Name: In-Nucleus Hi-C in Drosophila-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Lernen Sie das In-Nucleus Hi-C-Protokoll zur hochaufgelösten Kartierung von Chromatin-Interaktionen in Drosophila-Zellen. Diese Methode ermöglicht funktionelle Studien genetischer Elemente an TAD-Grenzen.

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Diese Arbeit wurde durch die ZUSCHUSSNUMMER IN207319 des UNAM Technology Innovation and Research Support Program (PAPIIT) und die Fördernummer 303068 des Science and Technology National Council (CONACyT-FORDECyT) unterstützt. == ist ein Masterstudent, der vom Science and Technology National Council (CONACyT) CVU Nummer 968128 unterstützt wird.

1. Fixierung
<ol><li>Beginnen Sie mit 10 Millionen Schneider's Line 2 plus (S2R+) Zellen, um 17,5 ml einer Zellsuspension in Schneider-Medium herzustellen, das 10% fetales Rinderserum (FBS) bei Raumtemperatur (RT) enthält.</li>
	<li>Fügen Sie methanolfreies Formaldehyd hinzu, um eine Endkonzentration von 2% zu erhalten. Mischen und inkubieren Sie für 10 Minuten bei RT, wobei Sie darauf achten, jede Minute zu mischen. HINWEIS: Formaldehyd ist eine gefährliche Chemikalie. Befolgen Sie die entsprechenden Gesundheits- und Sicherheitsvorschriften und arbeiten Sie im Abzug.</li>
	<li>Löschen Sie die Reaktion durch Zugabe von Glycin, um eine Endkonzentration von 0,125 M zu erreichen, und mischen Sie. Inkubieren Sie für 5 Minuten bei RT, gefolgt von 15 Minuten auf Eis.</li>
	<li>Zentrifuge für 400 × g bei RT für 5 min und dann für 10 min bei 4 °C; Verwerfen Sie den Überstand. Das Pellet vorsichtig in 25 ml kalter 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung wieder auffüllen.</li>
	<li>Zentrifuge bei 400 × g für 10 min bei 4 °C, dann den Überstand entsorgen. HINWEIS: Wenn Sie mit dem Protokoll fortfahren, fahren Sie mit Schritt 2.1 für die Lyse fort. Andernfalls wird das Pellet in flüssigkeitsN2 eingefroren und bei -80 °C gelagert.</li>
</ol>2. Lyse
<ol><li>Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml eiskaltem Lysepuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8; 0,2% nichtionisches Tensid (siehe Materialtabelle);10 mM NaCl; 1x Proteaseinhibitoren) und stellen Sie das Volumen mit eiskaltem Lysepuffer auf 10 ml ein. Stellen Sie das Volumen ein, um eine Konzentration von 1 × 106 Zellen/ml zu erhalten. 30 Minuten auf Eis inkubieren und alle 2 Minuten durch Umkehren der Röhrchen mischen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Kerne bei 300 × g für 5 min bei 4 °C und entsorgen Sie dann vorsichtig den Überstand. Waschen Sie das Pellet 1x mit 1 ml Kaltlysepuffer und geben Sie es in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Waschen Sie das Pellet 1x mit 1 ml kaltem 1,25-fachem Restriktionspuffer und resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 360 μL 1,25x Restriktionspuffer.</li>
	<li>Fügen Sie 11 μL 10% Natriumdodecylsulfat (SDS) pro Röhrchen (0,3% Endkonzentration) hinzu, mischen Sie sorgfältig durch Pipettieren und inkubieren Sie bei 37 °C für 45 min, schütteln Sie bei 700-950 U / min. Pipetieren Sie auf und ab, um Klumpen während der Inkubation einige Male zu stören.</li>
	<li>Löschen Sie das SDS durch Zugabe von 75 μL nichtionischem Tensid (10% ige Lösung, siehe Materialtabelle)pro Röhrchen (1,6% Endkonzentration) und inkubieren Sie bei 37 °C für 45 min, schütteln Sie es bei 950 U / min. Pipeten Sie ein paar Mal auf und ab, um Klumpen während der Inkubation zu stören. HINWEIS: Wenn Klumpen groß und schwer zu stören sind, verringern Sie die Drehzahl während SDS- und Tensidbehandlungen auf 400 U / min. Wenn die Klumpen durch Pipettieren schwer zu disaggregieren sind, teilen Sie die Probe in zwei Teile; Passen Sie die Volumina von Restriktionspuffer, SDS und Tensid an; und fahren Sie mit der Permeabilisierung fort. Als nächstes drehen Sie die Kerne mit minimaler Geschwindigkeit (200 × g),entsorgen Sie vorsichtig den Überstand, bündeln Sie die Proben in einem 1X-Restriktionspuffer und fahren Sie mit dem Aufschluss fort. Nehmen Sie ein Aliquot von 10 μL als unverdaute Probe (UD).</li>
</ol>3. Enzymatische Verdauung
<ol><li>Verdauen Sie das Chromatin durch Zugabe von 200 Einheiten (U) Mbo I pro Röhrchen und inkubieren Sie bei 37 °C für einen Zeitraum von 4 h bis über Nacht während des Drehens (950 U / min).</li>
	<li>Fügen Sie am nächsten Tag zusätzliche 50 U Mbo I pro Rohr hinzu und inkubieren Sie bei 37 ° C für 2 h, während Sie drehen (950 U / min).</li>
	<li>Inaktivieren Sie das Enzym, indem Sie die Röhrchen bei 60 °C für 20 min inkubieren. Legen Sie die Schläuche auf Eis. HINWEIS: Nehmen Sie ein Aliquot von 10 μL als verdaute Probe (D).</li>
</ol>4. Biotinylierung von DNA-Enden
<ol><li>Um die Restriktionsfragmentüberhänge zu füllen und die DNA-Enden mit Biotin zu kennzeichnen, fügen Sie jeweils 1,5 μL von 10 mM dCTP, dGTP, dTTP, 20 μL von 0,4 mM Biotin dATP, 17,5 μL Tris Low-EDTA (TLE) Puffer [10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0] und 10 μL von 5 U / μL Klenow (DNA Polymerase I großes Fragment) zu allen Röhrchen hinzu. Vorsichtig mischen und 75 min bei 37 °C inkubieren. Schütteln Sie bei 700 U / min alle 10 s für 30 s. Legen Sie alle Schläuche auf Eis, während Sie die Ligationsmischung vorbereiten.</li>
</ol>5. Ligatur
<ol><li>Jede verdaute Chromatinmischung wird in ein separates 1-ml-Röhrchen mit Ligationsmischung (100 μL 10x Ligationspuffer, 10 μL 10 mg/ml Rinderserumalbumin, 15 HE T4-DNA-Ligase und 425 μL doppelt destilliertes Wasser [ddH2O]) übertragen. Durch sanftes Pipettieren gründlich mischen und über Nacht bei 16 °C inkubieren.</li>
</ol>6. Vernetzungsumkehr und DNA-Reinigung
<ol><li>Bauen Sie Proteine durch Zugabe von 50 μL 10 mg/ml Proteinase K pro Röhrchen ab und inkubieren Sie sie bei 37 °C für 2 h. Umgekehrte Vernetzung durch Erhöhung der Temperatur auf 65 °C und Inkubation über Nacht.</li>
	<li>RNA durch Zugabe von 20 μL 10 mg/ml RNase A abbauen und 1 h lang bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Führen Sie eine Phenol:Chloroform-Extraktion durch, gefolgt von einer Ethanolfällung.<ol>
<li>Fügen Sie 1 Volumen Phenol-Chloroform hinzu und mischen Sie gründlich durch Inversion, um eine homogene Weißphase zu erhalten. HINWEIS: Phenol ist eine gefährliche Chemikalie. Befolgen Sie die entsprechenden Gesundheits- und Sicherheitsvorschriften. Arbeiten Sie im Abzug.</li>
		<li>Zentrifuge bei 15.000 × g für 15 min. Die wässrige Phase in ein frisches 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Führen Sie eine Rückextraktion der unteren Schicht mit 100 μL TLE-Puffer durch und übertragen Sie die wässrige Phase in dasselbe 2-ml-Röhrchen.</li>
		<li>Ausfällung der DNA durch Zugabe von 2 Volumina 100% Ethylalkohol (EtOH), 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat und 2 μL 20 mg/ml Glykogen. Bei -20 °C für einen Zeitraum von 2 h bis über Nacht inkubieren.</li>
		<li>Bei 15.000 × g 30 min bei 4 °C schleudern und die Pellets 2x mit eiskaltem 70% EtOH waschen. Trocknen Sie die Pellets bei RT und bürsten Sie sie in 100 μL TLE-Puffer wieder auf. Quantifizieren Sie die DNA mit einem fluorogenen Farbstoff, der selektiv an DNA bindet, und einem Fluorometer gemäß den Anweisungen des Herstellers (Materialtabelle). HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Lagern Sie Ligationsprodukte kurzfristig bei 4 °C oder langfristig bei -20 °C. Verwenden Sie ein Aliquot (100 ng) des Materials als ligierte Probe (L) zur Qualitätskontrolle.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Bewerten Sie die Qualität der Hi-C-Vorlage
<ol><li>Qualitative Kontrollen von Verdauung und Ligation<ol>
<li>Reinigen Sie DNA von den UD- und D-Aliquoten, indem Sie die Vernetzungen umkehren, und führen Sie die Phenol:Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung wie oben beschrieben durch.</li>
		<li>Laden Sie 100 ng UD-, D- und L-Proben in ein 1,5% iges Agarosegel. Suchen Sie nach einem Abstrich um 500 bp in der D-Probe im Vergleich zu einem hochmolekularen Band für die L-Probe (siehe repräsentative Ergebnisse).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aufschlusseffizienz quantitative Kontrolle HINWEIS: Um die Aufschlusseffizienz genauer zu beurteilen, verwenden Sie die UD- und D-Proben als Vorlagen, um quantitative Polymerase-Kettenreaktionen (qPCR) mit Primern durchzuführen, die wie folgt entwickelt wurden.<ol>
<li>Entwerfen Sie ein Primerpaar, das ein DNA-Fragment amplifiziert, das die DNA-Restriktionsstelle für das für die Verdauung verwendete Enzym (Mbo I im vorliegenden Protokoll) enthält, das in der Formel in Schritt 7.2.3 R genannt wird.</li>
		<li>Entwerfen Sie ein Primerpaar, das ein Kontroll-DNA-Fragment amplifiziert, das nicht die Restriktionsstelle für das für die Verdauung verwendete Enzym (Mbo I für das vorliegende Protokoll) enthält, das in der Formel in Schritt 7.2.3 als C bezeichnet wird.</li>
		<li>Verwenden Sie die Zyklusschwellenwerte (Ct-Werte) der Verstärkung, um die Restriktionseffizienz gemäß der unten gezeigten Formel zu berechnen: % Restriktion = 100 - 100/2{(CtR - CtC)D - (CtR - CtC)UD} Dabei bezieht sich CtR auf den Ct-Wert von Fragment R und CtC auf den Ct-Wert des Fragments C für Probe D und Probe UD. HINWEIS: Der Restriktionsprozentsatz spiegelt die Effizienz des Restriktionsenzyms wider, das das eingeschränkte (R) DNA-Fragment spaltet, verglichen mit einem Kontroll-DNA-Fragment (C), das die Restriktions-DNA-Stelle nicht enthält. Ein Restriktionswirkungsgrad von ≥ 80% wird empfohlen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erkennung bekannter Wechselwirkungen<ol>
<li>Führen Sie eine PCR durch, um eine interne Ligationskontrolle zu verstärken, um Wechselwirkungen mit kurzer und/oder mittlerer oder langer Reichweite zu untersuchen (siehe repräsentative Ergebnisse).</li>
		<li>Alternativ können Primer zur Verstärkung eines Ligationsprodukts, bei dem sich die Primer in Vorwärts-Vorwärts- oder Rückwärts-Rückwärts-Ausrichtung in benachbarten Restriktionsfragmenten befinden, entwerfen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fill-in- und Biotin-Markierungskontrolle<ol>
<li>Überprüfung der Hi-C-Markierung und Ligationseffizienz durch Amplifikation und Verdauung einer bekannten Wechselwirkung oder eines Ligationsprodukts zwischen benachbarten Restriktionsfragmenten im Genom, wie oben beschrieben. HINWEIS: Erfolgreiches Fill-in und Ligation der Mbo I-Stelle (GATC) erzeugt eine neue Stelle für das Restriktionsenzym Cla I (ATCGAT) an der Ligationsstelle und regeneriert die Mbo-I-Stelle.</li>
		<li>Verdauen Sie das PCR-Produkt mit Mbo I, Cla I oder beidem. Nachdem Sie die Proben mit einem 1,5-2% igen Gel ausgeführt haben, schätzen Sie die relative Anzahl der 3C- und Hi-C-Ligationsverbindungen, indem Sie die Intensität der geschnittenen und ungeschnittenen Bänder quantifizieren26. HINWEIS: Ein Wirkungsgrad von > 70% ist erwünscht (siehe repräsentative Ergebnisse).</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Beschallung
<ol><li>Beschallen Sie die Proben, um 200-500 bp DNA-Fragmente zu erhalten. Für das in diesem Protokoll verwendete Instrument (siehe Materialtabelle) verdünnenSie die Probe (von 5 bis 10 μg) in 130 μL ddH2O pro Röhrchen und stellen Sie das Instrument auf 400 bp ein: Füllstand: 10; Zollfaktor: 10%; Spitzenleistung (w): 140; Zyklen pro Burst: 200; Zeit(en): 80.</li>
</ol>9. Biotinentfernung/Endreparatur
HINWEIS: Die unten gezeigten Schritte sind für 5 μg Hi-C-DNA angepasst.
<ol><li>Um die Biotinentfernung durchzuführen, wird die Probe (130 μL) in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Fügen Sie 16 μL 10x Ligationspuffer, 2 μL 10 mM dATP, 5 μL T4 DNA Polymerase (15U) und 7 μL ddH2O (160 μL Gesamtvolumen) hinzu. Bei 20 °C 30 min inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 5 μL von 10 mM dNTPs, 4 μL 10x Ligationspuffer, 5 μL T4-Polynukleotidkinase (10 U/μL), 1 μL Klenow und 25 μL ddH2O (200 μL Des Gesamtvolumens) hinzu. Bei 20 °C 30 min inkubieren.</li>
</ol>10. Größenauswahl
<ol><li>Um Fragmente auszuwählen, die hauptsächlich im Größenbereich von 250-550 bp liegen, führen Sie zuerst eine sequenzielle SPRI-Größenauswahl (Solid Phase Reversible Immobilization) mit 0,6x durch, gefolgt von 0,90x gemäß den Anweisungen des Herstellers und eluieren Sie die DNA mit 100 μL TLE.</li>
</ol>11. Biotin Pulldown / A-Tailing / Adapter-Ligation
HINWEIS: Führen Sie die Waschungen durch, indem Sie die magnetischen Perlen durch Wirbeln wieder aufwenden, drehen Sie die Proben für 3 Minuten auf einem rotierenden Rad und drehen Sie dann die Probe kurz herunter und legen Sie sie auf den magnetischen Ständer. Lassen Sie die Perlen am Magneten haften, verwerfen Sie den Überstand und fahren Sie mit dem folgenden Waschschritt fort. Führen Sie die Waschungen bei 55 °C auf einem Thermoblock mit Rotation anstelle des rotierenden Rades durch.
<ol><li>Machen Sie das Endvolumen auf 300 μL pro Probe mit TLE für Pull-Down. Bereiten Sie die Perlenwaschpuffer vor: 1x Tween Buffer (TB) (TB: 5 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,05% Tween), 0,5x TB, 1x No-Tween Puffer (NTB) (5 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl), 2x NTB.</li>
	<li>Verwenden Sie 150 μL Streptavidin-gebundene magnetische Perlen (siehe Materialtabelle)pro Bibliothek. Waschen Sie die Perlen 2x mit 400 μL 1x TB. Dann Perlen in 300 μL 2x NTB resuspendieren.</li>
	<li>Mischen Sie die Perlen mit dem 300 μL Hi-C-Material und inkubieren Sie bei RT für 30 Minuten auf einem rotierenden Rad, damit Biotin an Streptavidin-Perlen gebunden werden kann.</li>
	<li>Die Perlen mit 400 μL 0,5x TB waschen und bei 55 °C für 3 min inkubieren und mit 750 U/min drehen. Waschen Sie die Perlen in 200 μL 1x Restriktionspuffer.</li>
	<li>Die Perlen werden in 100 μL dATP-Tailing-Mischung (5 μL 10 mM dATP, 10 μL 10x Restriktionspuffer, 5 μL Klenow exo- und 80 μL ddH2 O)resuspendiert. Bei 37 °C 30 min inkubieren.</li>
	<li>Den Überstand entfernen, die Perlen 2x mit 400 μL 0,5x TB waschen, bei 55 °C für 3 min inkubieren und bei 750 U/min drehen.</li>
	<li>Waschen Sie die Perlen mit 400 μL 1x NTB und dann mit 100 μL 1x Ligationspuffer.</li>
	<li>Die Perlen in 50 μL 1x Ligationspuffer resuspendieren und die Suspension in ein neues Röhrchen überführen. Fügen Sie 4 μL vorgeglühte PE-Adapter (15 μM Vorrat) und 2 μL T4-Ligase (400 U / μL, dh 800 U / Röhrchen) hinzu; inkubieren Sie bei RT für 2 h. HINWEIS: Glühen Sie die Adapter vor, indem Sie gleiche Mengen von PE 1.0- und PE 2.0-Adaptern (30 μM-Bestand) hinzufügen und 10 Minuten bei RT inkubieren (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Fangen Sie die Perlen wieder ein, indem Sie den Überstand entfernen und die Perlen 2x mit 400 μL TB waschen. Waschen Sie die Perlen mit 200 μL 1x NTB, dann mit 100 μL 1x Restriktionspuffer und resuspendieren Sie die Perlen in 40 μL 1x Restriktionspuffer.</li>
</ol>12. PCR-Amplifikation
<ol><li>Richten Sie PCRs mit 25 μL Volumen mit 5, 6, 7 und 8 Zyklen ein. Verwenden Sie für jede PCR:<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Reaktionsrezept</td>
			</tr>
<tr>
<td>Hi-C Perlen</td>
				<td>2,5 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 μM PE PCR Primer 1 (Materialtabelle)</td>
				<td>0,75 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 μM PE PCR Primer 2 (Materialtabelle)</td>
				<td>0,75 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 mM dNTP</td>
				<td>0,6 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>5x Reaktionspuffer</td>
				<td>5 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>DNA-Polymerase</td>
				<td>0,3 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
				<td>14,65 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>Gesamt</td>
				<td>25 μL</td>
			</tr>
</tbody></table>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Zyklen</td>
				<td>Temperatur</td>
				<td>Zeit</td>
			</tr>
<tr>
<td>1</td>
				<td>98 °C</td>
				<td>30 s</td>
			</tr>
<tr>
<td rowspan="3">n Zyklen</td>
				<td>98 °C</td>
				<td>10 s</td>
			</tr>
<tr>
<td>65 °C</td>
				<td>30 s</td>
			</tr>
<tr>
<td>72 °C</td>
				<td>30 s</td>
			</tr>
<tr>
<td>1</td>
				<td>72 °C</td>
				<td>7 Min.</td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
</ol>13. Endgültige PCR-Amplifikation
<ol><li>Führen Sie die endgültige PCR-Amplifikation unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben und der Anzahl der ausgewählten Zyklen durch. Teilen Sie die Probe mit 5 μL Hi-C-Perlen als Vorlage in 50 μL-Reaktionen.</li>
	<li>Sammeln Sie alle PCR-Reaktionen und übertragen Sie sie in ein frisches Röhrchen. Verwenden Sie den Magneten, um die Streptavidin-Perlen zu entfernen und den Überstand (PCR-Produkte) wiederherzustellen. Die Perlen in ein frisches Röhrchen geben, die Perlen wie in Schritt 11.2.9 angegeben waschen und als Backup in 1x Restriktionspuffer bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Reinigen Sie die PCR-Produkte mit dem 0,85-fachen Volumen der SPRI-Perlen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Elute mit 30 μL TLE-Puffer.</li>
	<li>Quantifizieren Sie die Hi-C-Bibliothek mit einem fluorometrischen Instrument und bestätigen Sie die Qualität der Bibliothek durch chipbasierte Kapillarelektrophorese.</li>
	<li>Verwenden Sie als letzten Qualitätskontrollpunkt 1 μL der Hi-C-Bibliothek als Vorlage, um eine PCR-Reaktion mit 10 Zyklen unter den gleichen Bedingungen durchzuführen, die in Schritt 12.1 beschrieben wurden. Teilen Sie das PCR-Produkt in zwei Mikrozentrifugenröhrchen auf: Verdauen Sie eine mit Cla I und lassen Sie die andere unverdaut als Kontrolle. Führen Sie die Produkte in einem 1,5-2% igen Agarosegel aus (siehe repräsentative Ergebnisse).</li>
	<li>Fahren Sie mit der 50 bp oder 75 bp Paired-End-Sequenzierung auf einer geeigneten Sequenzierungsplattform fort.</li>
</ol>

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<li>Fresán, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insulator+protein+CTCF+regulates+Drosophila+steroidogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis.</a> Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).</li>
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<li>Beagrie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+multi-enhancer+contacts+captured+by+genome+architecture+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping.</a> Nature. 543, 519-524 (2017).</li>
<li>Redolfi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DamC+reveals+principles+of+chromatin+folding+in+vivo+without+crosslinking+and+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).</li>
<li>Maxwell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiChIP%3A+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13, 919-922 (2016).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-BERST%3A+Defining+subnuclear+proteomic+landscapes+at+genomic+elements+with+dCas9-APEX2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2.</a> Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Die hier vorgestellte In-Nucleus-Hi-C-Methode hat eine detaillierte Untersuchung der Drosophila-Genomtopologie mit hoher Auflösung ermöglicht und einen Überblick über genomische Interaktionen auf verschiedenen genomischen Skalen ermöglicht, von Chromatinschleifen zwischen regulatorischen Elementen wie Promotoren und Enhancern bis hin zu TADs und der Identifizierung großer Kompartimente25. Die gleiche Technologie wurde auch effizient auf Säugetiergewebe mit einigen Modifikationen angewendet<sup cla...

Bei Eukaryoten ist das Genom in Chromosomen unterteilt, die während der Interphase1bestimmte Territorien im Kernraum einnehmen. Das Chromatin, das die Chromosomen bildet, kann in zwei Hauptzustände unterteilt werden: einen von zugänglichem Chromatin, das transkriptionell freizügig ist, und den anderen von kompaktem Chromatin, das transkriptionell repressiv ist. Diese Chromatinzustände trennen sich und vermischen sich selten im Kernraum und bilden zwei verschiedene Kompartimente im Kern2. Auf der Sub-Megabase-Skala trennen Grenzen Domänen von hochfrequenten Chromatin-Wechselwirkungen, sogenannte TADs, die die Chromosomenorganisation3,4,5markieren. Bei Säugetieren werden TAD-Grenzen durch Cohesin und CCCTC-Bindungsfaktor (CTCF)6,7,8besetzt. Der Cohesin-Komplex extrudiert Chromatin und stoppt an CTCF-Bindungsstellen, die in konvergenter Orientierung in der genomischen Sequenz angeordnet sind, um stabile Chromatinschleifen9,10,13,14zu bilden. Genetische Störung der CTCF-DNA-Bindungsstelle an den Grenzen oder Verringerung der CTCF- und Cohesinproteinhäufigkeit führt zu abnormalen Wechselwirkungen zwischen regulatorischen Elementen, Verlust der TAD-Bildung und Deregulierung der Genexpression9,10,11,13,14.
Bei Drosophila werden die Grenzen zwischen TADs von mehreren APs besetzt, darunter der Grenzelement-assoziierte Faktor 32 kDa (BEAF-32), das Motif 1-Bindungsprotein (M1BP), das zentromale Protein 190 (CP190), der Suppressor des Haarflügels (SuHW) und CTCF, und sind mit aktiven Histonmodifikationen und Polymerase II16,17,18angereichert. Es wurde vermutet, dass bei Drosophila TADs als Folge der Transkription13 , 17,19auftreten, und die genaue Rolle unabhängiger APs bei der Grenzbildung und den Isolationseigenschaften wird noch untersucht. Ob Domänen in Drosophila eine alleinige Folge der Aggregation von Regionen ähnlicher Transkriptionszustände sind oder ob APs, einschließlich CTCF, zur Grenzbildung beitragen, muss daher noch vollständig charakterisiert werden. Die Erforschung genomischer Kontakte mit hoher Auflösung wurde durch die Entwicklung von Chromosomenkonformationserfassungstechnologien in Verbindung mit sequenzierung der nächsten Generation ermöglicht. Das Hi-C-Protokoll wurde erstmals mit dem Ligationsschritt "in Lösung"2 beschrieben, um falsche Ligationsprodukte zwischen Chromatinfragmenten zu vermeiden. Mehrere Studien wiesen jedoch auf die Erkenntnis hin, dass das nützliche Signal in den Daten von Ligationsprodukten stammte, die an teilweise lysierten Kernen gebildet wurden, die nicht in Lösung20,21waren .
Das Protokoll wurde dann modifiziert, um die Ligatur im Kern als Teil des Einzelzell-Hi-C-Experiments22durchzuführen. Das In-Nucleus-Hi-C-Protokoll wurde anschließend in die Zellpopulation Hi-C integriert, um eine konsistentere Abdeckung über den gesamten Bereich genomischer Entfernungen zu erzielen und Daten mit weniger technischem Rauschen zu erzeugen23,24. Das hier ausführlich beschriebene Protokoll basiert auf dem Population in-nucleus Hi-C Protokoll23,24 und wurde verwendet, um die Folgen der genetischen Entfernung von DNA-bindenden Motiven für CTCF und M1BP von einer Domänengrenze am Notch-Genlocus in Drosophila25zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Veränderung der DNA-bindungsnden Motive für APs an der Grenze drastische Folgen für die Bildung der Notch-Domäne, größere topologische Defekte in den Regionen rund um den Notch-Locus und die Deregulierung der Genexpression hat. Dies deutet darauf hin, dass genetische Elemente an Domänengrenzen für die Aufrechterhaltung der Genomtopologie und Genexpression in Drosophila25wichtig sind.

<table><tbody><tr><td>16 % (vol/vol) Paraformaldehyd-Lösung</td><td>Agar Scientific</td><td>R1026</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-14-dATP</td><td>Invitrogen</td><td>CA1524-016</td><td></td></tr><tr><td>ClaI-Enzym</td><td>NEB</td><td>R0197S</td><td></td></tr><tr><td>COVARIS Ultraschallgerät</td><td>Covaris</td><td>LE220-M220</td><td></td></tr><tr><td>Cut Smart</td><td>NEB</td><td>B72002S</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td><td>Life Technologies</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptabidin C1</td><td>Invitrogen</td><td>65002</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS) steril filtriert</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Klenow Dna PolI großes Fragment</td><td>NEB</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>Klenow exo(-)</td><td>NEB</td><td>M0210S</td><td></td></tr><tr><td>Ligationspuffer</td><td>NEB</td><td>B020S</td><td></td></tr><tr><td>MboI-Enzym</td><td>NEB</td><td>R0147M</td><td></td></tr><tr><td>NP40-Igepal</td><td>SIGMA</td><td>CA-420</td><td>Nichtionisches Tensid zur Zugabe in Lysepuffer</td></tr><tr><td>PE-Adapter 1.0</td><td>Illumina</td><td>5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3'PE</td><td></td></tr> <tr><td>Adapter 2.0</td><td>Illumina</td><td>5'-ACACTCTCTCCCTACACGACCT CTTCCGATCT-3'PE</td><td></td></tr> <tr><td>PCR Grundierung 1.0</td><td>Illumina</td><td>5'-AATGATACGGCGACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3'PE</td><td></td></tr> <tr><td>PCR Primer 2.0</td><td>Illumina</td><td>5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3'Phenol</td><td></td></tr><tr><td>: Chloroform:Isoamylalkohol 25:24:1</td><td>SIGMA</td><td>P2069</td><td></td></tr><tr><td>Primer 1 (bekannte Wechselwirkung, Abbildung 2A)</td><td>Sigma</td><td>5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'Primer</td><td></td></tr> <tr><td>2 (bekannte Wechselwirkungen, Abbildung 2A)</td><td>Sigma</td><td>5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3'Proteaseinhibitor-Cocktailtablette</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33327</td><td></td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Roche</td><td>10109142001 SPRI-Perlen</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman</td><td>B23318</td><td></td></tr><tr><td>T4-DNA-Ligase</td><td>Invitrogen</td><td>15224-025</td><td></td></tr><tr><td>T4-DNA-Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4-Polynukleotidkinase (PNK)</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>TaqPhusion</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td>DNA-Polymerase</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>Nichtionisches Tensid zum Abschrecken von SDS</td></tr></tbody></table>

in-nucleus hi-c in drosophila-zellen

In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells

Das Genom ist in topologisch assoziierenden Domänen (TADs) organisiert, die durch Grenzen begrenzt sind, die Interaktionen zwischen Domänen isolieren. Bei Drosophila werden die Mechanismen, die der TAD-Bildung und den Grenzen zugrunde liegen, noch untersucht. Die anwendung der hier beschriebenen In-Nucleus Hi-C-Methode trug dazu bei, die Funktion von architektonischen Protein-Bindenden (AP)-Stellen an TAD-Grenzen zu analysieren, die das Notch-Gen isolieren. Genetische Veränderungen von Domänengrenzen, die zum Verlust von APs führen, führen zu TAD-Fusion, Transkriptionsfehlern und langfristigen topologischen Veränderungen. Diese Ergebnisse lieferten Beweise für den Beitrag genetischer Elemente zur Bildung von Domänengrenzen und zur Kontrolle der Genexpression bei Drosophila. Hier wurde die in-nucleus Hi-C-Methode ausführlich beschrieben, die wichtige Checkpoints liefert, um die Qualität des Experiments zusammen mit dem Protokoll zu beurteilen. Gezeigt werden auch die erforderliche Anzahl von Sequenzierungslesungen und validen Hi-C-Paaren zur Analyse genomischer Interaktionen auf verschiedenen genomischen Skalen. CrispR/Cas9-vermittelte genetische Editierung regulatorischer Elemente und hochauflösendes Profiling genomischer Interaktionen mit diesem In-Nucleus-Hi-C-Protokoll könnte eine leistungsstarke Kombination für die Untersuchung der strukturellen Funktion genetischer Elemente sein.

Im Folgenden werden die Ergebnisse eines erfolgreichen Hi-C-Protokolls beschrieben (siehe eine Zusammenfassung des Hi-C-Protokollworkflows in Abbildung 1A). Während des Hi-C-Experiments im Kern gibt es mehrere Kontrollpunkte für die Qualitätskontrolle. Probenal aliquots wurden vor (UD) und nach (D) dem Chromatinrestriktionsschritt sowie nach der Ligatur (L) gesammelt. Die Vernetzung wurde umgekehrt und die DNA wurde gereinigt und auf einem Agarosegel ausgeführt. Ein Abstrich von 200-1000 bp ...

Das Genom ist im Kernraum in verschiedene Strukturen organisiert, die durch Chromosomenkonformationserfassungstechnologien aufgedeckt werden können. Die In-Nucleus-Hi-C-Methode liefert eine genomweite Sammlung von Chromatin-Interaktionen in Drosophila-Zelllinien, die Kontaktkarten generiert, die mit Megabasenauflösung auf Restriktionsfragmentebene untersucht werden können.

In-Nucleus Hi-C in Drosophila-Zellen

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, ...

Die Nucleus Hi-C-Protokolle ermöglichen die Erforschung der Chromosomenbestätigung mit unterschiedlicher Auflösung für die Charakterisierung von Chromatinschleifen, Domänen und Kompartimentorganisationen des Genoms. Dieses Protokoll bietet eine hochauflösende Profilierung genomischer Interaktionen auf verschiedenen Skalen und liefert eine konsistentere Abdeckung über den gesamten Bereich genomischer Entfernungen und Daten mit weniger technischem Rauschen. Die Kombination dieses Protokolls mit der genetischen Bearbeitung ist eine leistungsstarke Strategie, um die strukturelle Funktion genetischer Elemente zu testen.Es kann auch zur Charakterisierung von strukturellen Variationen angewendet werden, die zu Krankheiten führen. Das Nucleus Hi-C-Protokoll kann angewendet werden, um die Genomorganisation eines eukaryotischen Genoms zu untersuchen. Durch die SDS- und Triton-Behandlung werden alle Kernklumpen durch Pipettieren disaggregiert, da Aggregate die enzymatische Reaktionseffizienz beeinträchtigen, und stellen Sie sicher, dass Sie vor der Sequenzierung die entsprechenden Qualitätskontrollen durchführen.Beginnen Sie mit der Zugabe von methanolfreiem Formaldehyd zu einmal 10 zu den sieben Schneider's Line 2 Plus Drosophila-Zellen in 17,5 Millilitern Schneider-Medium, ergänzt mit 10% FBS zu einer Endkonzentration von 2%Inkubieren Sie die Zellen für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit Mischen alle 60 Sekunden oder auf einem rotierenden Rad und fügen Sie Glycin zu einer Endkonzentration von 0,125 Molar mit Mischen hinzu. Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur und 15 Minuten auf Eis die Zellen durch Zentrifugation sammeln und das Pellet vorsichtig in 25 Milliliter kaltem PBS resuspendieren und die Zellen mit einer weiteren Zentrifugation sammeln. Am Ende der Zentrifugation resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter eiskaltem Lysepuffer zum Zählen und stellen Sie die Zellen auf eine einmalige Konzentration von 10 bis sechs Zellen pro Milliliter ein.Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang auf Eis und kehren Sie die Röhre alle zwei Minuten um, um die Zellen mit einer weiteren Zentrifugation zu mischen und zu sammeln. Das Pellet in einem Milliliter frischer eiskalter Lysepuffer wieder auffüllen. Nach der Zentrifugation das Lysat mit einem Milliliter 1,25-fachem Restriktionspuffer waschen.Zentrifugieren Sie erneut, um das Lysat zu sammeln. Das Pellet in 360 Mikroliter frischem Restriktionspuffer und 11 Mikrolitern 10% SDS mit sorgfältigem Pipettieren wieder aufwirbeln und 45 Minuten bei 37 Grad Celsius und 7 bis 950 Umdrehungen pro Minute mit gelegentlichem Pipettieren inkubieren. Stoppen Sie am Ende der Inkubation die Permeabilisierung mit 75 Mikrolitern nichtionischem Tensid und geben Sie das Röhrchen für weitere 45 Minuten mit Schütteln bei 950 Umdrehungen pro Minute bei gelegentlichem Pipettieren in den Inkubator zurück.Für den Chromatinaufschluss 200 Einheiten Mbo1 in die Röhre geben, um eine vier- bis 16-stündige Inkubation bei 37 Grad Celsius mit Rotation zu erreichen. Am Ende der Inkubation inaktivieren Sie das Enzym mit 20-minütiger Inkubation bei 60 Grad Celsius. Um die Restriktionsfragmentüberhänge zu füllen und die DNA-Enden mit Biotin zu kennzeichnen, fügen Sie jeweils 1,5 Mikroliter mit 10 millimolaren dCTP, dGTP, dTTP, 20 Mikrolitern mit 0,4 millimolarem Biotin dATP, 17,5 Mikroliter Tris-Puffer mit niedrigem EDTA-Anteil und 10 Mikrolitern mit fünf Einheiten pro Mikroliter DNA-Polymerase ein großes Fragment unter sorgfältigem Mischen in die Tube hinzu.Inkubieren Sie die Reaktion für 75 Minuten bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 700 Umdrehungen pro Minute alle 10 Sekunden für 30 Sekunden. Am Ende der Inkubation die Ligationsmischung zum Chromatin geben und mit gründlichem, schonendem Mischen auf ein Milliliter Endreaktionsvolumen einstellen und über Nacht bei 16 Grad Celsius inkubieren. Um die Probenproteine abzubauen, fügen Sie 50 Mikroliter von 10 Milligramm pro Milliliter Proteinase K für eine zweistündige Inkubation bei 37 Grad Celsius in das Röhrchen hinzu.Erhöhen Sie am Ende der Inkubation die Temperatur über Nacht auf 65 Grad Celsius, um die Vernetzung der Probe umzukehren. Am nächsten Morgen bauen Sie die RNA mit 10 Mikrolitern von 10 Milligramm pro Milliliter RNAse A ab.Nach einer Stunde bei 37 Grad Celsius ein Volumen Phenolchloroform in das Röhrchen geben und gründlich durch Inversion mischen, um eine homogene Weißphase zu erhalten. Nach der Ausfällung der DNA nach Standardprotokollen quantifizieren Sie die DNA mit einem fluorogenen Farbstoff, der selektiv an DNA bindet, und einem Fluorometer gemäß den Anweisungen des Herstellers.Um die DNA von unverdauten und verdauten Aliquoten zu reinigen, laden Sie 100 Nanogramm unverdaute, verdaute und ligierte Proben auf ein 1,5% iges Agarosegel und suchen Sie nach einem Abstrich, der um 500 Basenpaare in der verdauten Probe zentriert ist, im Vergleich zu einem hochmolekularen Band für die ligierte Probe. Um die Hi-C-Markierung und Ligationseffizienz durch Amplifikation und Aufschluss einer bekannten Wechselwirkung zu überprüfen, verdauen Sie die Produkte nach der PCR mit Mbo1, Cla1 oder beidem und führen Sie die Proben auf einem neuen 1,5 bis 2% Gel aus, um die relative Anzahl der 3C- und Hi-C-Ligationsübergänge abschätzen zu können. Nach der Beschallung der Probe, um 200 bis 500 Basenpaar-DNA-Fragmente zu erhalten, werden 130 Mikroliter mit fünf Mikrogramm DNA aus jeder Probe in neue Mikrozentrifugenröhrchen mit 16 Mikrolitern 10X Ligationspuffer, zwei Mikrolitern 10 Millimolar dATP, fünf MikroliterN T4-DNA-Polymerase und sieben Mikroliter doppelt destilliertem Wasser für eine 30-minütige Inkubation bei 20 Grad Celsius übertragen.Am Ende der Inkubation werden fünf Mikroliter 10 Millimolar-dNTPs, vier Mikroliter 10X-Ligationspuffer, fünf Mikroliter T4-Polynukleotidkinase, ein Mikroliter DNA-Polymerase, ein großes Fragment und 25 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser für eine zweite 30-minütige Inkubation bei 20 Grad Celsius in die Röhrchen geben. Um Fragmente meist im Größenbereich von 250 bis 550 Basenpaaren auszuwählen, führen Sie eine sequenzielle Festphasen-Reversible- und Mobilisierungsgrößenauswahl mit 0,6X, dann 0,9X gemäß den Anweisungen des Herstellers durch und eluieren Sie die DNA mit 100 Mikrolitern Tris Low EDTA. Für den Biotin-Pulldown für jede Bibliothek waschen Sie 150 Mikroliter Streptavidin-gebundene magnetische Perlen zweimal mit 400 Mikrolitern 1X Tween-Puffer und drehen Sie die Proben drei Minuten lang auf einem rotierenden Rad.Am Ende der Inkubation die Perlen in 300 Mikroliter 2X no Tween-Puffer wieder aufsetzen und mit 300 Mikrolitern Hi-C-Material für eine 30-minütige Rotation auf einem rotierenden Rad mischen. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Perlen mit 400 Mikrolitern 0,5X Tween-Puffer für eine dreiminütige Inkubation bei 55 Grad Celsius und 750 Umdrehungen pro Minute, gefolgt von zwei Wäschen in 200 Mikrolitern mit 1X Restriktionspuffer pro Waschgang. Nach der zweiten Wäsche die Perlen in 100 Mikroliter dATP-Bergemischung für eine 30-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius wieder aufsetzen.Am Ende der Inkubation die Perlen in 50 Mikroliter 1X Ligationspuffer resuspendieren und die Suspension in ein neues Röhrchen mit vier Mikrolitern vorgeglühten gepaarten Endadaptern und zwei MikroliterN T4-Ligase übertragen. Entfernen Sie nach zwei Stunden bei Raumtemperatur den Überstand und waschen Sie die Perlen zweimal mit 400 Mikrolitern Tween-Puffer, dann waschen Sie die Perlen einmal mit 200 Mikrolitern ohne Tween-Puffer und einmal mit 100 Mikrolitern Restriktionspuffer, bevor Sie die Perlen in 40 Mikrolitern 1X-Restriktionspuffer wieder aufhängen. Ein Abstrich von 200 bis 1.000 Basenpaaren wird beobachtet, wenn die Restriktion mit Mbo1 erfolgreich ist.Wenn die Ligatur erfolgreich ist, wird ein hochmolekulares Band an der Oberseite des Gels beobachtet. Die Aufschlusseffizienz kann auch durch quantitative PCR bestätigt werden. Eine akzeptable Verdauungseffizienz beträgt 80% oder höher.Wie dargestellt, kann die Amplifikation einer bekannten Mittelbereichsinteraktion in Hi-C-Ligationsprodukten durch Aufschluss des bei der Amplifikation gewonnenen PCR-Produkts abgeschätzt werden. Eine Verdauungseffizienz von mehr als 70% wird empfohlen, um einen großen Anteil an nicht nützlichen Lesevorgängen für die Bibliotheken nach der Sequenzierung zu vermeiden. Die Anzahl der PCR-Zyklen für die endgültige Amplifikation sollte einen Zyklus kleiner sein als die Anzahl der Zyklen, für die der Abstrich sichtbar ist.Der Grad der Verdauung der Bibliothek zeigt die Fülle der gültigen Hi-C-Paare an und spiegelt den Anteil der nützlichen Lesevorgänge wider, die aus der Bibliothek erhalten werden. Mit den eindeutig gültigen Hi-C-Paaren kann eine grundlegende Analyse der Paarverteilung durchgeführt werden. Wie in diesem repräsentativen Beispiel beobachtet, kann der NOTCH-Genlocus zusammen mit den architekturellen Proteinen, den Domänen eins und zwei und Histonmodifikationen entlang des Locus gesehen werden.Bei der Deletion der Region, die sowohl die CTCF- als auch die M1BP-DNA-Bindungsstellen enthält, kann eine dramatische Veränderung der Chromatinkontakte beobachtet werden. Nach dem Hi-C-Experiment kann ein experimentiert werden, um einen bestimmten Satz von Kontakten zu erreichen, z. B. aus Promotorregionen. Dies ist besonders nützlich bei der Beurteilung großer Genome.Wie gezeigt, kann die Kombination des Hi-C-Protokolls mit genetischer Addition verwendet werden, um die strukturelle und regulatorische Funktion genomischer Elemente zu bewerten.

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

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Dieses Papier zeigt die Verwendung eines schnellen konfokalen Mikroskop, um Bildzelle Verhalten direkt durch die Puppenhülle. Nach dem Verlassen der Puppenhülle intakt ist, erlaubt dieses Verfahren die Beobachtung und Messung von dynamischen Zellprozesse im Stadium der Drosophila-Entwicklung, die schwer direkt zu studieren.

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