Intravitale Multiphotonenmikroskopie in Echtzeit zur Visualisierung fokussierter Ultraschall- und Mikroblasenbehandlungen zur Erhöhung der Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke

Die Ultraschallexposition in Gegenwart von Mikrobläschen hat sich als wirksame Methode erwiesen, um die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke vorübergehend und lokal zu erhöhen. Normalerweise behindert die Blut-Hirn-Schranke die Abgabe potenzieller Medikamente für mehrere Hirnerkrankungen. Nach der Beschallung beginnen die injizierten Mikrobläschen zu oszillieren und induzieren eine Belastung der Gefäßwand, öffnen enge Verbindungen und lassen schließlich zu, dass Medikamente die Blut-Hirn-Schranke überwinden In präklinischen Modellen wird die Wirkung von Ultraschall und Mikroblasenbehandlung häufig durch kontrastmittelverstärkte Magnetresonanztomographie oder durch Untersuchung der Extravasation von Farbstoffen ex vivo untersucht.

Der Nachteil dieses Ansatzes besteht darin, dass die Echtzeitreaktion während und unmittelbar nach der Ultraschallexposition nicht erfasst werden kann. Die intravitale Multiphotonenbildgebung des Gehirns bietet die Möglichkeit, diese Effekte in Echtzeit zu untersuchen. Im folgenden Video präsentieren wir schrittweise Anweisungen, wie man ein Schädelfenster in einer Maus platziert und eine Ultraschall-Mikroblasenbehandlung mit einem am Schädel montierten Ringwandler durchführt.

Dieses Verfahren ermöglicht die gleichzeitige Beschallung und in vivo Multiphotonenbildgebung. Um mit der Vorbereitung der Materialien zu beginnen, die für die Schädelfensterchirurgie und Ultraschall-Mikroblasenbehandlungen benötigt werden. In diesem Video zeigen wir eine akute, nicht genesungsfreie Schädelfensteroperation.

Für die chronische Genesung sind Schädelfensterchirurgie, sterilisierte Werkzeuge und Materialien, ein steriler Operationsraum und geeignete Medikamente notwendig. Vor der Operation Verabreichen Sie Anästhesie und Analgesie. Entfernen Sie das Fell auf dem Kopf.

Legen Sie das Tier in einen stereotaktischen Rahmen. Führen Sie einen Katheter in die Schwanzvene für Dextran- und Mikroblaseninjektionen ein. Halten Sie die Kerntemperatur des Tieres von 37 Grad aufrecht, indem Sie eine Wärmequelle verwenden.

Hier verwenden wir einen mit warmem Wasser gefüllten Handschuh. Um die Kopfhaut zu entfernen, heben Sie die Haut zwischen den Augen mit einer Pinzette an und schneiden Sie entlang der sagittalen Naht. Entfernen Sie das Periost, das die äußere Oberfläche des Schädels bedeckt, mit einem Wattestäbchen.

Markieren Sie anschließend die gewünschte Position des Schädelfensters auf dem Schädel und beginnen Sie mit dem Bohren entlang des Umrisses. Um zu verhindern, dass der Schädel während des Bohrens überhitzt, tropfen Sie Kochsalzlösung mit einer Spritze auf den Schädel oder tragen Sie ein Stück chirurgischen Schwamm auf, der in Kochsalzlösung getränkt ist. Wechseln Sie zwischen Bohren und Kühlen des Schädels.

Überprüfen Sie den Bohrfortschritt, indem Sie sanften Druck auf die Knocheninsel ausüben. Entfernen Sie die Knocheninsel mit einer Pinzette. Stellen Sie sicher, dass das Gehirn feucht gehalten wird, indem Sie ein Stück chirurgischen Schwamm verwenden, der in Kochsalzlösung vorgeakelt wurde.

Um ein Schädelfenster zu platzieren, legen Sie einen Tropfen Kochsalzlösung auf eine Seite eines Deckglases und manövrieren Sie ihn über das Loch im Schädel. Verteilen Sie eine Schicht Klebstoff um den Umfang des Deckglases, um ihn am Schädel zu befestigen. Sobald der Kleber vollständig getrocknet ist, legen Sie die Agaroselösung auf das Fenster und stellen Sie den Aufnehmer darauf.

Üben Sie festen Druck aus, so dass zwischen dem Schallkopf und dem Schädelfenster nur minimale Agarose vorhanden ist. Wenn die Agarose auf eine Jell-O-ähnliche Konsistenz abgekühlt ist, schneiden Sie die überschüssige Agarose von den Umfängen des Deckglases des Schallkopfes weg. Verteilen Sie eine Schicht Klebstoff entlang der Umfänge des Deckglases des Schallkopfes, um ihn am Schädel zu befestigen.

Nachdem der Kleber vollständig getrocknet ist, positionieren Sie das Tier unter der Objektivlinse des Mikroskops. Stellen Sie sicher, dass das Objektiv nicht mit dem Aufnehmer oder Deckglas kollidiert. Wählen Sie ein Sichtfeld im Multiphotonenmikroskop aus.

Richten Sie einen bildgebenden Scan des Gefäßsystems ein und beginnen Sie mit der Beschallung. Für dieses Protokoll verwenden wir einen Ringaufnehmer, der mit einer Fahrfrequenz von 0,82 Megahertz betrieben wird, 10-Millisekunden-Zyklen, die mechanisch indiziert sind, von 0,2 bis 0,4 und Pulswiederholfrequenzen zwischen einem und vier Hertz. Sonovue-Mikrobläschen werden in einer Dosis von einem Milliliter pro Kilogramm injiziert.

Erfolgreiche Ultraschall-Mikroblasenbehandlungen können durch die Extravasation von fluoreszierendem Dextran vom intravaskulären in den extravaskulären Raum nachgewiesen werden, was auf eine Erhöhung der BHS-Permeabilität hinweist. Um die Kinetik der Dextran-Leckage als repräsentatives Modell für die Wirkstoffabgabe zu bewerten, kann die Signalintensität zwischen dem intra- und extravaskulären Raum mit Tools wie MATLAB bewertet werden. Um die durch Ultraschall-Mikroblasenbehandlungen induzierten Gefäßveränderungen zu bewerten, kann der Durchmesser des interessierenden Gefäßes vor, während und nach der Ultraschall-Mikroblasenbehandlung gemessen werden.

Die Bildanalyse kann mitHilfe von Software wie ImageJ, FIJI oder Programmierwerkzeugen durchgeführt werden. Hier wurde Imaris zur Blutgefäßsegmentierung und -klassifizierung verwendet. Die intravitale Multiphotonenmikroskopie des Gehirns in Kombination mit Ringwandlern bietet eine Methode, um die durch die Ultraschall-Mikroblasenbehandlung induzierten Effekte in Echtzeit mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu überwachen.

Quantitative und qualitative Daten können gewonnen werden, um beispielsweise die Extravasationskinetik und vaskuläre Veränderungen zu untersuchen. Die hier vorgestellte experimentelle Methode kann auf mehrere Forschungsmodelle und auf verschiedene Ultraschallanwendungen angewendet werden.