Name: Quantitative Metabolomik von Saccharomyces Cerevisiae mittels Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Erfahren Sie quantitative Metabolomik von Saccharomyces cerevisiae mittels LC-MS/MS. Diese Methode ermöglicht die hochspezifische Analyse von über 370 wasserlöslichen Metaboliten mit optimiertem Quenching zur Minimierung von Leckage.

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Wir danken aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Titorenko-Labors für Gespräche. Wir danken dem Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, dem Centre for Structural and Functional Genomics und dem Centre for Microscopy and Cellular Imaging (alle an der Concordia University) für herausragende Leistungen. Diese Studie wurde durch Zuschüsse des Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) von Kanada (RGPIN 2014-04482 und CRDPJ 515900 - 17) unterstützt. K.M. wurde durch das Concordia University Armand C. Archambault Fellowship und den Concordia University Dean of Arts and Sciences Award of Excellence unterstützt.

1. Herstellung und Sterilisation eines Mediums für den Hefeanbau
<ol><li>Machen Sie 180 ml eines vollständigen Hefeextrakts mit Bactopepton (YP) Medium. Das komplette YP-Medium enthält 1% (w/v) Hefeextrakt und 2% (w/v) Bactopepton.</li>
	<li>180 ml des YP-Mediums gleichmäßig in vier 250-ml-Erlenmeyerkolben verteilen. Jeder dieser Kolben enthält 45 ml des YP-Mediums.</li>
	<li>Sterilisieren Sie die Kolben mit YP-Medium durch Autoklavieren bei 15 psi/121 °C für 45 min.</li>
</ol>2. Wildtyp-Hefestamm
<ol><li>Verwenden Sie den STAMM BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0).</li>
</ol>3. Hefe im YP-Medium mit 2% Glukose züchten
<ol><li>Sterilisieren Sie eine 20% (w/v) Stammlösung von Glukose durch Autoklavieren bei 15 psi/121 °C für 45 min.</li>
	<li>5 ml der autoklavierten 20%igen (w/v) Stammlösung von Glukose in jeden der beiden Erlenmeyerkolben mit 45 ml des sterilisierten YP-Mediums geben. Die Endkonzentration Glukose im YP-Medium beträgt 2% (w/v).</li>
	<li>Verwenden Sie eine mikrobiologische Schleife, um Hefezellen in jeden der beiden Erlenmeyerkolben mit dem YP-Medium mit 2% Glukose zu impfen.</li>
	<li>Züchten Sie die Hefezellen über Nacht bei 30 °C in einem Rotationsschüttler, der auf 200 U / min eingestellt ist.</li>
	<li>Nehmen Sie ein Aliquot der Hefekultur. Bestimmen Sie die Gesamtzahl der Hefezellen pro ml Kultur. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer.</li>
</ol>4. Zelltransfer zu und Zelle wächst im YP-Medium mit 2% Glukose
<ol><li>5 ml der sterilisierten 20% (w/v) Stammlösung von Glukose zu jedem der verbleibenden zwei Erlenmeyerkolben mit dem autoklavierten YP-Medium geben. Die Endkonzentration von Glukose beträgt 2% (w/v).</li>
	<li>Übertragen Sie ein Volumen der Hefekultur über Nacht in YP-Medium mit 2% Glukose, das die Gesamtzahl von 5,0 x 10 7 Zellen enthält, in jeden derbeiden Erlenmeyerkolben mit dem YP-Medium, das 2% Glukose enthält. Verwenden Sie eine sterile Pipette für den Zelltransfer.</li>
	<li>Züchten Sie die Hefezellen für mindestens 24 h (oder mehr, wenn das Experiment es erfordert) bei 30 °C in einem Rotationsschüttler, der auf 200 U / min eingestellt ist.</li>
</ol>5. Herstellung von Reagenzien, Vorbereitung von Laborgeräten und Einrichtung von Geräten zum Zellabschrecken
<ol><li>Bereiten Sie Folgendes vor: 1) eine Abschrecklösung (60% hochwertiges (>99,9%) Methanol in 155 mM Ammoniumbicarbonat (ABC) Puffer, pH = 8,0); 2) eine eiskalte ABC-Lösung (pH = 8,0); 3) ein digitales Thermometer, das bis zu -20 °C messen kann; 4) 500 ml große Zentrifugenflaschen; 5) eine vorgekühlte Hochgeschwindigkeitszentrifuge mit vorgekühltem Rotor und vorgekühlten 500 mL Zentrifugenflaschen für diesen Rotor, alle bei -5 °C; 6) Metabolitenextraktionsröhrchen (15 mL Hochgeschwindigkeits-Glaszentrifugenröhrchen mit mit Polytetrafluorethylen ausgekleideten Kappen); und 7) Trockeneis.</li>
</ol>6. Zellabschreckung
<ol><li>Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Anzahl der Hefezellen pro ml YP mit 2% Glukosekultur zu bestimmen.</li>
	<li>Übertragen Sie ein Volumen der Kultur in YP-Medium mit 2% Glukose, das die Gesamtzahl von 5,0 x 108 Zellen enthält, in vorgekühlte 500 ml Zentrifugenflaschen.</li>
	<li>Füllen Sie die Zentrifugenflasche mit den Zellen bis zum Volumen von 200 ml schnell mit einer bei -20 °C gelagerten Abschrecklösung.</li>
	<li>Zentrifuge die Flaschen in einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge bei 11.325 x g für 3 min bei -5 °C.</li>
	<li>Schnelle und zarte Rückgewinnung der Flasche aus der Zentrifuge; Schrauben Sie den Deckel vorsichtig ab und entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.</li>
	<li>Schnell das Zellpellet in 10 ml eiskaltem ABC-Puffer resuspendieren und die Suspension in ein 15 mL Hochgeschwindigkeits-Glaszentrifugenröhrchen mit einer mit Polytetrafluorethylen ausgekleideten Kappe zur Metabolitenextraktion überführen.</li>
	<li>Sammeln Sie Zellen durch Zentrifugation in einer klinischen Zentrifuge bei 3.000 x g für 3 min bei 0 °C.</li>
	<li>Entfernen Sie schnell den Überstand und legen Sie das Röhrchen auf Trockeneis, um mit der Metabolitenextraktion zu beginnen, oder lagern Sie das Röhrchen bis zur Extraktion bei -80 °C.</li>
</ol>7. Herstellung von Reagenzien, Laborgeräten und Geräten zur Metabolitenextraktion
<ol><li>Bereiten Sie Folgendes vor: 1) LC-MS-Chloroform; 2) LC-MS-Methanol; 3) LC-Qualität nano-reines Wasser; 4) LC-MS-Klasse (ACN); 5) Glasperlen (säuregewaschen, 425-600 μm); 6) ein Wirbel mit einem Schaumstoffrohrhalter-Kit mit Halterung; 7) 15 mL Hochgeschwindigkeits-Glaszentrifugenröhrchen mit polytetrafluorethylen-ausgekleideten Kappen; 8) MS-Durchstechflaschen; 9) Trockeneis; und 10) 1,5 ml Röhrchen einmal mit Ethanol, einmal mit ACN und einmal mit nanoreinem Wasser gewaschen. HINWEIS: Verwenden Sie nur Mikropipettenspitzen und -röhrchen aus Polypropylen, die gegen organische Lösungsmittel beständig sind.</li>
</ol>8. Metabolitenextraktion
<ol><li>Zu den Metaboliten, die auf Trockeneis aufbewahrt oder bei einem Röhrchen von -80 °C ab Schritt 6.7 gelagert werden, wird Folgendes hinzugefügt: 1) 2 ml Chloroform, das bei -20 °C gelagert wird; 2) 1 ml Methanol, gelagert bei -20 °C; 3) 1 ml eiskaltes nanoreines Wasser; und 4) 200 μL 425-600 μm säuregewaschene Glasperlen.</li>
	<li>Bedecken und schließen Sie den Mund eines Rohres mit Aluminiumfolie. Legen Sie die Rohre in ein Schaumrohrhalter-Kit mit Halterung und wirbeln Sie sie für 30 minuten bei mittlerer Geschwindigkeit (d. H. Bei einer Geschwindigkeit, die auf 6 eingestellt ist, wobei 12 die maximale Geschwindigkeit eines Wirbels ist) bei 4 ° C, um die Metabolitenextraktion zu erleichtern.</li>
	<li>Inkubieren Sie das Röhrchen für 15 minuten auf Eis (NICHT Trockeneis!), um die Proteinausfällung und die Trennung der oberen wässrigen von der unteren organischen Phase zu fördern.</li>
	<li>Zentrifuge das Röhrchen in einer klinischen Zentrifuge bei 3.000 x g für 10 min bei 4 °C. Dieser Zentrifugationsschritt ermöglicht es, die obere wässrige Phase (die wasserlösliche Metaboliten enthält) von der mittleren Schicht (die Zelltrümmer und Proteine enthält) und von der unteren organischen Phase (die hauptsächlich Lipide enthält) zu trennen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Mikropipette, um die obere wässrige Phase (400 μL) in ein gewaschenes und markiertes 1,5-ml-Röhrchen mit 800 μL ACN zu übertragen, das bei -20 °C gelagert wurde. HINWEIS: Nach dem Hinzufügen der oberen wässrigen Phase zu ACN, die bei -20 ° C gehalten wird, kommt es zu weißen Wolkenniederschlägen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Röhrchen mit der Probe in einer Tischzentrifuge bei 13.400 x g für 10 min bei 4 °C. HINWEIS: Der weiße Wolkenniederschlag verschwindet nach der Zentrifugation.</li>
	<li>800 μL aus dem oberen Teil einer Flüssigkeit in der Tube in eine markierte MS-Durchstechflasche geben. Lagern Sie die Probe bei 0 °C, bis sie mit LC-MS/MS analysiert wird.</li>
</ol>9. Herstellung von Reagenzien, Laborgeräten und Geräten für LC
<ol><li>Bereiten Sie Folgendes vor: 1) einen Wirbel; 2) ein Ultraschall-Ultraschallgerät; 3) MS-Glasfläschchen; 4) ein LC-System, das mit einer binären Pumpe, einem Entgaser und einem Autosampler ausgestattet ist; 5) eine zwitterionische Phasenchromatographiesäule (5 μm Polymer, 150 x 2,1 mm), die in der Materialtabellegenannt ist; 6) eine Säulenheizung; und 7) mobile Phasen, einschließlich Phase A (5:95 ACN:Wasser (v/v) mit 20 mM Ammoniumacetat, pH = 8,0) und Phase B (100% ACN).</li>
</ol>10. Trennung der extrahierten Metaboliten durch LC
<ol><li>Den Inhalt der MS-Durchstechflasche 15 Minuten lang einer Ultraschall beschallen.</li>
	<li>Wirbeln Sie die MS-Durchstechflasche 3x für 10 Sec bei Raumtemperatur (RT).</li>
	<li>Legen Sie die MS-Durchstechflasche in die Brunnenplatte.</li>
	<li>Halten Sie die Säule während des Chromatographen bei 45 °C und einem Durchfluss von 0,250 ml/min. Halten Sie die Probe in der Bohrplatte bei 0 °C. In Tabelle 1 finden Sie die LC-Gradienten, die während der Chromatographie verwendet werden müssen. HINWEIS: Ein repräsentatives Gesamtionenchromatogramm wasserlöslicher Metaboliten, die aus Zellen des Wildtypstamms BY4742 extrahiert wurden, ist in Abbildung 1 dargestellt. Die durch LC getrennten Metaboliten wurden durch eine massenspektrometrische Analyse identifiziert und quantifiziert, die im positiven Ionisationsmodus [ESI (+)] durchgeführt wurde, wie für Schritt 11 beschrieben.</li>
</ol>11. Massenspektrometrische Analyse von Metaboliten, die durch LC getrennt sind
<ol><li>Verwenden Sie ein Massenspektrometer mit beheizter Elektrospray-Ionisation (HESI) zur Identifizierung und Quantifizierung von wasserlöslichen Metaboliten, die durch LC getrennt wurden. Verwenden Sie den Analysator des Massenspektrometers für MS1-Ionen und den Detektor des Massenspektrometers für MS2-Ionen. Verwenden Sie die Einstellungen in Tabelle 2 und Tabelle 3 für die datenabhängige Erfassung von MS1- bzw. MS2-Ionen.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Probenvolumen von 10 μL für die Injektion sowohl im ESI- (+) als auch im ESI-Modus (-).</li>
</ol>12. Identifizierung und Quantifizierung verschiedener Metaboliten durch Verarbeitung von Rohdaten aus LC-MS/MS
<ol><li>Verwenden Sie die in der Materialtabelle genannte Software, um verschiedene wasserlösliche Metaboliten aus rohen LC-MS/MS-Dateien zu identifizieren und zu quantifizieren. Diese Software verwendet MS1 für die Metabolitenquantifizierung und MS2 für die Metabolitenidentifikation. Die Software nutzt die am umfangreichsten kuratierte Massenspektralfragmentierungsbibliothek, um die Metaboliten mit den LC-MS/MS-Rohdaten durch Abgleich von MS-Spektren zu kommentieren. Diese Software verwendet auch die genaue Masse von MS1 und Isotopenmusterabgleich, um Metaboliten mithilfe von Online-Datenbanken zu kommentieren. Weitere Informationen finden Sie in Abbildung 2.</li>
	<li>Nutzen Sie die Bibliothek der Datenbanken und Spektren, die online frei verfügbar ist (https://www.mzcloud.org), um nach MS2-Spektren der Rohdaten zu suchen.</li>
</ol>13. Membranintegritätstest durch Propidieniodid (PI)-Färbung und Fluoreszenzmikroskopie
<ol><li>Nachdem die Zelle wie für Schritt 6 beschrieben abgeschreckt wurde, waschen Sie die abgeschreckten Zellen gründlich mit 15 ml ABC-Puffer, um die Abschrecklösung zu entfernen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 5 min bei 0 °C.</li>
	<li>Das Zellpellet wird in 1 ml ABC-Puffer resuspendiert und 0,5 ml pi-Lösung (0,5 mg/ml) hinzugefügt.</li>
	<li>Ein Röhrchen mit der Probe 3x für 10 s durchträuchern und 10 min im Dunkeln und auf Eis inkubieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Röhrchen mit der Probe in einer Tischzentrifuge bei 13.400 x g für 10 min bei 4 °C.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und brauen Sie das Pellet in 1 ml ABC-Puffer wieder auf.</li>
	<li>Zentrifuge das Röhrchen bei 13.400 x g für 10 min bei 4 °C und entferne den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 weitere Male, um den an die Zelloberfläche gebundenen PI zu entfernen.</li>
	<li>Das Pellet wird in 300 μL ABC-Puffer resuspendiert. Legen Sie 10 μL der Suspension auf die Oberfläche eines Objektträgers.</li>
	<li>Erfassen Sie die Differentiellen Interferenzkontrast- (DIC) und Fluoreszenzmikroskopiebilder mit einem Fluoreszenzmikroskop. Verwenden Sie einen Filter, der bei den Anregungs- und Emissionswellenlängen von 593 nm bzw. 636 nm aufgestellt ist.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Software, um die Gesamtzahl der Zellen (im DIC-Modus) und die Anzahl der fluoreszierend gefärbten Zellen zu zählen. Verwenden Sie diese Software auch, um die Intensität der Färbung für einzelne Zellen zu bestimmen.</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Um das hier beschriebene Protokoll erfolgreich zu verwenden, befolgen Sie die unten beschriebenen vorbeugenden Maßnahmen. Chloroform und Methanol extrahieren verschiedene Substanzen aus Laborkunststoffen. Behandeln Sie sie daher mit Vorsicht. Vermeiden Sie die Verwendung von Kunststoffen in Schritten, die Kontakt mit einem dieser beiden organischen Lösungsmittel beinhalten. Verwenden Sie für diese Schritte Borosilikatglaspipetten. Diese Pipetten vor Gebrauch mit Chloroform und Methanol aufsteigen lassen. Verwenden Sie nu...

Wasserlösliche Metaboliten sind niedermolekulare Zwischenprodukte und Stoffwechselprodukte, die zu essentiellen zellulären Prozessen beitragen. Diese evolutionär konservierten Prozesse umfassen die Umwandlung von Nährstoffen in nutzbare Energie, die Synthese von Makromolekülen, Zellwachstum und -signalisierung, Zellzykluskontrolle, Regulierung der Genexpression, Stressreaktion, postkonlationale Regulierung des Stoffwechsels, Aufrechterhaltung der mitochondrialen Funktionalität, vesikulärer Zelltransport, Autophagie, Zellalterung und regulierter Zelltod1,2,3.
Viele dieser wesentlichen Rollen wasserlöslicher Metaboliten wurden durch Studien in der Knospenhefe S. cerevisiae1, 3,4,7,9,14,15 , 16,17,18,19,20,21,22entdeckt. Dieser einzellige Eukaryot ist ein nützlicher Modellorganismus zur Sezierung von Mechanismen, durch die wasserlösliche Metaboliten aufgrund seiner Zugänglichkeit zu fortgeschrittenen biochemischen, genetischen und molekularbiologischen Analysen zu zellulären Prozessen beitragen23,24,25,26. Obwohl die LC-MS/MS-Methoden der nicht-zielgerichteten Metabolomik zur Untersuchung der Rolle wasserlöslicher Metaboliten in knospenden Hefen3,18,22,27verwendetwurden,erfordert diese Art der Analyse die Verbesserung ihrer Vielseitigkeit, Robustheit, Empfindlichkeit und Fähigkeit, zwischen verschiedenen strukturellen Isomeren und stereoisomeren Formen dieser Metaboliten zu unterscheiden.
Die letzten Jahre sind geprägt von signifikanten Fortschritten bei der Anwendung der LC-MS/MS-Methoden der nicht-zielgerichteten Metabolomik auf die Profilierung wasserlöslicher Metaboliten in vivo. Viele Herausforderungen bei der Verwendung dieser Methodik bleiben jedoch2,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Zu diesen Herausforderungen gehören die folgenden. Erstens liegen die intrazellulären Konzentrationen vieler wasserlöslicher Metaboliten unter einer Empfindlichkeitsschwelle für die derzeit verwendeten Methoden. Zweitens ist die Effizienz des Abschreckens der Stoffwechselaktivität zu gering und das Ausmaß der abschreckenden Zellleckage von intrazellulären Metaboliten ist für aktuelle Methoden zu hoch; Daher unterschätzen die derzeit verwendeten Methoden die intrazellulären Konzentrationen wasserlöslicher Metaboliten. Drittens können die bestehenden Methoden die strukturellen Isomere (d. h. Moleküle mit der gleichen chemischen Formel, aber unterschiedlicher atomarer Konnektivität) oder Stereoisomere (d. h. Moleküle mit der gleichen chemischen Formel und atomaren Konnektivität, aber mit der unterschiedlichen atomaren Anordnung im Raum) spezifischer Metaboliten nicht unterscheiden; Dies verhindert die korrekte Annotation bestimmter Metaboliten durch die derzeit verwendeten Methoden. Viertens sind die vorhandenen massenspektralen Online-Datenbanken von Elternionen (MS1) und Sekundärionen (MS2) unvollständig; dies wirkt sich auf die korrekte Identifizierung und Quantifizierung spezifischer Metaboliten unter Verwendung der lc-MS/MS-Rohdaten aus, die mit Hilfe der aktuellen Methoden erzeugt wurden. Fünftens können die bestehenden Methoden keine einzige Art der Metabolitenextraktion verwenden, um alle oder die meisten Klassen von wasserlöslichen Metaboliten wiederherzustellen. Sechstens können die bestehenden Methoden nicht einen einzigen Typ der LC-Säule verwenden, um alle oder die meisten Klassen wasserlöslicher Metaboliten voneinander zu trennen.
Hier optimierten wir die Bedingungen für das Abschrecken der Stoffwechselaktivität in S. cerevisiae-Zellen, die Aufrechterhaltung der meisten wasserlöslichen Metaboliten in diesen Zellen vor der Extraktion und die Extraktion der meisten Klassen wasserlöslicher Metaboliten aus Hefezellen. Wir haben eine vielseitige, robuste und empfindliche Methode zur LC-MS/MS-basierten Identifizierung und Quantifizierung von mehr als 370 wasserlöslichen Metaboliten aus S. cerevisiae-Zellen entwickelt. Diese Methode der nicht zielgerichteten Metabolomik ermöglicht es, die intrazellulären Konzentrationen verschiedener Energieträgermoleküle, Nukleotide, Aminosäuren, Monosaccharide, Zwischenprodukte der Glykolyse und Tricarbonsäurezyklus-Zwischenprodukte zu beurteilen. Die entwickelte LC-MS/MS-Methode ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung verschiedener Strukturisomere und stereoisomerer Formen wasserlöslicher Metaboliten mit vielfältigen strukturellen, physikalischen und chemischen Eigenschaften.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Fisher Scientific</td><td>A9554</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumacetat</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11450</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonat</td><td>Sigma</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Bactopepton</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1420-2</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C297-4</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-10</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidin</td><td>Sigma</td><td>H8125</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucin</td><td>Sigma</td><td>L8912</td><td></td></tr><tr><td>L-Lysin</td><td>Sigma</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4564</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4564</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid</td><td>Thermo Scientific</td><td>R37108</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Hardware equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 ml Zentrifugenflaschen</td><td>Beckman</td><td>355664</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1100 Serie LC System</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1312A</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Scharzentrifuge</td><td>Beckman</td><td>6254249</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Zentrifugenrotor</td><td>Beckman</td><td>JA-10</td><td></td></tr><tr><td>Centra CL2 klinische Zentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>004260F</td><td></td></tr><tr><td>Digitales Thermometer</td><td>Omega</td><td>HH509</td><td></td></tr><tr><td>Schaumstoffrohrhalter Kit mit Halterung</td><td>Thermo Scientific</td><td>02-215-388</td><td></td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-pHILIC Zwitterion-Phasensäule (5&micro; m Polymer 150 x 2,1 mm)</td><td>Sigma Milipore</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Orbitrap Velos MS</td><td>Fisher Scientific</td><td>ETD-10600</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschall-Ultraschallgerät</td><td>Fisher Scientific</td><td>15337416</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>ZORBAX Bonus-RP, 80&Aring;, 2,1 x 150 mm, 5 & Mikro; m</td><td>Agilent Technologies</td><td>883725-901</td><td></td></tr><tr><td>Labormaterialien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-mL Probenfläschchen aus Glas mit teflonbeschichteten Kappen</td><td>Fisher Scientific</td><td>60180A-SV9-1P</td><td></td></tr><tr><td>Glasperlen (säuregewaschen, 425-600 &mu; m)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>15-mL Hochgeschwindigkeits-Zentrifugenröhrchen aus Glas mit Teflon-ausgekleideten Kappen</td><td>PYREX</td><td>05-550</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compound Discoverer 3.1</td><td>Fisher Scientific</td><td>V3.1</td><td></td></tr><tr><td>Hefestamm</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hefestamm BY4742</td><td>Dharmacon</td><td>YSC1049</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative metabolomik von saccharomyces cerevisiae mittels flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit tandem-massenspektrometrie

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Metabolomik ist eine Methodik zur Identifizierung und Quantifizierung vieler niedermolekularer Zwischenprodukte und Stoffwechselprodukte innerhalb einer Zelle, eines Gewebes, eines Organs, einer biologischen Flüssigkeit oder eines Organismus. Die Metabolomik konzentriert sich traditionell auf wasserlösliche Metaboliten. Das wasserlösliche Metabolom ist das Endprodukt eines komplexen zellulären Netzwerks, das verschiedene genomische, epigenomische, transkriptomische, proteomische und Umweltfaktoren integriert. Daher bewertet die metabolomische Analyse direkt das Ergebnis der Wirkung für all diese Faktoren in einer Vielzahl von biologischen Prozessen innerhalb verschiedener Organismen. Einer dieser Organismen ist die knospende Hefe Saccharomyces cerevisiae, ein einzelliger Eukaryot mit dem vollständig sequenzierten Genom. Da S. cerevisiae für umfassende molekulare Analysen geeignet ist, wird es als Modell für die Sezierung von Mechanismen verwendet, die vielen biologischen Prozessen innerhalb der eukaryotischen Zelle zugrunde liegen. Eine vielseitige Analysemethode zur robusten, empfindlichen und genauen quantitativen Bewertung des wasserlöslichen Metaboloms würde die wesentliche Methodik zur Sezierung dieser Mechanismen liefern. Hier stellen wir ein Protokoll für die optimierten Bedingungen der Stoffwechselaktivitätsabschreckung und wasserlöslichen Metabolitenextraktion aus S. cerevisiae-Zellen vor. Das Protokoll beschreibt auch den Einsatz der Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) zur quantitativen Analyse der extrahierten wasserlöslichen Metaboliten. Die hier beschriebene LC-MS/MS-Methode der nicht-zielgerichteten Metabolomik ist vielseitig und robust. Es ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung von mehr als 370 wasserlöslichen Metaboliten mit verschiedenen strukturellen, physikalischen und chemischen Eigenschaften, einschließlich verschiedener Strukturisomere und stereoisomerer Formen dieser Metaboliten. Zu diesen Metaboliten gehören verschiedene Energieträgermoleküle, Nukleotide, Aminosäuren, Monosaccharide, Zwischenprodukte der Glykolyse und Zwischenprodukte des Tricarbonzyklus. Die LC-MS/MS-Methode der nicht-zielgerichteten Metabolomik ist sensibel und ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung einiger wasserlöslicher Metaboliten in Konzentrationen von nur 0,05 pmol/μL. Die Methode wurde erfolgreich zur Beurteilung wasserlöslicher Metabolome von Wildtyp- und mutierten Hefezellen eingesetzt, die unter verschiedenen Bedingungen kultiviert wurden.

Um eine quantitative Bewertung von wasserlöslichen Metaboliten innerhalb einer Hefezelle zu verbessern, haben wir die Bedingungen der Zellabschreckung für den Metabolitennachweis optimiert. Das Zellabschrecken zu diesem Zweck beinhaltet einen schnellen Abknirschen aller enzymatischen Reaktionen innerhalb einer Zelle31,33,37,38. Ein solcher Stopp der zellulären S...

Wir präsentieren ein Protokoll zur Identifizierung und Quantifizierung von Hauptklassen wasserlöslicher Metaboliten in der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Die beschriebene Methode ist vielseitig, robust und sensibel. Es ermöglicht die Trennung von Strukturisomeren und stereoisomeren Formen wasserlöslicher Metaboliten voneinander.

Quantitative Metabolomik von Saccharomyces Cerevisiae mittels Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Dieses Protokoll hat viele Vorteile gegenüber der derzeit verwendeten Hefemetabolomik, da es eine hohe Spezifität, eine hohe Sensitivität und viele verschiedene Klassen von Metaboliten profilieren kann, einschließlich isomerer, isobarer, hydrophiler und hydrophober Moleküle. Die in diesem Protokoll verwendete Abschreckmethode stoppt alle enzymatischen Reaktionen und reduziert gleichzeitig das Austreten von Metaboliten aus den Zellen erheblich. Die in diesem Protokoll integrierte MS1-Bibliothek stammt aus den verschiedenen MS2-Läufen.Nach der Nachtkultur bei 30 Grad Celsius und 200 Umdrehungen pro Minute bestimmen Sie die Anzahl der Hefezellen pro Milliliter Kultur und fügen Sie fünf Milliliter sterilisierte 20% ige Glukoselösung zu jedem der beiden Erlenmeyerkolben hinzu, die 45 Milliliter autoklaviertes YP-Medium pro Kolben enthalten. Verwenden Sie eine sterile Transferpipette, um fünfmal 10 zu den siebten Hefezellen in jeden Kolben zu geben und die Hefezellen für mindestens 24 zusätzliche Stunden bei 30 Grad Celsius bei 200 Umdrehungen pro Minute zu züchten. Für die Metabolitenextraktion sammeln Sie nach der Kultur die Hefezellen durch Zentrifugation und entfernen Sie schnell den Überstand.Legen Sie das Röhrchen auf Trockeneis und geben Sie zwei Milliliter minus 20 Grad Celsius Chloroform, einen Milliliter minus 20 Grad Celsius Methanol, einen Milliliter eiskaltes Nano-Reinwasser und 200 Mikroliter 425 bis 600 Mikrometer säuregewaschene Glasperlen in die Zellen. Wenn die Perlen hinzugefügt wurden, legen Sie das mit Aluminiumfolie bedeckte Röhrchen in ein Schaumrohrhalter-Kit mit einem Retainer und wirbeln Sie die Probe für 30 Minuten bei mittlerer Geschwindigkeit bei vier Grad Celsius, um die Metabolitenextraktion zu erleichtern. Als nächstes inkubieren Sie das Röhrchen für 15 Minuten auf Eis, bevor Sie die Probe zentrifugieren, um die Trennung der oberen wässrigen Phase von den mittleren Trümmern und Protein- und unteren organischen Phasen zu ermöglichen.Verwenden Sie eine Mikropipette, um etwa 400 Mikroliter der oberen wässrigen Phase in ein gewaschenes und markiertes 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 800 Mikrolitern von minus 20 Grad Celsius Acetonitril zu übertragen. Zentrifugieren Sie dann die Probe und übertragen Sie 800 Mikroliter des oberen Teils des Überstands in eine markierte Massenspektrometrie-Durchstechflasche zur Null-Grad-Lagerung bis zur Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Analyse. Um die extrahierten Metaboliten zu trennen, ultraschallen Sie die Probenfläschchen für 15 Minuten, gefolgt von drei 10-Sekunden-Wirbeln bei Raumtemperatur.Nach dem Wirbeln die Durchstechflasche in die Bohrplatte des Flüssigkeitschromatographen legen und die Säule auf 45 Grad Celsius mit einer Durchflussrate von 0,25 Millilitern pro Minute und die Bohrplatte auf null Grad Celsius einstellen. Verwenden Sie dann die Tabelle, um die Flüssigkeitschromatographie-Gradienten für die Analyse einzustellen. Verwenden Sie nach der Trennung 10 Mikroliter Probenvolumina der Injektion sowohl im positiven als auch im negativen Elektrospray-Ionisationsmodus in einem Massenspektrometer, das mit beheizter Elektrospray-Ionisation ausgestattet ist, um die wasserlöslichen Metaboliten zu identifizieren und zu quantifizieren.Öffnen Sie am Ende der Analyse die Rohdaten in einem geeigneten Softwareprogramm für die Verbindungsanalyse und verwenden Sie die Bibliothek für die massenspektrale Fragmentierung, um die Massenspektren abzugleichen, um die in der Analyse identifizierten Metaboliten zu kommentieren. Die genauen Massen der MS1- und Isotopenmuster können ebenfalls identifiziert werden, um eine Annotation der Metaboliten mithilfe von Online-Datenbanken zu ermöglichen. Verwenden Sie dann die Bibliothek der Datenbanken und Spektren, um nach den MS2-Spektren der Rohdaten zu suchen.Am nächsten Tag, nach dem Abschrecken der Hefezellen, waschen Sie die Zellen gründlich mit 15 Milliliter ABC-Puffer und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter frischem ABC-Puffer und geben Sie 500 Mikroliter der Propidiumiodidlösung zu den Zellen. Wirbeln Sie die Probe dreimal für 10 Sekunden pro Wirbel durch und inkubieren Sie die Zellen für 10 Minuten auf Licht geschütztem Eis.Am Ende der Inkubation sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und waschen die Zellen dreimal mit einem Milliliter frischem ABC-Puffer pro Waschgang. Nach der letzten Wäsche das Pellet in 300 Mikrolitern frischem ABC-Puffer wieder aufschnen und 10 Mikroliter der resultierenden Zellsuspension zu einem Objektträger geben. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um differentielle Interferenzkontrast- und Fluoreszenzmikroskopiebilder der Zellen mit den Filtern auf eine Anregungswellenlänge von 593 Nanometer und eine Emissionswellenlänge von 636 Nanometer einzustellen.Verwenden Sie dann ein geeignetes Bildanalyseprogramm, um die Gesamtzahl der Zellen in den Hellfeld- und Fluoreszenzbildern zu zählen und die Fluoreszenzintensität der Färbung für einzelne Zellen zu bestimmen. Das modifizierte Zellabschreckverfahren verursacht deutlich geringere Schäden an Plasmamembran und Zellwand als das nicht gepufferte 80%ige Methanol bei minus 40 Grad Celsius Abschreckmethode. Tatsächlich weisen fast alle Zellen, die mit der modifizierten Methode abgeschreckt werden, eine rote Fluoreszenzemission auf, die für Hefezellen charakteristisch ist, bei denen die Plasmamembran und die Zellwand nicht beschädigt sind.Im Gegensatz dazu zeigten fast alle Zellen, die mit dem nicht gepufferten 80% Methanol bei 40 Grad Celsius-Methode abgeschreckt wurden, eine grüne Fluoreszenzemission, die für Hefezellen charakteristisch ist, bei denen die Plasmamembran und die Zellwand signifikant geschädigt sind. Die modifizierte Zellabschreckmethode bewirkt auch eine deutlich geringere Leckage von wasserlöslichen Metaboliten aus Hefezellen als die nicht gepufferte 80%ige Methanolmethode bei minus 40 Grad Celsius Abschreckmethode. Die Retentionszeitverschiebungswerte der wasserlöslichen Metabolitenstandards sind signifikant niedriger und die Peakformen sind für die zwitterionische Phasensäule wesentlich schärfer als für die Umkehrphasensäule.Ein weiterer Vorteil der Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Methode ist die Fähigkeit, die zwitterionische Phasensäule zu verwenden, um verschiedene wasserlösliche Metaboliten mit verschiedenen strukturellen, physikalischen und chemischen Eigenschaften effizient zu trennen. Stellen Sie sicher, dass Sie das Propidiiumiodid im Dunkeln stehen und stellen Sie sicher, dass Sie die obere Phase sammeln, ohne die mittlere Phase zu stören. Wenn ein MSP aufgrund des Fehlens der MS2-Spektralbibliothek nicht mit Anmerkungen versehen werden kann, verwenden Sie eine NMR, um diese Struktur zu veranschaulichen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

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Quantitative Metabolomik von Saccharomyces Cerevisiae mittels Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (Video) | JoVE Journal

Quantitative Metabolomik von Saccharomyces Cerevisiae mittels Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

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