie Vakuumfett, um einen Glasabdeckungsschlupf an der Unterseite eines 3D-gedruckten oberen Reservoirstücks zu befestigen, und legen Sie die oberen Reservoirabdeckungen auf die unteren Reservoirs, wobei Sie darauf achten, Blasen zu vermeiden. Dann füllen Sie die oberen Reservoirs mit Glycerin.

Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop, um die gereinigten Herzen abbilden. Die Kombination von verfeinerter Kardgewebereinigung mit 3D-Bildgebung ermöglicht eine erweiterte detaillierte Visualisierung von Herzfibroblasten. Mit dieser bildgebenden Technik wird beobachtet, dass Fibroblasten dicht gepackt sind und eine spindelförmige Morphologie in unverletzten Herzen aufweisen.

Nach einer Ischämie-Reperfusionsverletzung wird in den ersten drei Tagen nach der Verletzung ein Verlust von Herzfibroblasten in der ischämischen Region beobachtet. Am siebten und 14. Tag sind Fibroblasten migriert oder vermehrt, um den verletzten Gewebebereich wieder zu besiedigen. Am Tag 28 ist die Kardibroblastenpopulation, die die verletzten Bereiche des Herzens umgibt, am dichtesten.

Eineinhalb Tage nach einer Myokardinfarktverletzung verbleiben nur wenige Fibroblasten im verletzten linken Ventrikel. Am dritten Tag dehnen sich die Fibroblasten jedoch aus und sind im größten Teil des linken Ventrikels vorhanden. Im Gegensatz zur ischämischen Chirurgie führt die Infusion von Angiotensin zwei und Phenolefrin über mehrere Wochen nicht zu Herzgewebeverlust und Wandausdünnung.

Stattdessen richten sich die Fibroblasten entlang der Achse des rechtshändigen Helixkontraktionsmusters aus, wie es bei der Verwendung des verfeinerten Gewebereinigungsprotokolls zu sehen ist. Darüber hinaus erscheinen die Fibroblasten nach angiotensin zwei und Phenolefrin-Behandlung klein und abgerundet im Gegensatz zu der Spindelform, die in Modellen der Ischämie-Reprofusion und Myokardinfarktverletzung beobachtet wurde. Die elektrophoretische Reinigung muss sorgfältig durchgeführt werden, insbesondere bei der Arbeit mit Herzen, die Verletzungsprotokolle durchlaufen haben.

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um zu beurteilen, wie Herzfibroblasten auf Verletzungen in vivo reagieren. Verschiedene fluoreszierende Marker können auch verwendet werden, um zu verstehen, wie das Herz auf Verletzungen auf zellulärer Ebene reagiert.