Beobachtung der Inselfunktion und der Wechselwirkungen zwischen Insel-Immunzellen in lebenden Pankreasgewebeschnitten
12. April 2021
Diese Studie präsentiert die Anwendung von lebenden Pankreasgewebeschnitten auf die Untersuchung der Inselphysiologie und der Wechselwirkungen zwischen Insel-Immunzellen.
Unser Protokoll wird dazu beitragen, die Auswirkungen von Immunzellinteraktionen auf die Inselfunktionalität zu beantworten. Die Methode des lebenden Pankreasgewebeschnitts ermöglicht es, die Physiologie und Funktion der Inseln zu untersuchen, während die zugrunde liegenden Gewebe und die native Mikroumgebung erhalten bleiben. Diese Methode könnte Einblicke in die Krankheitsprozesse von Pankreaserkrankungen wie Pankreatitis, Typ-I-Diabetes und Typ-II-Diabetes geben.
Ordnen Sie zunächst die Blöcke auf dem Probenhalter so an, dass sie die Klingenbreite nicht überschreiten, um sicherzustellen, dass sich die Klinge bei langsamer Bewegung des Vibratoms so weit wie möglich vorwärts bewegen kann. Tragen Sie eine Linie VonKleber auf den Probenhalter auf, machen Sie eine dünne Schicht mit dem Ende des Leimspenders und drehen Sie dann die Gewebeblöcke auf den Kleber, so dass die Seite in der Nähe des Gewebes nach oben zeigt. Drücken Sie die Blöcke vorsichtig nach unten und lassen Sie den Kleber drei Minuten trocknen.
Als nächstes befestigen Sie die Platte mit einer Schraube am Vibratom und stellen Sie die Klingenhöhe und den zurückgelegten Weg so ein, dass sich die Klinge über die Länge der Blöcke und nur knapp darüber bewegt. Stupsen Sie die Blöcke vorsichtig mit der Pinzette an, um zu überprüfen, ob der Kleber getrocknet ist, und füllen Sie dann die Vibrationsschale mit einer gekühlten extrazellulären Lösung, bis die Klinge bedeckt ist. Stellen Sie das Vibratom ein, um Scheiben von 120 Mikrometer Dicke zu machen und starten Sie es, dann beobachten Sie die Scheiben, die von den Gewebeblöcken kommen.
Heben Sie die Scheiben an, wenn sie vom Block schwimmen, indem Sie einen Pinsel oder eine Pinzette darunter legen und die Scheiben in den Krebs-Ringer-Bicarbonatpuffer legen, der drei Millimolar D-Glucose und Trypsin-Inhibitor enthält. Legen Sie die Platten mit den Scheiben auf eine Wippe und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für eine Stunde bei 25 U / min. Wenn die Scheiben länger aufbewahrt werden müssen, legen Sie die Scheiben in 15 Milliliter Scheibenkulturmedium und legen Sie die Platte in einen Inkubator.
Inkubieren Sie die vorbereiteten Scheiben bei 37 Grad Celsius für Studien am selben Tag oder übertragen Sie die Scheiben, die bei 24 Grad Celsius über Nacht kultiviert werden, mindestens eine Stunde vor dem Experiment auf 37 Grad Celsius. Schalten Sie das Mikroskop mindestens eine Stunde vor der Aufnahme ein und balancieren Sie den Bühnen-Top-Inkubator auf 37 Grad Celsius. Befestigen Sie die Boden petrischale des Deckglases mit der Scheibe auf der Bühne.
Fokussieren Sie das Mikroskop, indem Sie das 10-fache Objektiv in den Hellfeldmodus stellen, und lokalisieren Sie die Inseln im Hellfeldmodus, indem Sie nach orangebraun gefärbten Ovalen innerhalb der Scheibe suchen. Schalten Sie das Mikroskop auf konfokale Bildgebung um, indem Sie die CS-Taste auf dem Touchscreen-Controller des Mikroskops drücken. Um die Inseln mit Reflexion zu betrachten, schalten Sie den Laserdetektor 638 und den PMT-Detektor ein.
Stellen Sie die Laserleistung zwischen eins und 2% ein und schalten Sie die Kerbfilter aus. Verwenden Sie den 405-Nanometer-Laser und den PMT-Detektor, um die Nukleinsäurefärbung zu beobachten. Der Hybriddetektor für den CD8-Antikörpernachweis und der 488-Nanometer-Laser und Hybriddetektor zur Betrachtung des Insulintetramers.
Zentrieren Sie die gewünschte Insel im Sichtfeld mit den X- und Y-Reglern des Bühnenreglers. Sobald eine Insel von Interesse gefunden ist, wechseln Sie zum 20-fachen Objektiv und zoomen Sie hinein, so dass die Insel den größten Teil des Bildes einnimmt. Nehmen Sie einen Z-Stapel der Insel und finden Sie dann die besten optischen Abschnitte, in denen die Zellen am Leben sind und alle umgebenden Immunzellen im Fokus stehen.
Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass es im XYZT-Modus aufzeichnet, und optimieren Sie die Einstellungen, um alle 20 Minuten über einen Zeitraum von mehreren Stunden einen Z-Stack der ausgewählten Schritte aufzuzeichnen. Die Inseln in einem Pankreasgewebeschnitt wurden mittels Hellfeld- und Auflichtmikroskopie visualisiert. Das Insulin in den Inseln erhöht die Granularität und verursacht die Absorption großer Mengen an reflektiertem Licht, wodurch die Sichtbarkeit der Inseln erhöht wird.
Die Lebensfähigkeit eines lebenden menschlichen Pankreasgewebeschnitts wurde durch Färbung beurteilt. Die lebenden Zellen sind grün und die toten Zellen blau dargestellt. Ein weiterer positiver Indikator für die Lebensfähigkeit ist die beobachtbare Basalaktivität.
Wenn eine lebende Pankreasscheibe mit einem zelldurchlässigen Kalziumindikator beladen wurde, wurde eine Glukosestimulation sowohl in Maus- als auch in menschlichen Pankreasscheiben beobachtet. Die Fluoreszenz einzelner Zellen während der Glukosestimulation wurde ebenfalls quantifiziert. Intakte und erkrankte Inseln wurden mittels Dithizonfärbung und Auflichtmikroskopie beobachtet.
Die erkrankten Inseln beginnen aufgrund von Immunzellinfiltration und Zelltod an Granularität zu verlieren. Immunzellpopulationen können mittels CD8-Antikörpern und Insulintetramer-Färbung identifiziert werden. Die Co-Färbung zeigt an, dass es sich bei den Zellen um Effektor-T-Zellen handelt, die speziell auf das Insulinantigen abzielen.
Das Wichtigste, woran Sie sich bei diesem Verfahren erinnern sollten, ist, die Scheiben jederzeit in Lösungen proteaseinhibitor zu halten. Nach diesem Verfahren können zahlreiche Funktionalitäten in Immunzellexperimenten durchgeführt werden, die es ermöglichen, die Wirkung von Immunzellinteraktionen und Inselfunktion zu untersuchen.
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Übersicht
Diese Studie stellt die Anwendung von lebenden Pankreasgewebeschnitten zur Untersuchung der Inselzellphysiologie und der Interaktionen zwischen Inselzellen und Immunzellen vor. Die Methode ermöglicht die Untersuchung der Inselzellfunktion unter Erhaltung des nativen Mikromilieus.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Immunologie
Hintergrund
- Die Inselzellen spielen eine entscheidende Rolle im Glucosestoffwechsel.
- Immunzell-Interaktionen können die Funktion der Inselzellen beeinflussen.
- Das Verständnis dieser Interaktionen ist entscheidend, um pankreatische Erkrankungen zu behandeln.
- Lebende Gewebeschnitte bewahren den physiologischen Kontext der Zellen.
Zweck der Studie
- Untersuchung des Einflusses von Immunzell-Interaktionen auf die Inselzellfunktion.
- Gewinnung von Erkenntnissen zu Pankreaserkrankungen wie Typ-I- und Typ-II-Diabetes.
- Entwicklung einer Methode zur Erhaltung von Gewebepathologien und Mikroumgebungen.
Verwendete Methoden
- Herstellung von lebenden Pankreasgewebeschnitten.
- Verwendung eines Vibratoms für präzises Schneiden.
- Anwendung von Sekundenkleber zur Stabilisierung des Gewebeprobenblocks.
- Beobachtung von Interaktionen zwischen Inselzellen und Immunzellen in Echtzeit.
Hauptergebnisse
- Die Methode des lebenden Pankreasschnittpräparats erhält die Inselphysiologie wirksam.
- Es wurde gezeigt, dass Immunzellwechselwirkungen die Inselfunktion signifikant beeinflussen.
- Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung zugrundeliegender Pathologien.
- Die gewonnenen Erkenntnisse könnten Behandlungsstrategien für Pankreaserkrankungen unterstützen.
Schlussfolgerungen
- Lebende Pankreasgewebeschnitte sind ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Inselphysiologie.
- Die Methode kann das Verständnis immunologischer Wechselwirkungen bei der Inselfunktion verbessern.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können auf diesen Erkenntnissen aufbauen, um pankreatische Erkrankungen besser zu verstehen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Lebende Pankreasgewebeschnitte ermöglichen die direkte Beobachtung von Insel-Immunzell-Interaktionen innerhalb eines erhaltenen nativen Mikromilieus und bieten ein physiologisch relevantes System zur mechanistischen Entwicklungsrisikominderung bei der Zielvalidierung für Diabetes. Dieser Ansatz stärkt die Vorhersagekraft, indem er die Gewebeviabilität und zugrundeliegende Pathologien wie Typ-1- und Typ-2-Diabetes erhält und es F&E-Teams ermöglicht, therapeutische Hypothesen in einem krankheitsrelevanten Kontext zu bewerten. Die Methode verbindet Grundlagenforschung und translationale Forschung, indem sie quantitative, echtzeitfähige Messgrößen der Inselfunktion und der Dynamik von Immunzellen bereitstellt, die für Go/No-Go-Entscheidungen in der frühen Arzneimittelentwicklung bei Diabetes entscheidend sind.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem die Infiltration von Immunzellen und deren direkte Auswirkung auf die Integrität der Inselgranula sowie die Insulinfreisetzung sichtbar gemacht wird.
- Operativer Wert: Erhält die native Gewebearchitektur und zellulären Interaktionen bei, wodurch mechanistische Unschärfen bei der Zielvalidierung für immunmodulatorische Diabetes-Therapien verringert werden.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Priorisierung von Wirkstoffkandidaten, indem Immunzellaktivität mit funktionellem Abfall der Inselzellen verknüpft wird und somit eine biomarkerbasierte Aussage über die Zielstrukturenbindung liefert.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Fluoreszenzsignale aus Kalziumindikatoren und Insulin-Tetramer-Färbungen, um dosisabhängige Wirkungen von Substanzen auf die Inselzellfunktion zu bewerten.
- Operativer Wert: Standardisiert die Gewebepräparation und Bildgebungsprotokolle und gewährleistet reproduzierbare Basiswerte über verschiedene Experimentdurchläufe und Modellsysteme hinweg.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit Zeitraffermikroskopie und z-Stapel-Aufnahmen, wodurch eine longitudinale Beobachtung der Dynamik von Immunzellen über mehrere Stunden ermöglicht wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Erhält die zugrundeliegenden Pathologien von menschlichem und murinem Pankreasgewebe und ermöglicht die Untersuchung der Mechanismen der Typ-1- und Typ-2-Diabetes in einem krankheitsrelevanten System.
- Translationale Kontinuität: Verbindet frühe Entdeckungen mit der präklinischen Validierung, indem interzelluläre Interaktionen, die für die immunvermittelte Inselzell-Dysfunktion entscheidend sind, erhalten bleiben.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Ermöglicht die Visualisierung von Effektor-T-Zell-Interaktionen mit Insulinantigenen mittels CD8- und Insulin-Tetramer-Ko-Färbung und unterstützt so mechanismenbasierte Go/No-Go-Entscheidungen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode der lebenden Pankreasschnittpräparation fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur präklinischen Forschung ein und bietet ein krankheitsrelevantes System, das die Gewebeviabilität und Mikroumgebung erhält, um mechanistische Studien zu Insel-Immun-Interaktionen durchzuführen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem sie die Echtzeitbeobachtung des Einflusses von Immunzellen auf die Inselphysiologie ermöglicht und die an der Diabetespathogenese beteiligten Signalwege aufklärt.
- Screening: Stellt assaysbereite Gewebeschnitte bereit mit quantitativen Ergebnissen aus der glucosestimulierten Kalziumflussmessung und dem Insulin-Tetramer-Bindungsassay, wodurch eine zuverlässige Wirkstoffbewertung erleichtert wird.
- Analytik: Erzeugt XYZT-Zeitrafferdaten und z-Achsen-Optikalschnitte, sodass Teams zelluläre Reaktionen und die Lokalisation von Immunzellen über die Zeit hinweg quantifizieren können.
- Translationale Forschung: Erhält krankheitsrelevante Pathologien und das native Mikromilieu aufrecht und unterstützt so die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung immunmodulatorischer Mechanismen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Untersuchung der Inselfunktion über mehrere Krankheitsmodelle und therapeutische Modalitäten hinweg und reduziert so redundante Modellentwicklungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine vorhersagbare Sicherheit bei der Zielvalidierung, indem die mechanistische Mehrdeutigkeit durch die direkte Visualisierung von Insel-Immun-Interaktionen im intakten Gewebe verringert wird.
- Operativer Wert: Stellt Standardisierung und Reproduzierbarkeit sicher durch kontrollierte Protokolle zur Schnittstellung, Inkubation und Bildgebung, die die Lebensfähigkeit und Funktion der Schnitte erhalten.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch durch die Verknüpfung von Immunzellaktivität mit funktionellem Abfall der Inseln und reduziert so biologische Risiken in fortgeschrittenen Entwicklungsstadien von Diabetesmedikamenten.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung immunmodulatorischer Kandidaten basierend auf ihrer Fähigkeit, immunvermittelte Inselfunktionsstörungen in einem krankheitsrelevanten System zu verringern.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Gewebe, in der Vibratomschnittechnik und in der konfokalen Mikroskopie zur Live-Bildgebung der Dynamik von Immunzellen.
- Benötigt spezielle Geräte wie ein Vibratom, ein konfokales Mikroskop mit Laserdetektoren (405 nm, 488 nm, 638 nm) sowie einen Inkubator für die Objektbühne zur Kontrolle der Umgebungsbedingungen.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg bei der Schnittpräparation, der Pufferzusammensetzung (Krebs-Ringer-Bicarbonat mit D-Glukose und Trypsininhibitor) und den Inkubationsbedingungen voraus, um Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- Erfordert Anpassungen bei der Übertragung der Methode auf verschiedene Modellsysteme (Mensch vs. Maus) oder Krankheitszustände (T1D vs. T2D), um die Gewebeviabilität und pathologische Relevanz aufrechtzuerhalten.
- Beinhaltet praktische Einschränkungen wie die Notwendigkeit von Proteaseinhibitoren zum Erhalt der Schnittintegrität sowie die technische Herausforderung, während langfristiger Zeitrafferaufnahmen die optische Klarheit aufrechtzuerhalten.
