Name: Beobachtung der Inselfunktion und der Wechselwirkungen zwischen Insel-Immunzellen in lebenden Pankreasgewebeschnitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Erfahren Sie die Methode lebender Pankreasgewebeschnitte zur Untersuchung von Inselfunktion und Immunzell-Interaktionen. Diese Technik bewahrt das native Mikromilieu und liefert Erkenntnisse über Diabetes und Pankreaserkrankungen.

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Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 und P01 AI042288 finanziert. Diese Forschung wurde mit Unterstützung des Netzwerks für Pankreasorganspender mit Diabetes (nPOD; RRID: SCR_014641), ein kollaboratives Typ-1-Diabetes-Forschungsprojekt, das von JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) und dem Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053) gesponsert wird. Der Inhalt und die geäußerten Ansichten liegen in der Verantwortung der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die offizielle Ansicht von nPOD wider. Organ Procurement Organizations (OPO), die mit nPOD zusammenarbeiten, um Forschungsressourcen bereitzustellen, sind unter http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/ aufgeführt. Vielen Dank an Dr. Kevin Otto, University of Florida, für die Bereitstellung des Vibratoms, das zur Erzeugung von Mausscheiben verwendet wird.

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<li>Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics%2C+pathogenesis+and+clinical+interventions+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes.</a> Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).</li>
<li>Taylor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+diabetes%3A+etiology+and+reversibility%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Type 2 diabetes: etiology and reversibility.</a> Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).</li>
<li>Meier, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+of+Langerhans+isolation+from+pediatric+and+juvenile+donor+pancreases%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases.</a> Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).</li>
<li>Marciniak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+pancreas+tissue+slices+for+in+situ+studies+of+islet+of+Langerhans+and+acinar+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology.</a> Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).</li>
<li>Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+pancreas+tissue+slices+for+the+study+of+islet+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology.</a> Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).</li>
<li>Speier, S., Rupnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+in+situ+characterization+of+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archive%22%5BJournal%5D)">A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells.</a> Pflugers Archive. 446 (5), 553-558 (2003).</li>
<li>Panzer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+tissue+slices+from+organ+donors+enable+in+situ+analysis+of+type+1+diabetes+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis.</a> JCI Insight. 5 (8), 134525(2020).</li>
<li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatitis-induced+depletion+of+syntaxin+2+promotes+autophagy+and+increases+basolateral+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis.</a> Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).</li>
<li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas-specific+SNAP23+depletion+prevents+pancreatitis+by+attenuating+pathological+basolateral+exocytosis+and+formation+of+trypsin-activating+autolysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes.</a> Autophagy. , 1-14 (2020).</li>
<li>Qadir, M. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+human+pancreatic+slices+as+a+model+to+study+real-time+islet+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration.</a> Nature Communications. 11 (1), 3265(2020).</li>
<li>Cohrs, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+of+persisting+%CE%B2+cells+is+a+key+feature+of+early+type+2+diabetes+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dysfunction of persisting β cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis.</a> Cell Reports. 31 (1), 107469(2020).</li>
<li>Liang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+human+pancreatic+slice+preparations+offer+a+valuable+model+for+studying+pancreatic+exocrine+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).</li>
<li>Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+in+translational+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized mice in translational biomedical research.</a> Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).</li>
<li>Lamont, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+mechanisms+allow+undersized+anchor-deficient+class+I+MHC+ligands+to+mediate+pathogenic+autoreactive+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses.</a> Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).</li>
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<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+confocal+assay+to+assess+neuronal+viability+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices.</a> Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).</li>
<li>Gál, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+situ+approach+to+studying+pancreatic+ducts+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice.</a> Frontiers in Physiology. 10, 938(2019).</li>
<li>Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-stimulated+calcium+dynamics+in+islets+of+Langerhans+in+acute+mouse+pancreas+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices.</a> PloS One. 8 (1), 54638(2013).</li>
<li>Stožer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+connectivity+in+islets+of+Langerhans+from+mouse+pancreas+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices.</a> PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923(2013).</li>
<li>Früh, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagonotropic+and+glucagonostatic+effects+of+KATP+channel+closure+and+potassium+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization.</a> Endocrinology. 162 (1), 136(2021).</li>
<li>Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+mechanisms+for+sulfonylurea+control+of+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine%22%5BJournal%5D)">New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion.</a> Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).</li>
<li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+oscillations+of+KATP+conductance+in+mouse+pancreatic+islets+provide+support+for+electrical+bursting+driven+by+metabolic+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).</li>
<li>Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+pancreas+tissue+slice+culture+facilitates+long-term+studies+of+exocrine+and+endocrine+cell+physiology+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ.</a> PLoS One. 8 (11), 78706(2013).</li>
<li>Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of the immune system.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12, Unit 12.26 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine gegensätzlichen Interessen.

Ziel dieses Protokolls ist es, die Erzeugung von Pankreasscheiben und die Verfahren, die für die Verwendung der Scheiben in funktionellen und immunologischen Studien erforderlich sind, zu erläutern. Es gibt viele Vorteile bei der Verwendung von lebenden Pankreasscheiben. Es gibt jedoch mehrere kritische Schritte, die wesentlich sind, damit das Gewebe während der beschriebenen Experimentprotokolle lebensfähig und nützlich bleibt. Es ist unerlässlich, schnell zu arbeiten. Die Zeitspanne zwischen der Injektion der Bauchspei...

Die Beteiligung der Bauchspeicheldrüse ist pathognomonisch bei Krankheiten wie Pankreatitis, T1D und T2D1,2,3. Die Untersuchung der Funktion in isolierten Inseln beinhaltet in der Regel die Entfernung der Inseln aus ihrer Umgebung4. Die Methode des lebenden Pankreasgewebeschnitts wurde entwickelt, um die Untersuchung von Pankreasgewebe unter Beibehaltung intakter Inselmikroumgebungen zu ermöglichen und die Verwendung von stressigen Inselisolationsverfahren zu vermeiden5,6,7. Pankreasgewebeschnitte aus menschlichem Spendergewebe wurden erfolgreich zur Untersuchung von T1D verwendet und haben Prozesse des Betazellverlustes und der Funktionsstörung zusätzlich zur Immunzellinfiltration gezeigt8,9,10,11,12,13. Die Methode des lebenden Pankreasgewebeschnitts kann sowohl auf Maus- als auch auf menschliches Pankreasgewebe angewendet werden5,6,8. Menschliche Pankreasgewebeschnitte aus Organspendergewebe werden durch eine Zusammenarbeit mit dem Netzwerk für Pankreasorganspender mit Diabetes (nPOD) gewonnen. Mausscheiben können aus einer Vielzahl verschiedener Mausstämme generiert werden.
Dieses Protokoll konzentriert sich auf nicht-fettleibige Diabetiker-Rekombination aktivierendes Gen-1-null (NOD. Rag1-/-) und T-Zell-Rezeptor transgen (AI4) (NOD. Rag1-/-. AI4 α/β) Mausstämme. NICKEN. Rag1-/- Mäuse können aufgrund einer Störung des rekombinationsaktivierenden Gens 1 (Rag1)14 keine T- und B-Zellen entwickeln. NICKEN. Rag1-/-. AI4 α/β Mäuse werden als Modell für beschleunigten Typ-1-Diabetes verwendet, da sie einen einzigen T-Zell-Klon produzieren, der auf ein Epitop von Insulin abzielt, was zu einer konsistenten Inselinfiltration und einer schnellen Krankheitsentwicklung führt15. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt Verfahren für funktionelle und immunologische Studien mit lebenden Pankreasschnitten von Mensch und Maus durch die Anwendung konfokaler Mikroskopieansätze. Die hierin beschriebenen Techniken umfassen Lebensfähigkeitsbewertungen, Identifizierung und Lokalisierung von Inselchen, zytosolische Ca2+ -Aufzeichnungen sowie Färbung und Identifizierung von Immunzellpopulationen.

<table><tbody><tr><td>#3 Style Skalpellgriff</td><td>Fisherbrand</td><td>12-000-163</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-100</td><td>HEPES Puffer, 1M Lösung</td></tr><tr><td>10 cm Unbehandelte Kulturschale</td><td>Corning</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Luer-Lok Spritze</td><td>BD</td><td>301029</td><td>BD Spritze mit Luer-Lok Spitzen</td></tr><tr><td>27 G Nadel</td><td>BD</td><td>BD 305109</td><td>BD General Use und PrecisionGlide Injektionsnadeln</td></tr><tr><td>35 mm Deckglasboden Petrischale</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td>&micro;-Schale 35 mm, hoch</td></tr><tr><td>50 mL Spritze</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>8-Well-Deckglas mit Kammer</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>&micro;-Slide 8 Well</td></tr><tr><td>APC Anti-Maus CD8a Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>100712</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific</td><td>199898</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>CaCl2 (Dihydrat)</td></tr><tr><td>Compact Digital</td><td>Rocker Thermo Fisher Scientific</td><td>88880020</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>Lochblende&thinsp;= 1,5-2 luftige Einheiten; aufgenommen mit HC PL APO CS2 trockenen Objektiven mit 10x/0,40 numerischer Apertur und 20x/0,75 HC PL APO CS2 trockenen Objektiven mit numerischer Apertur bei 512&thinsp; &mal; &thinsp; 512 Pixel Auflösung</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>C6H12O6</td></tr><tr><td>ddiH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dithizone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130-10G</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td>Dimethylsulfoxid</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 mm Gewebekulturschale</td><td>Corning</td><td>353001</td><td>Falcon Easy-Grip Gewebekulturschalen</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Feather No. 10 Chirurgische Klinge</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>7204410</td><td></td></tr><tr><td>fluo-4-AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td>zellpermeable Ca2+ Indikator</td></tr><tr><td>Gel Control Sekundenkleber</td><td>Loctite</td><td>45198</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>Gehärtete Feinschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td>Hanks Balanced Salt Solution</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>C8H18N2O4S</td></tr><tr><td>Eiskübel</td><td>Fisherbrand</td><td>03-395-150</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Patterson Veterinary</td><td>NDC 14043-704-05</td><td></td></tr><tr><td>Johns Hopkins Bulldog Clamp</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-7440</td><td>&nbsp; Gerade; 500-900 Gramm Druck; 1,5" Länge</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34705</td><td>Kimtech Wissenschaft und Handel Kimwipes&Handel; Delicate Task Wipers, 2-lagig</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td>Dieses Kit enthält den Lebendzellfarbstoff calcein-AM.</td></tr><tr><td>DMEM mit niedrigem Glukosegehalt</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td>MgCl2 (Hexahydrat)</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Heptahydrat</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td>MgSO4 (Heptahydrat)</td></tr><tr><td>Magnetisch beheizte Plattform</td><td>Warner</td><td>Instruments PM-1</td><td>Plattform für die Bildgebungskammer zur dynamischen Stimulation Aufnahmen</td></tr><tr><td>Mikrowelle</td><td>GE</td><td>JES1460DSWW</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Spritzenfilter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>726-2520</td><td></td></tr><tr><td>No.4 Pinsel</td><td>Michaels</td><td>10269140</td><td></td></tr><tr><td>Open Diamond Bath Imaging Chamber Warner</td><td>Instruments</td><td>RC-26</td><td>Imaging-Kammer für dynamische Stimulationsaufnahmen</td></tr><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1-AM</td><td>Invitrogen</td><td>O6807</td><td>zellpermeabler Ca2+-Indikator</td></tr><tr><td>Bildgebungskammer über Nacht</td><td>Okolab</td><td>H201-LG</td><td></td></tr><tr><td></td><td>PBS Thermo Fisher Scientific 20012050</td><td></td><td>Zur Herstellung von Agarose für die Schnitterzeugung</td></tr><tr><td>PE-markiertes Insulin-Tetramer</td><td>Emory Tetramer Research Kernsequenz</td><td>YAIENYLEL</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco 15140122</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch</td><td></td><td>Sigma P5655</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Rasierklingen</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>71998</td><td>Für Vibratom; Doppelte Kante Edelstahl, unbeschichtet</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SeaPlaque Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt</td><td>Lonza</td><td>50101</td><td>Zur Herstellung von Agarose für die Schichterzeugung</td></tr><tr><td>Schichtanker</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1421</td><td></td></tr><tr><td>Schichtanker (dynamische Bildgebung)</td><td>Warner Instruments</td><td>640253</td><td>Schichtanker für dynamische Bildgebungskammer</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Natriumphosphat-Monohydrat</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>NaH2PO4 (Monohydrat)</td></tr><tr><td>Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor</td><td>Sigma</td><td>T6522-1G</td><td>Trypsin-Inhibitor aus Glycin max (Sojabohne)</td></tr><tr><td>Stadium Adapter</td><td>Warner Instruments</td><td>SA-20MW-AL</td><td>Zur Ausstattung der Bildgebungskammer für dynamische Stimulationsaufnahmen auf dem Mikroskoptisch</td></tr><tr><td>Tischinkubator</td><td>Okolab</td><td>H201</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Leica</td><td>IC90 E MSV266</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Blue Dead Cell Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S34857</td> blau <td>fluoreszierender Nukleinsäure-Farbstoff</td></tr><tr><td>Transfer Pipette</td><td>Falcon</td><td>357575</td><td>Falcon&trade; Einweg-Transferpipetten aus Kunststoff</td></tr><tr><td>Ventilsteuerungssystem</td><td>Warner</td><td>Instruments VCS-8</td><td>System für dynamische Stimulationsaufnahmen</td></tr><tr><td>Vibratome VT1000 S</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD02</td><td>Fisherbrand Isotemp Allzweck-Deluxe-Wasserbad GPD 02</td></tr></tbody></table>

beobachtung der inselfunktion und der wechselwirkungen zwischen insel-immunzellen in lebenden pankreasgewebeschnitten

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

Lebende Pankreasgewebeschnitte ermöglichen die Untersuchung der Physiologie und Funktion von Inseln im Kontext einer intakten Inselmikroumgebung. Die Scheiben werden aus lebendem Pankreasgewebe von Mensch und Maus hergestellt, das in Agarose eingebettet ist und mit einem Vibratom geschnitten wird. Diese Methode ermöglicht es dem Gewebe, die Lebensfähigkeit und Funktion aufrechtzuerhalten und die zugrunde liegenden Pathologien wie Typ-1-Diabetes (T1D) und Typ-2-Diabetes (T2D) zu erhalten. Die Slice-Methode ermöglicht neue Richtungen bei der Untersuchung der Bauchspeicheldrüse durch die Aufrechterhaltung der komplexen Strukturen und verschiedener interzellulärer Wechselwirkungen, die das endokrine und exokrine Gewebe der Bauchspeicheldrüse umfassen. Dieses Protokoll zeigt, wie man Färbung und Zeitraffermikroskopie von lebenden endogenen Immunzellen in Pankreasschnitten zusammen mit Bewertungen der Inselphysiologie durchführt. Darüber hinaus kann dieser Ansatz verfeinert werden, um Immunzellpopulationen zu erkennen, die für Inselzellantigene spezifisch sind, wobei wichtige Histokompatibilitäts-Komplex-Multimer-Reagenzien verwendet werden.

Dieses Protokoll liefert lebende Pankreasgewebeschnitte, die sowohl für Funktionsstudien als auch für Immunzellaufnahmen geeignet sind. Das Erscheinungsbild der Scheiben sowohl im Hellfeld als auch unter reflektiertem Licht ist in Abbildung 1A,B dargestellt. Wie bereits erwähnt, können Inseln in Scheiben gefunden werden, die reflektiertes Licht aufgrund ihrer erhöhten Granularität verwenden, die aufgrund ihres Insulingehalts auftritt (Abbildung 1C</stron...

Diese Studie präsentiert die Anwendung von lebenden Pankreasgewebeschnitten auf die Untersuchung der Inselphysiologie und der Wechselwirkungen zwischen Insel-Immunzellen.

Beobachtung der Inselfunktion und der Wechselwirkungen zwischen Insel-Immunzellen in lebenden Pankreasgewebeschnitten

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

Unser Protokoll wird dazu beitragen, die Auswirkungen von Immunzellinteraktionen auf die Inselfunktionalität zu beantworten. Die Methode des lebenden Pankreasgewebeschnitts ermöglicht es, die Physiologie und Funktion der Inseln zu untersuchen, während die zugrunde liegenden Gewebe und die native Mikroumgebung erhalten bleiben. Diese Methode könnte Einblicke in die Krankheitsprozesse von Pankreaserkrankungen wie Pankreatitis, Typ-I-Diabetes und Typ-II-Diabetes geben.Ordnen Sie zunächst die Blöcke auf dem Probenhalter so an, dass sie die Klingenbreite nicht überschreiten, um sicherzustellen, dass sich die Klinge bei langsamer Bewegung des Vibratoms so weit wie möglich vorwärts bewegen kann. Tragen Sie eine Linie VonKleber auf den Probenhalter auf, machen Sie eine dünne Schicht mit dem Ende des Leimspenders und drehen Sie dann die Gewebeblöcke auf den Kleber, so dass die Seite in der Nähe des Gewebes nach oben zeigt. Drücken Sie die Blöcke vorsichtig nach unten und lassen Sie den Kleber drei Minuten trocknen.Als nächstes befestigen Sie die Platte mit einer Schraube am Vibratom und stellen Sie die Klingenhöhe und den zurückgelegten Weg so ein, dass sich die Klinge über die Länge der Blöcke und nur knapp darüber bewegt. Stupsen Sie die Blöcke vorsichtig mit der Pinzette an, um zu überprüfen, ob der Kleber getrocknet ist, und füllen Sie dann die Vibrationsschale mit einer gekühlten extrazellulären Lösung, bis die Klinge bedeckt ist. Stellen Sie das Vibratom ein, um Scheiben von 120 Mikrometer Dicke zu machen und starten Sie es, dann beobachten Sie die Scheiben, die von den Gewebeblöcken kommen.Heben Sie die Scheiben an, wenn sie vom Block schwimmen, indem Sie einen Pinsel oder eine Pinzette darunter legen und die Scheiben in den Krebs-Ringer-Bicarbonatpuffer legen, der drei Millimolar D-Glucose und Trypsin-Inhibitor enthält. Legen Sie die Platten mit den Scheiben auf eine Wippe und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für eine Stunde bei 25 U / min. Wenn die Scheiben länger aufbewahrt werden müssen, legen Sie die Scheiben in 15 Milliliter Scheibenkulturmedium und legen Sie die Platte in einen Inkubator.Inkubieren Sie die vorbereiteten Scheiben bei 37 Grad Celsius für Studien am selben Tag oder übertragen Sie die Scheiben, die bei 24 Grad Celsius über Nacht kultiviert werden, mindestens eine Stunde vor dem Experiment auf 37 Grad Celsius. Schalten Sie das Mikroskop mindestens eine Stunde vor der Aufnahme ein und balancieren Sie den Bühnen-Top-Inkubator auf 37 Grad Celsius. Befestigen Sie die Boden petrischale des Deckglases mit der Scheibe auf der Bühne.Fokussieren Sie das Mikroskop, indem Sie das 10-fache Objektiv in den Hellfeldmodus stellen, und lokalisieren Sie die Inseln im Hellfeldmodus, indem Sie nach orangebraun gefärbten Ovalen innerhalb der Scheibe suchen. Schalten Sie das Mikroskop auf konfokale Bildgebung um, indem Sie die CS-Taste auf dem Touchscreen-Controller des Mikroskops drücken. Um die Inseln mit Reflexion zu betrachten, schalten Sie den Laserdetektor 638 und den PMT-Detektor ein.Stellen Sie die Laserleistung zwischen eins und 2% ein und schalten Sie die Kerbfilter aus. Verwenden Sie den 405-Nanometer-Laser und den PMT-Detektor, um die Nukleinsäurefärbung zu beobachten. Der Hybriddetektor für den CD8-Antikörpernachweis und der 488-Nanometer-Laser und Hybriddetektor zur Betrachtung des Insulintetramers.Zentrieren Sie die gewünschte Insel im Sichtfeld mit den X- und Y-Reglern des Bühnenreglers. Sobald eine Insel von Interesse gefunden ist, wechseln Sie zum 20-fachen Objektiv und zoomen Sie hinein, so dass die Insel den größten Teil des Bildes einnimmt. Nehmen Sie einen Z-Stapel der Insel und finden Sie dann die besten optischen Abschnitte, in denen die Zellen am Leben sind und alle umgebenden Immunzellen im Fokus stehen.Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass es im XYZT-Modus aufzeichnet, und optimieren Sie die Einstellungen, um alle 20 Minuten über einen Zeitraum von mehreren Stunden einen Z-Stack der ausgewählten Schritte aufzuzeichnen. Die Inseln in einem Pankreasgewebeschnitt wurden mittels Hellfeld- und Auflichtmikroskopie visualisiert. Das Insulin in den Inseln erhöht die Granularität und verursacht die Absorption großer Mengen an reflektiertem Licht, wodurch die Sichtbarkeit der Inseln erhöht wird.Die Lebensfähigkeit eines lebenden menschlichen Pankreasgewebeschnitts wurde durch Färbung beurteilt. Die lebenden Zellen sind grün und die toten Zellen blau dargestellt. Ein weiterer positiver Indikator für die Lebensfähigkeit ist die beobachtbare Basalaktivität.Wenn eine lebende Pankreasscheibe mit einem zelldurchlässigen Kalziumindikator beladen wurde, wurde eine Glukosestimulation sowohl in Maus- als auch in menschlichen Pankreasscheiben beobachtet. Die Fluoreszenz einzelner Zellen während der Glukosestimulation wurde ebenfalls quantifiziert. Intakte und erkrankte Inseln wurden mittels Dithizonfärbung und Auflichtmikroskopie beobachtet.Die erkrankten Inseln beginnen aufgrund von Immunzellinfiltration und Zelltod an Granularität zu verlieren. Immunzellpopulationen können mittels CD8-Antikörpern und Insulintetramer-Färbung identifiziert werden. Die Co-Färbung zeigt an, dass es sich bei den Zellen um Effektor-T-Zellen handelt, die speziell auf das Insulinantigen abzielen.Das Wichtigste, woran Sie sich bei diesem Verfahren erinnern sollten, ist, die Scheiben jederzeit in Lösungen proteaseinhibitor zu halten. Nach diesem Verfahren können zahlreiche Funktionalitäten in Immunzellexperimenten durchgeführt werden, die es ermöglichen, die Wirkung von Immunzellinteraktionen und Inselfunktion zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Neuartige computergestützte Methoden der großflächigen Beschaffung und Analyse der immunhistochemisch gefärbten Pankreas Proben werden beschrieben: (1) Virtuelle Scheiben Erfassung der gesamten Abschnitt, (2) Messe Analyse der umfangreichen Daten, (3) Rekonstruktion von 2D-Virtuelle Schnitte , (4) 3D-Mapping-Insel, und (5) Mathematische Analyse.

Computer-assisted Großflächige Visualisierung und Quantifizierung der Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Masse, Größenverteilung und Architektur

Wir präsentieren hier ein Protokoll für die Isolierung von Inselzellen aus dem Mausmodell für Typ-2-Diabetes, Leprdb und Details eines Lebendzell-Assays zur Messung der Insulinsekretion von intakten Inseln, der 2-Photonenmikroskopie verwendet.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mausmodell des Typ-2-Diabetes: Pancreatic Islet Isolation und Live-cell 2-Photonen-Imaging von intakten Inseln

Dieses Inselisolierungsprotokoll beschrieb einen neuartigen Weg der Kollagenase-Injektion zur Verdauung des Exokringewebes und ein vereinfachtes Gradientenverfahren, um die Inseln von Mäusen zu reinigen. Es beinhaltet enzymatische Verdauung, Gradiententrennung/Reinigung und Islet-Handpicking. Eine erfolgreiche Isolierung kann 250–350 hochwertige und voll funktionsfähige Inselchen pro Maus ergeben.

Ein einfaches Hocheffizienzprotokoll für die Isolierung von Pankreas-Isleten von Mäusen

Ex-Vivo pancreatic Islet Studien sind wichtig für Diabetes-Forschung. Bestehende Techniken an kultivierte Inselchen in ihrer Muttersprache 3-dimensionale Architektur zu studieren sind zeitaufwendig, ineffizient und selten verwendete. Diese Arbeit beschreibt eine neue, einfache und effiziente Methode zur Erzeugung von qualitativ hochwertige Paraffin Abschnitte des gesamten kultivierten Inselchen.

Pancreatic Islet Einbettung für Paraffin Abschnitte

Dieses Protokoll skizziert eine Methode zur quantitativen Analyse der Mitophagie-Protein-Komplexbildung speziell in Beta-Zellen aus primären menschlichen Ischenproben. Diese Technik ermöglicht somit die Analyse der Mitophagie aus begrenztem biologischem Material, die in wertvollen menschlichen Betazellproben der Bauchspeicheldrüse entscheidend sind.

Visualisierung von endogenen Mitophagie-Komplexen in Situ in menschlichen Pankreas-Betazellen unter Verwendung von Proximity Ligation Assay

Hier stellen wir ein Protokoll zur Abbildung und Quantifizierung der Calciumdynamik in heterogenen Zellpopulationen wie Pankreas-Isletzellen vor. Fluoreszierende Reporter werden in die periphere Zellschicht innerhalb der Islet geliefert, die dann immobilisiert und abgebildet wird, und es wird eine pro-Zell-Analyse der Dynamik der Fluoreszenzintensität durchgeführt.

Bildgebende Calciumdynamik in Subpopulationen von Maus-Pankreas-Islet-Zellen

Ziel dieses Protokolls ist es, die Dynamik des menschlichen Pankreas-Islet-Entransplantierungsprozesses und des beitragenden Wirts- und Spenderzellen kontinuierlich zu überwachen. Dies wird durch die Transplantation menschlicher Inselchen in die vordere Augenkammer (ACE) eines NOD erreicht. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-Mausempfänger gefolgt von wiederholter 2-Photonen-Bildgebung.

Längsschnitt in Vivo Bildgebung und Quantifizierung der menschlichen Pankreas-Islet-Grafting- und Beitragenden Wirtszellen in der Vorderen Augenkammer

Wir präsentieren die Herstellung von akuten Pankreasgewebeschnitten und deren Verwendung in der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie, um die Calciumdynamik gleichzeitig in einer großen Anzahl lebender Zellen, über lange Zeiträume und mit hoher raumzeitlicher Auflösung zu untersuchen.

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie der Calciumdynamik in akuten Pankreasgewebeschnitten der Maus

In vivo wurde die hochauflösende Bildgebung der Bauchspeicheldrüse mit dem pankreasinen intravitalen Bildgebungsfenster erleichtert.

Stabilisierte longitudinale In Vivo Visualisierung der Bauchspeicheldrüse auf zellulärer Ebene in einem Murinenmodell mit einem Pankreas-Intravital-Bildgebungsfenster

Dieses Protokoll beschreibt, wie menschliche Bauchspeicheldrüsenschnitte von verstorbenen Organspendern erzeugt werden, um die Zellfunktion unter nahezu physiologischen Bedingungen zu untersuchen. Dieser innovative Ansatz ermöglicht die Untersuchung normaler und strukturell geschädigter Inselzellen und des komplexen Zusammenspiels zwischen endokrinen und exokrinen Kompartimenten.

Generierung von menschlichen Pankreasgewebeschnitten zur Untersuchung der endokrinen und exokrinen Pankreasphysiologie

Erfahren Sie die Methode lebender Pankreasgewebeschnitte zur Untersuchung von Inselfunktion und Immunzell-Interaktionen. Diese Technik bewahrt das native Mikromilieu und liefert Erkenntnisse über Diabetes und Pankreaserkrankungen.

Beobachtung der Inselfunktion und der Wechselwirkungen zwischen Insel-Immunzellen in lebenden Pankreasgewebeschnitten

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