Name: Fortschrittliches Herzrhythmusmanagement durch Anwendung optogenetischer Multi-Site-Photostimulation bei murinen Herzen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Erfahren Sie die optogenetische Photostimulation von Langendorff-perfundierten murinen Herzen mit einer 3 x 3 Micro-LED-Anordnung. Diese Methode ermöglicht präzise, regionsspezifische Kontrolle kardialer Arrhythmien und bietet eine schonendere Alternative zur elektrischen Defibrillation.

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Die Autoren danken Marion Kunze und Tina Althaus für ihre hervorragende technische Unterstützung bei den Experimenten. Die Forschung, die zu den Ergebnissen geführt hat, wurde aus dem Siebten Rahmenprogramm der Europäischen Gemeinschaft RP7/2007-2013 unter der Finanzhilfevereinbarung HEALTH-F2-2009-241526 gefördert. Unterstützt wurde dies auch vom Deutschen Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung, dem DZHK e.V. (Projekt MD28), dem Partnerstandort Göttingen, dem SFB 1002 der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Teilprojekt C03) und der Max-Planck-Gesellschaft. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch BrainLinks-BrainTools, Exzellenzcluster der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, Förderkennzeichen EXC 1086).

Alle Versuche folgten strikt der Tierschutzverordnung, in Übereinstimmung mit der deutschen Gesetzgebung, lokalen Bestimmungen und in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA). Der Antrag auf Genehmigung von Tierversuchen wurde von der zuständigen Tierschutzbehörde genehmigt und alle Versuche wurden unseren Tierschutzbeauftragten gemeldet.
1. Versuchsvorbereitung und Materialien
<ol><li>Optisches Mapping-Setup HINWEIS: Der optische Aufbau sowie der elektrische Aufbau sind in Abbildung 1 dargestellt. Alle Komponenten, die im optischen und elektrischen Aufbau verwendet werden, sind in der Materialtabelle detailliert aufgeführt.<ol><li>Verwenden Sie LED 1 und LED 2 für die Induktion von Arrhythmie und Backup-Defibrillation. Wählen Sie Hochleistungs-LEDs mit einer Wellenlänge λblau nahe 475 nm, was dem Höhepunkt der Anregungswellenlänge von ChR26 entspricht. Um das optische Spektrum weiter einzuschränken, verwenden Sie einen Bandpassfilter von 470 ± 20 nm. HINWEIS: In dieser Arbeit haben LED 1 und LED 2 einen typischen Strahlungsstrom von 3,9 bis 5,3 W, gemäß dem Datenblatt20.</li>
		<li>Beleuchten Sie das Epikard für die optische Kartierung mit einer roten Hochleistungs-LED (LED 3 in Abbildung 1), die Licht mit einer Mittenwellenlänge von λrot = 625 nm und einem Strahlungsfluss von 700 mW21 emittiert. Das Rotlicht wird mit einem 628 ± 20 nm Bandpassfilter gefiltert und von einem dichroitischen Langpassspiegel (DM) mit einer Grenzwellenlänge von λDM = 685 nm reflektiert.</li>
		<li>Verwenden Sie einen Emissionsfilter mit λFilter-Cam = 775 ± 70 nm vor dem Kameraobjektiv, um nur die Fluoreszenzemission der Herzaktivität aufzuzeichnen. Verwenden Sie ein schnelles Objektiv, das sich gut für Anwendungen bei schlechten Lichtverhältnissen eignet. HINWEIS: Die Häufigkeit von Flimmern eines Mausherzens liegt zwischen 20 und 35 Hz; Verwenden Sie daher eine Kamera, die schnell genug ist, um mit einer Frequenz von 1 bis 2 kHz oder sogar höher aufzunehmen.</li>
	</ol></li>
	<li>Micro-LED-Array HINWEIS: Die hier verwendeten Mikro-LED-Arrays werden unter Verwendung von Mikrosystemverarbeitung realisiert, wie an anderer Stelle16,17 näher ausgeführt.<ol><li>Schleudern Sie eine 5 μm dicke Polyimidschicht (PI) auf 4-Zoll-Siliziumsubstrate (einseitig poliert, 525 μm dick).</li>
		<li>Diese PI-Schicht wird bei einer maximalen Temperatur von 450 °C unter Stickstoffatmosphäre ausgehärtet. Halten Sie die maximale Temperatur für 10 min konstant.</li>
		<li>Abscheiden und Mustern eines Bildumkehr-Fotolacks (PR) mittels ultravioletter (UV) Lithographie und Sputtern eine 250 nm dünne Platinschicht (Pt).</li>
		<li>Verdicken Sie diese Pt-basierte Metallisierung, indem Sie eine 1 μm dicke Goldschicht (Au) galvanisieren, wobei die gemusterte PR als Maskierungsschicht dient.</li>
		<li>Vor dem Schleudern einer zweiten PI-Schicht wird der Wafer mit seiner ersten PI-Schicht und der Au-galvanischen Metallisierung einem Sauerstoffplasma ausgesetzt, das die Oberfläche der PI-Schicht chemisch aktiviert.</li>
		<li>Die zweite PI-Schicht wird erneut bei 450 °C ausgehärtet, mittels UV-Lithographie eine PR-Schicht gemustert und die Kontaktpads des Arrays für die Mikro-LED-Chips und die Schnittstellenleiterplatte (PCB) durch reaktives Ionenätzen (RIE) unter Verwendung der gemusterten PR als Maskierungsschicht geöffnet. HINWEIS: In diesen RIE-Prozessschritten wird empfohlen, 200 W bzw. 100 W für 10 bzw. 30 Minuten aufzubringen, um die Kontaktpadöffnungen sowie die äußere Form des zweidimensionalen (2D) Mikro-LED-Arrays zu definieren.</li>
		<li>Entfernen Sie die PR mit Lösungsmitteln und Plasmaätzen. Verdicken Sie die Kontaktpads weiter, indem Sie eine zusätzliche 6 μm dicke Goldschicht galvanisieren.</li>
		<li>Befestigen Sie die Micro-LED-Chips mit einem Flip-Chip-Bonder an den Kontaktpads.</li>
		<li>Aktivieren Sie die PI-Oberfläche in einem Sauerstoffplasma und unterfüllen Sie die Mikro-LED-Chips mit einem lösemittelfreien Klebstoff. Anschließend den Klebstoff für 12 h bei 120 °C aushärten.</li>
		<li>Um die Mikro-LED-Chips zu verkapseln, führen Sie eine weitere Plasmabehandlung mit Argon durch und tragen Sie manuell eine dünne Fluorpolymerschicht auf. Diese Schicht bei 80 °C für 1 h vorhärten.</li>
		<li>Tragen Sie Silikon manuell als letzte Verkapselungsschicht auf, nachdem Sie das Mikro-LED-Array einem Sauerstoffplasma ausgesetzt haben, um die Siliziumhaftung an der darunter liegenden Fluorpolymerschicht zu verbessern. Die Silikonschicht bei 80 °C und 180 °C jeweils 1 h aushärten. Diese letzten Aushärtungsschritte härten auch die Fluorpolymerschicht vollständig aus.</li>
		<li>Löten Sie die Kontaktpads des PI-Substrats auf eine Leiterplatte, die Streifenanschlüsse für die Verbindung des Arrays mit einer externen Instrumentierung trägt. Decken Sie die Lötpads auf der Leiterplatte mit einem Klebstoff ab.</li>
	</ol></li>
	<li>Elektrischer Aufbau<ol><li>Verwenden Sie Elektroden, die für die Aufzeichnung eines Elektrokardiogramms (EKG) geeignet sind, z. B. Silber/Silberchlorid-Elektroden oder Monophasic Action Potential (MAP)-Elektroden und einen EKG-Verstärker, um die elektrische Aktivität des Herzens kontinuierlich zu überwachen. Verwenden Sie außerdem ein geeignetes Erfassungsgerät (AD), um alle erhaltenen elektrischen Signale aufzuzeichnen.</li>
		<li>Wählen Sie einen geeigneten Treiber für die Hochleistungs-LEDs (LED 1, LED 2 und LED 3), der den maximalen Strom an jedes Gerät verwalten kann. Verwenden Sie einen Arbiträrfunktionsgenerator (AFG), um den Ausgang der LED-Treiber genau zu steuern.</li>
		<li>Verwenden Sie einen Mehrkanal-LED-Treiber, um den Strom zu steuern, der durch das Micro-LED-Array fließt. Auch ein AFG mit mehreren Ausgängen ist für diese Aufgabe geeignet. HINWEIS: Es ist ratsam, LED-Treiber zu wählen, die den Strom auf den maximalen Strom der Mikro-LED begrenzen, da sonst die Dioden beschädigt werden können. Ein Beispiel für einen Mehrkanal-Mikro-LED-Treiber wird in einer anderen Arbeit18 beschrieben. Bei Bedarf kann der AFG oder ein anderer LED-Treiber an einen Computer angeschlossen werden, um die Micro-LED-Einstellungen fernzusteuern. Wenn dies der Fall ist, verbinden Sie den LED-Treiber mit dem Kommunikationsprotokoll Ihrer Wahl, z. B. General Purpose Interface Bus (GPIB) oder einer seriellen Verbindung.</li>
	</ol></li>
</ol>   

2. Versuchsverfahren
<ol><li>Lösungsvorbereitung<ol><li>Tyrode-Lösung vorbereiten: 130 mM NaCl, 4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 24 mM NaHCO3, 1,8 mM CaCl 2, 1,2 mM KH2 PO4, 5,6 mM Glucose,0,1% BSA/Albumin.</li>
		<li>Low-K+ Tyrode-Lösung vorbereiten: Low-K+ Tyrode's wird auf die gleiche Weise wie normale Tyrode's Lösung hergestellt, außer dass nur die Hälfte der Menge an KCl hinzugefügt wird (2 mM statt 4 mM KCl). HINWEIS: Für ein Experiment, das 3 h dauert, sind normalerweise 2-3 L Low-K+ Tyrode (zusätzlich gemischt mit Blebbistatin (Schritt 2.1.5), wenn eine optische Kartierung durchgeführt wird) und 1-2 L normale Tyrode ausreichend.</li>
		<li>Fügen Sie Pinacidil zu der Low-K + Tyrode-Lösung hinzu, um den Prozess der Arrhythmie-Induktion zu erleichtern, wie in22 beschrieben, um eine Konzentration von 100 mM zu erhalten. Tragen Sie beim Umgang mit Pinacidil Laborschutzhandschuhe.</li>
		<li>Bereiten Sie 1 ml 50 μM DI-4-ANBDQPQ mit normaler Tyrode-Lösung vor. Schützen Sie den Farbstoff vor Licht, um ein Photobleichen zu verhindern.</li>
		<li>Machen Sie eine 10 mM Stammlösung von Blebbistatin. Für die optische Kartierung mischen Sie Blebbistatin mit der 100 mM Pinacidil-Tyrode-Lösung (Schritt 2.1.3), um eine 5 μM-Lösung zu erhalten. Tragen Sie beim Umgang mit Blebbistatin Laborschutzhandschuhe. HINWEIS: Halten Sie sowohl den Farbstoff als auch die Blebbistatin-Lösung beiseite, bis die optische Zuordnung beginnt.</li>
	</ol></li>
	<li>Langendorff Perfusion HINWEIS: Das Setup besteht aus zwei Reservoirs für die beiden Tyrode-Lösungen. Sie sind über Rohre mit Dreiwegehähnen mit einer Blasenfalle verbunden. Das Herz wird später mit einem Luer-Lock-Anschluss an der Blasenfalle befestigt und dann in einem sechseckigen Wasserbad aufgehängt. Das Wasserbad wird wiederum mit einem Abfallbehälter verbunden, um die gebrauchte Tyrode-Lösung zu sammeln.<ol><li>Reinigen Sie alle Röhrchen vor jedem Versuch mit vollständig demineralisiertem Wasser.</li>
		<li>Belüften Sie beide Tyrode-Lösungen mit Carbogen (5% CO2 und 95%O2) für 30 min bei Raumtemperatur vor Beginn des Experiments. Stellen Sie den pH-Wert der Tyrode-Lösungen mit NaOH auf 7,4 ein.</li>
		<li>Füllen Sie 500 ml jeder Tyrode-Lösung in das entsprechende Reservoir und entlüften Sie die Röhrchen sowie die Blasenfalle, indem Sie Tyrodes Lösung durch das Perfusionssystem laufen lassen, bis keine eingeschlossenen Luftblasen mehr in den Röhrchen oder in der Blasenfalle zu sehen sind.</li>
		<li>Belüften Sie die Tyrode-Lösungen während des gesamten Experiments in den Reservoirs mit Carbogen, um sicherzustellen, dass der pH-Wert des Perfusats später während der Perfusion stabil bleibt.</li>
		<li>Heizen Sie die Perfusionsanlage mit einer Wasserwärmepumpe auf 37 °C. Halten Sie die Perfusattemperatur im Wasserbad konstant, indem Sie ein zusätzliches Heizelement wie ein wasserdichtes Heizkabel verwenden. HINWEIS: Während des Experiments ist es wichtig, die Reservoirs der Tyrode wieder aufzufüllen, bevor sie leer sind. Andernfalls können Luftblasen in das Herz eindringen, die die Gefäße verstopfen und zu Ischämie führen können.</li>
	</ol></li>
	<li>Maus-Vorbereitung<ol><li>Injizieren Sie subkutan 0,1 ml 500 I.E. Heparin 30 min vor der Herzisolierung.</li>
		<li>Füllen Sie eine 6 cm Petrischale und eine 2 ml Spritze mit eiskalter Tyrode-Lösung. Unter das stereoskopische Mikroskop legen.</li>
		<li>Führen Sie eine Kurzzeitanästhesie von Mäusen in einer gesättigten Isofluran-Umgebung für 2 Minuten und eine sofortige zervikale Dislokation danach durch. HINWEIS: Um eine ausreichende Anästhesie zu überprüfen, ist eine Überprüfung auf den negativen Interzehenreflex unbedingt erforderlich.</li>
		<li>Öffnen Sie die Brust, entfernen Sie das Herz, wie an anderer Stelle23 beschrieben, und legen Sie es in die 6 cm große Petrischale mit eiskalter Tyrode-Lösung. Herzschläge werden aufgrund des Temperaturabfalls verringert.</li>
		<li>Führen Sie die Feinvorbereitung unter einem stereoskopischen Mikroskop durch, wie an anderer Stelle beschrieben23. Befestigen Sie die Aorta auf der stumpfen Nadel und fixieren Sie das Gefäß mit Nahtmaterial.</li>
		<li>Als Kontrolle injizieren Sie eiskalte Tyrode-Lösung durch die Nadel in das Herz und überprüfen Sie, ob das Herz fest montiert ist. Dieser Schritt spült auch das restliche Blut aus dem Herzen.</li>
		<li>Übertragen Sie das montierte Herz in das Perfusionssystem. Stellen Sie sicher, dass das Perfusat fließt, um zu verhindern, dass Luft in das Herz eindringt, während Sie die Nadel mit der Blasenfalle verbinden. Überprüfen Sie, ob das Herz mit Tyrodes Lösung im Wasserbad bedeckt ist. Die Schritte 2.3.4, 2.3.5 und 2.3.7 sind in Abbildung 2 dargestellt.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass das Herz innerhalb weniger Minuten zu schlagen beginnt. Lassen Sie das Herz für 15 bis 20 Minuten an den Perfusionsaufbau anpassen und wechseln Sie dann zu einer Lösung mit niedrigem K+ Tyrode mit Pinacidil (Schritt 2.1.3) bzw. einer Lösung mit niedrigem K+ Tyrode mit Pinacidil und Blebbistatin (Schritt 2.1.5), wenn ein optisches Mapping durchgeführt werden soll.</li>
	</ol></li>
	<li>Arrhythmie-Induktion und optische Defibrillation<ol><li>Platzieren Sie eine der EKG-Elektroden so nah wie möglich an der Herzoberfläche, um eine gute Signalqualität zu gewährleisten. Suspendieren Sie die zweite EKG-Elektrode in der Tyrode-Lösung. Stellen Sie sicher, dass das erworbene EKG von der AD Ihrer Wahl aufgezeichnet wird.</li>
		<li>Platzieren Sie das Micro-LED-Array auf dem interessierenden Bereich der Studie, beispielsweise auf dem linken Ventrikel.</li>
		<li>Ändern Sie die Perfusion auf Low-K+ Tyrode's mit Pinacidil und perfundiert Sie das Herz für 15 bis 30 min.</li>
		<li>Um Arrhythmien zu induzieren, beleuchten Sie das Herz mit LED 1 und LED 2 mit einem Zug von 20 bis 50 Lichtimpulsen mit einerFrequenz von 25 bis 35 Hz, einer Pulsdauer Wind von 2 bis 15 ms und einer Lichtintensität LIopt_ind von 2,8 mW mm-2.</li>
		<li>Wiederholen Sie den Vorgang, bis eine Arrhythmie induziert wird. HINWEIS: Arrhythmien sind im EKG-Signal leicht zu identifizieren, da sich die Frequenz und Morphologie des Signals vom normalen Sinusrhythmus unterscheiden. Sollte die Arrhythmie innerhalb der nächsten 5 s enden, klassifizieren Sie sie als selbstbeendet und starten Sie einen neuen Induktionsversuch.</li>
		<li>Sobald eine anhaltende Arrhythmie visuell erkannt wird, wenden Sie einen Impulsstoß mit unterschiedlichen Breiten W def und Frequenzen fdef an, wobei drei, sechs oder neun Mikro-LEDs des Arrays bei einem pulsierendenStrom-I-Impuls von 15 mA verwendet werden, der einer Lichtintensität LIμLED = 33,31 ± 2,05 mW mm-2 entspricht.</li>
		<li>Sollte die Arrhythmie nach fünf Mikro-LED-Array-basierten Defibrillationsversuchen anhalten, klassifizieren Sie den Versuch als erfolglos und beginnen Sie mit der Backup-Defibrillation.</li>
		<li>Verwenden Sie für die Backup-Defibrillation LED 1 und LED 2 mit denselben Timing-Parametern wie für das Micro-LED-Array. HINWEIS: Da das Herz während des gesamten Versuchszeitraums ischämischem und metabolischem Stress ausgesetzt ist, ist es möglich, dass Abbruchversuche der Arrhythmie auch bei Backup-Defibrillation nicht erfolgreich sind. Wann immer dies geschieht, wechseln Sie die Perfusionslösung auf die normale Tyrode's und lassen Sie das Herz für 5 bis 10 Minuten erholen. Wenn das EKG zum Sinusrhythmus zurückkehrt, wiederholen Sie das Protokoll aus Schritt 2.4.3 erneut.</li>
	</ol></li>
	<li>Optisches Mapping<ol><li>Perfusion des Herzens mit der in Schritt 2.1.5 vorbereiteten Blebbistatinlösung und warten Sie, bis eine mechanische Entkopplung erfolgt. Dies wird erreicht, wenn das Herz aufhört zu schlagen, aber ein EKG-Signal immer noch messbar ist. HINWEIS: Das Mischen der Blebbistatin-Lösung auf die genannte Konzentration und das Durchbluten des Herzens mit dieser Lösung hält die kardiale mechanische Aktivität während des gesamten Experiments von der elektrischen Aktivität entkoppelt.</li>
		<li>Geben Sie den 1 mL Spannungsfarbstoff DI-4-ANBDQPQ (hergestellt in Schritt 2.1.4) als Bolus in die Blasenfalle der Langendorff-Perfusion. Warten Sie 5 bis 10 Minuten, damit der Farbstoff das Herz gleichmäßig durchbluten kann. HINWEIS: Vermeiden Sie das Photobleichen des Farbstoffs, indem Sie das rote Licht ausschalten, wenn keine Aufnahme gemacht wird. Wenn das Signal-Rausch-Verhältnis der Aufzeichnung zu klein wird (das erfasste Signal ist zu verrauscht), wiederholen Sie die Schritte 2.1.4 und 2.5.2.</li>
		<li>Fokussieren Sie die Kamera auf die Herzoberfläche, schalten Sie LED 3 ein und legen Sie 1,27 mW mm-2 optische Leistung an.</li>
		<li>Schalten Sie die Laborbeleuchtung aus und starten Sie die Aufnahme. Stellen Sie sicher, dass ein optisches Signal erfasst wird, indem Sie die Frequenz des erhaltenen Signals mit der Frequenz des aufgezeichneten EKGs vergleichen. Dadurch wird sichergestellt, dass das erhaltene optische Signal ausschließlich mit der elektrischen Aktivität des Herzens zusammenhängt. HINWEIS: Da das vom Farbstoff emittierte Fluoreszenzlicht sehr wöchentlich ist, wird die optische Kartierung in einem dunklen Raum durchgeführt. Dadurch werden Signalstörungen durch andere Lichtquellen vermieden.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Eine erfolgreiche Behandlung von Herzrhythmusstörungen ist der Schlüssel zur kardialen Therapie. Die biophysikalischen Mechanismen, die der Initiierung, Aufrechterhaltung und Beendigung von Arrhythmien zugrunde liegen, sind jedoch nicht vollständig verstanden. Die Herzforschung zielt daher darauf ab, die Elektroschocktherapie in Richtung eines schonenderen Abbaus von Arrhythmien zu optimieren und dadurch die Lebensqualität der Patienten zu erhöhen 28,29,30,31.<su...

Frühe Untersuchungen der räumlich-zeitlichen Dynamik bei Arrhythmien zeigten, dass die komplexen elektrischen Muster beim Herzflimmern durch wirbelartig rotierende Erregungswellen angetrieben werden1. Dieser Befund lieferte neue Einblicke in die zugrunde liegenden Mechanismen von Arrhythmien, die dann zur Entwicklung neuartiger elektrischer Terminationstherapien führten, die auf der Multi-Site-Anregung des Myokards 2,3,4 basieren. Behandlungen mit elektrischer Feldstimulation sind jedoch nicht lokal und können alle umliegenden erregbaren Zellen, einschließlich Muskelgewebe, innervieren, was zu Zell- und Gewebeschäden sowie zu unerträglichen Schmerzen führt. Im Gegensatz zu elektrischen Therapien bieten optogenetische Ansätze eine spezifische und gewebeschützende Technik, um Kardiomyozyten-Aktionspotentiale mit hoher räumlicher und zeitlicher Präzision zu evozieren. Daher hat die optogenetische Stimulation das Potenzial zur minimalinvasiven Kontrolle der chaotischen Aktivierungsmuster während des Herzflimmerns.
Die Einführung des lichtempfindlichen Ionenkanalkanals Rhodopsin-2 (ChR2) in erregbare Zellen durch genetische Manipulation 5,6,7 ermöglichte die Depolarisation des Membranpotentials erregbarer Zellen mittels Photostimulation. Mehrere medizinische Anwendungen, einschließlich der Aktivierung neuronaler Netzwerke, der Kontrolle der Herzaktivität, der Wiederherstellung von Seh- und Hörvermögen, der Behandlung von Rückenmarksverletzungen und anderen 8,9,10,11,12,13,14 wurden entwickelt. Die Anwendung von ChR2 in der Kardiologie hat aufgrund seiner Millisekunden-Reaktionszeit15 ein erhebliches Potenzial und eignet sich daher gut zur gezielten Steuerung der arrhythmischen Herzdynamik.
In dieser Studie wird die Multi-Site-Photostimulation intakter Herzen eines transgenen Mausmodells gezeigt. Zusammenfassend wurde im Rahmen des Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Gemeinschaft FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) eine transgene alpha-MHC-ChR2-Mauslinie etabliert und freundlicherweise von Prof. S. E. Lehnart zur Verfügung gestellt. Im Allgemeinen wurden transgene erwachsene männliche C57/B6/J, die Cre-Rekombinase unter Kontrolle von alpha-MHC exprimieren, gepaart, um sich mit dem weiblichen B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdTomato)Hye/J zu paaren. Da die kardiale STOP-Kassette in der zweiten Generation gelöscht wurde, zeigten die Nachkommen eine stabile MHC-ChR2-Expression und wurden zur Aufrechterhaltung kardialer lichtempfindlicher Kolonien verwendet. Alle Experimente wurden mit erwachsenen Mäusen beiderlei Geschlechts im Alter von 36 - 48 Wochen durchgeführt. Die Beleuchtung wird mit einem 3 x 3 Mikro-LED-Array erreicht, das wie in16,17 beschrieben hergestellt wird, mit der Ausnahme, dass das siliziumbasierte Gehäuse und die kurzen optischen Glasfasern nicht implementiert sind. Seine erste Verwendung in einer kardialen Anwendung findet sich in18. Ein lineares Mikro-LED-Array, das auf einer ähnlichen Fertigungstechnologie basiert, wurde als durchdringende Sonde für die Herzschrittweite19 eingesetzt. Die Mikro-LEDs sind in einem 3 x 3-Array mit einem Abstand von 550 μm angeordnet und bieten sowohl eine hohe räumliche Auflösung als auch eine hohe Strahlungsleistung auf einer sehr kleinen Fläche. Die Autoren demonstrieren in dieser Arbeit eine vielseitige lokale Multi-Site-Photostimulation, die den Weg für die Entwicklung neuartiger antiarrhythmischer Therapiemethoden ebnen kann.
Das folgende experimentelle Protokoll beinhaltet eine retrograde Langendorff-Perfusion ex vivo, bei der die kanülierte Aorta als Perfusionseinlass fungiert. Durch den angelegten Perfusionsdruck und die Herzkontraktion fließt das Perfusat durch die Koronararterien, die von der Aorta abzweigen. In der vorgestellten Arbeit wird das Herz mit einem konstanten Druckaufbau durchblutet, der durch Anheben der Perfusatreservoirs auf 1 m Höhe erreicht wird, was 73,2 mmHg entspricht, was zu einer Durchflussrate von 2,633 ± 0,583 ml / min führt. Zwei Arten von Tyrode-Lösung werden während des Experiments als Perfusat verwendet. Die reguläre Tyrode-Lösung unterstützt einen stabilen Sinusrhythmus, während die Lösung von Low-K + Tyrode mit Pinacidil gemischt wird, um die Induktion von Arrhythmien in murinen Herzen zu ermöglichen. Die Verwendung eines hexagonalen Wasserbades ermöglicht die Beobachtung des Herzens durch sechs verschiedene planare Fenster, was die Kopplung mehrerer optischer Komponenten mit weniger Verzerrung durch Brechung ermöglicht.

<table><tbody><tr><td>Chemische Bestandteile</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>TargetMol</td><td>T6038</td><td>10 mM Stammlösung</td></tr><tr><td>BSA/Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Westfalen</td><td></td><td>50 l Flasche</td></tr><tr><td>DI-4-ANBDQPQ</td><td>AAT Bioquest</td><td>21499</td><td>Farbstoff für optisches Mapping</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9434</td><td>C6H12O6</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>LEO Pharma</td><td></td><td>Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, verschreibungspflichtig</td></tr><tr><td>Hydrochloridsäure</td><td>Merck</td><td>1.09057.1000</td><td>HCl, 1 M Stammlösung</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>CP Pharma</td><td></td><td>1 ml/ml, verschreibungspflichtig</td></tr><tr><td>Magnesium Chlorid</td><td>Merck</td><td>8.14733.0500</td><td>MgCl2</td></tr><tr><td>Monokaliumphosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30407</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Pinacidil Monohydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P154-500mg</td><td>10 mM Stammlösung</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>Natrium Chlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Merck</td><td>1.09137.1000</td><td>NaOH, 1 M Stammlösung</td></tr><tr><td>Elektrische Einrichtung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biopac MP150</td><td>Biopac Systems</td><td>MP150WSW</td><td>Datenerfassungs- und Analysesystem</td></tr><tr><td>Maßgeschneidertes EKG, alternativ ECG100C</td><td>Biopac Systems</td><td>ECG100C</td><td>Elektrokardiogramm-Verstärker</td></tr><tr><td>Maßgeschneiderte Wasserbadheizung mit Heizkabel</td><td>RMS Heizsystem</td><td>HK-5,0-12</td><td>Heizkabel 120W</td></tr><tr><td>Sechseckiges Wasserbad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LED-Treiber Netzteil</td><td>Thorlabs</td><td>KPS101</td><td>15 V, 2,4 A Netzteil mit 3,5 mm Klinkenstecker für einen K- oder T-Würfel.</td></tr><tr><td>LEDD1B LED-Treiber</td><td>Thorlabs</td><td>LEDD1B</td><td>T-Cube LED-Treiber, 1200 mA Max Drive</td></tr><tr><td>Current MAP, EKG-Elektrode</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>BS4&nbsp; 73-0200</td><td>Mini-EKG-Elektrode für isoaltierte Herzen</td></tr><tr><td>Micro-LED-Treiber z.B. AFG</td><td>Agilent Instruments</td><td>A-2230</td><td>Arbiträrfunktionsgenerator (AFG)</td></tr><tr><td>Signalgenerator</td><td>Agilent Instruments</td><td>A-2230</td><td></td></tr><tr><td>AFG micro-LED Array Komponenten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epoxidkleber Epoxid</td><td>Technologie</td><td>EPO-TEK 353ND</td><td>Zweikomponenten-Epoxidharz</td></tr><tr><td>Fluorpolymer</td><td> Asahi Glass Co. Ltd.</td><td>Cytop 809M</td><td>Fluorpolymer mit hoher Transparenz</td></tr><tr><td>Bildumkehr-Fotolack</td><td>Merck KGaA</td><td>AZ 5214E</td><td>Bildumkehrlack für hochauflösende</td></tr><tr><td>LED-Chips</td><td>&nbsp; Cree Inc.</td><td>C460TR2227-S2100</td><td>Blauer Mikro-LED-Fotolack</td></tr><tr><td></td><td>Merck KGaA</td><td>AZ 9260</td><td>Dicke Positiv-Fotolacke</td></tr><tr><td>Polyimid</td><td>UBE Industries Ltd.</td><td>U-Varnish S</td><td>Polyimidlösung</td></tr><tr><td>Silikon</td><td>NuSil Technology LLC</td><td>MED-6215</td><td>Niedrigviskoses Silikonelastomer</td></tr><tr><td>Lösemittelfreier Klebstoff</td><td>John P. Kummer GmbH</td><td>Epo-Tek 301-2</td><td>Epoxidharz mit niedriger Viskosität</td></tr><tr><td>Optisches Mapping</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blauer Filter</td><td>Chroma Technology Corporation</td><td>ET470/40x</td> Blauer <td>Anregungsfilter</td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Photometrie</td><td>Cascade 128+</td><td>Hochleistungs-EMCCD-Kamera</td></tr><tr><td>Kameraobjektiv</td><td>Navitar</td><td>DO-5095</td><td>Navitar Hochgeschwindigkeits-Objektive mit Festbrennweite funktionieren mit CCD- und CMOS-Kameras</td></tr><tr><td>Dichroitischer Spiegel</td><td>Semrock</td><td>FF685-Di02-25x36</td><td>685 nm Kante BrightLine&reg; einschneidiger Standard Epifluoreszenz dichroitischer Strahlteiler</td></tr><tr><td>Emmision Filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-775/140-25</td><td>775/140 nm BrightLine&reg; Singleband-Bandpassfilter</td></tr><tr><td>Kühlkörper</td><td>Advanced Thermal Solutions</td><td>ATSEU-077A-C3-R0</td><td>Kühlkörper - LED STAR LED Kühlkörper, Ø 45mm, 68mm, Schwarz/Silber, ohne Gewinde Bodenplatte Hardware</td></tr><tr><td>LED 1 und LED 2</td><td>LED Engin Osram</td><td>LZ4-00B208</td><td>High Power LEDs - Einfarbig Blau, 460 nm 130 lm, 700mA</td></tr><tr><td>LED 3</td><td>Thorlabs</td><td>M625L3</td><td>625 nm, 700 mW (Min) Gefasste LED, 1000 mA</td></tr><tr><td>Linsen</td><td>LED Engin Osram</td><td>LLNF-2T06-H</td><td>LED-Beleuchtung Linsen Baugruppen LZ4 OBJEKTIV SCHMALER FLUTSTRAHL</td></tr><tr><td>Fotodiode für Leistungsmesser</td><td>Thorlabs</td><td>S120VC</td><td>Standard Fotodiode Leistungssensor</td></tr><tr><td>Leistungsmesser</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>Kompakter Leistungs- und Energiemesser</td></tr><tr><td>Roter Filter</td><td>Semrock</td><td>FF02-628/40-25</td><td>BrightLine&reg; Singleband-Bandpassfilter</td></tr></tbody></table>

fortschrittliches herzrhythmusmanagement durch anwendung optogenetischer multi-site-photostimulation bei murinen herzen

Advanced Cardiac Rhythm Management by Applying Optogenetic Multi-Site Photostimulation in Murine Hearts

Ventrikuläre Tachyarrhythmien sind weltweit eine der Hauptursachen für Mortalität und Morbidität. Die elektrische Defibrillation mit hochenergetischen Elektroschocks ist derzeit die einzige Behandlung für lebensbedrohliches Kammerflimmern. Defibrillation kann jedoch Nebenwirkungen haben, einschließlich unerträglicher Schmerzen, Gewebeschäden und einer Verschlechterung der Prognose, was auf einen erheblichen medizinischen Bedarf für die Entwicklung sanfterer Herzrhythmusmanagementstrategien hinweist. Neben energiereduzierenden elektrischen Ansätzen wurde die kardiale Optogenetik als leistungsfähiges Werkzeug zur Beeinflussung der Herzaktivität durch lichtempfindliche Membranionenkanäle und Lichtpulse eingeführt. In der vorliegenden Studie wird eine robuste und valide Methode zur erfolgreichen Photostimulation von Langendorff-perfundierten intakten Mausherzen beschrieben, die auf Multi-Site-Pacing unter Verwendung eines 3 x 3-Arrays von Mikro-Leuchtdioden (Mikro-LED) basiert. Die simultane optische Kartierung von Epikardialmembranspannungswellen ermöglicht die Untersuchung der Effekte der regionsspezifischen Stimulation und wertet die neu induzierte Herzaktivität direkt vor Ort aus. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die Wirksamkeit der Defibrillation stark von den Parametern abhängt, die für die Photostimulation während einer Herzrhythmusstörung ausgewählt wurden. Es wird gezeigt, dass der beleuchtete Bereich des Herzens eine entscheidende Rolle für den Abbrucherfolg spielt und wie die gezielte Steuerung der Herzaktivität während der Beleuchtung zur Modifikation von Arrhythmiemustern erreicht werden kann. Zusammenfassend bietet diese Technik die Möglichkeit, die Mechanismusmanipulation vor Ort auf dem Weg zur Echtzeit-Feedback-Kontrolle des Herzrhythmus zu optimieren und in Bezug auf die Regionsspezifität neue Ansätze zur Reduzierung der potenziellen Schädigung des Herzsystems im Vergleich zur Verwendung von unspezifischen elektrischen Schlaganwendungen zu entwickeln.

Das Protokoll ermöglicht die Induktion von ventrikulären Arrhythmien in intakten murinen Herzen unter Verwendung von Photostimulationsimpulsen, die von LED 1 und LED 2 erzeugt werden (Abbildung 1) mit einer Frequenz f ind zwischen 25 Hz und 35 Hz und einer Pulsdauer Wind zwischen 2 ms und 10 ms. Bitte beachten Sie, dass das Ziel solcher schnellen Lichtimpulse nicht darin besteht, den Herzrhythmus zu erfassen, sondern die Herzaktivität aus dem Gleichgewicht zu bringen, s...

Diese Arbeit berichtet über eine Methode zur Kontrolle des Herzrhythmus intakter muriner Herzen von transgenen Kanalrhodopsin-2 (ChR2) Mäusen unter Verwendung lokaler Photostimulation mit einem Mikro-LED-Array und gleichzeitiger optischer Kartierung des Epikardialmembranpotentials.

Fortschrittliches Herzrhythmusmanagement durch Anwendung optogenetischer Multi-Site-Photostimulation bei murinen Herzen

Ventricular tachyarrhythmias are a major cause of mortality and morbidity worldwide. Electrical defibrillation using high-energy electric shocks is ...

Die physikalisch am meisten zugrunde liegenden Herzflimmern und Defibrillation bleiben nicht vollständig verstanden. Die Optogenetik kann eine Möglichkeit bieten, mehr Einblick in Herzphänomene in einer gut kontrollierten Umgebung zu erhalten. Die lokale Lichtstimulation mittels Mikro-LEDs ermöglicht die Innovation spezifischer Herzgewebebereiche.Diese gezielte Stimulation ist ein neues Werkzeug, um herzschonende antiarithmetische Therapiemethoden zu entwickeln. Das gezeigte Protokoll kann verwendet werden, um das Herzverhalten während Herzrhythmusstörungen und insbesondere während des Abbruchs zu untersuchen. Prospektiv können die entwickelten Techniken verwendet werden, um klinisch relevantere Großtiermodelle zu untersuchen.Reinigen Sie vor jedem Versuch alle Röhrchen mit vollständig entmineralisiertem Wasser. Schilddrüsenlösungen mit Carbogen 30 Minuten bei Raumtemperatur belüften und den pH-Wert mit Natronlauge und Salzsäure auf 7,3 einstellen. Heizen Sie das Perfusionssystem mit einer Wasserwärmepumpe auf 37 Grad Celsius.Halten Sie die Perfusattemperatur im Wasserbad konstant, indem Sie ein zusätzliches Heizelement wie ein wasserdichtes Heizkabel verwenden. Geben Sie 500 Milliliter jeder Schilddrüsenlösung in das entsprechende Reservoir und entlüften Sie die Röhrchen sowie die Blasenfalle, indem Sie Schilddrüsenlösung durch das Perfusionssystem laufen lassen, bis keine eingeschlossenen Luftblasen mehr in den Röhrchen oder in der Blasenfalle zu sehen sind. Belüften Sie die Schilddrüsenlösungen während des gesamten Experiments in den Reservoirs mit Carbogen, um sicherzustellen, dass der pH-Wert des Perfusats später während der Perfusion stabil bleibt.Nach dem Entfernen des Herzens führen Sie die Feinvorbereitung unter einem stereoskopischen Mikroskop durch. Befestigen Sie die Aorta auf der stumpfen Nadel und fixieren Sie das Gefäß mit Nahtmaterial. Als Kontrolle injizieren Sie eiskalte Schilddrüsenlösung durch die Nadel in das Herz und überprüfen Sie, ob das Herz fest montiert ist.Übertragen Sie das montierte Herz in das Perfusionssystem und stellen Sie sicher, dass das Perfusat fließt, um zu verhindern, dass Luft in das Herz eindringt, während die Nadel mit der Blasenfalle verbunden wird. Überprüfen Sie, ob das Herz im Wasserbad mit Schilddrüsenlösung bedeckt ist und innerhalb weniger Minuten schlägt. Platzieren Sie eine der EKG-Elektroden so nah wie möglich an der Herzoberfläche, um eine gute Signalqualität zu gewährleisten.Setzen Sie die zweite EKG-Elektrode in der Schilddrüsenlösung aus und stellen Sie sicher, dass das EKG aufgezeichnet wird. Platzieren Sie das Micro-LED-Array auf dem interessierenden Bereich. Ändern Sie die Perfusion auf niedrige Kalium-Schilddrüse mit Penecidle und lesen Sie das Herz für 15 bis 30 Minuten.Um Arrhythmien auszulösen, beleuchten Sie das Herz mit LED eins und LED zwei mit einem Zug von 20 bis 50 Lichtimpulsen mit einer Frequenz von 25 bis 35 Hertz, einer Pulsdauer von zwei bis 15 Millisekunden und einer Lichtintensität von 2,8 Milliwatt pro Quadratmillimeter. Wiederholen Sie den Vorgang, bis eine Arrhythmie induziert wird. Sobald eine anhaltende Arrhythmie visuell erkannt wird, wenden Sie einen Impulsstoß mit unterschiedlichen Breiten und Frequenzen an, indem Sie drei, sechs oder neun Mikro-LEDs des Arrays bei einem pulsierenden Strom von 15 Milliampere Piers verwenden.Wenn die Arrhythmie nach fünf Mikro-LED-Array-basierten Defibrillationsversuchen anhält, klassifizieren Sie den Versuch als fehlgeschlagen und starten Sie die Backup-Defibrillation mit LED eins und LED zwei mit denselben Zeitparametern. Durchbluten Sie das Herz mit der Blebbistatinlösung und warten Sie, bis eine mechanische Entkopplung stattfindet, die erreicht wird, wenn das Herz aufhört zu schlagen, aber ein EKG-Signal noch messbar ist. Geben Sie den Ein-Milliliter-Spannungsfarbstoff, Farbstoff 4-A-N-B-D-Q-P-Q als Bolus in die Blasenfalle der Langendorff-Perfusion und warten Sie fünf bis 10 Minuten, damit der Farbstoff das Herz gleichmäßig durchgehen kann.Schalten Sie LED drei ein. Fokussieren Sie die Kamera auf die Herzoberfläche und wenden Sie 1,27 Milliwatt pro Quadratmillimeter optischer Leistung an. Schalten Sie die Laborbeleuchtung aus und starten Sie die Aufnahme, um sicherzustellen, dass ein optisches Signal erfasst wird, indem Sie die Frequenz des erhaltenen Signals mit der Frequenz des aufgezeichneten EKGs vergleichen.Eine Reihe von Experimenten mit unterschiedlichen Frequenzen, Anzahl der Mikro-LED und Pulsdauern wurde an 11 Mäusen getestet und zeigte, dass Impulse von 1 bis 20 Millisekunden mit unterschiedlichen Erfolgsraten defibrillieren können. Es gibt eine signifikante Steigerung der Erfolgsrate der neun LEDs mit Pulsdauern von einer Millisekunde und 20 Millisekunden bei einer Defibrillationsfrequenz von 18 und 20 Hertz, was näher an der analysierten mittleren Arrhythmiefrequenz von 22,55 aller Arrhythmien mit einem Fehlerintervall von plus oder minus vier Komma Null drei Hertz liegt. Zwei verschiedene Defibrillationsversuche mit 14 Hertz Frequenz mit ihren EKG-Aufnahmen und ihren jeweiligen Spektrogrammen werden hier gezeigt.In einem Beispiel für eine Defibrillation mit 30-Millisekunden-Impulsen steigt die dominante Frequenz der Arrhythmie leicht an, bis die Photostimulation beginnt. Die VF wird in eine VT umgewandelt, bei der die dominante Frequenz auf 14 Hertz sinkt, gefolgt von erfolgloser Beendigung und Rückkehr zu arrhythmischem Verhalten mit einer dominanten Frequenz von 24 Hertz. Im zweiten Beispiel zeigt Segment eins einen VT mit einer dominanten Frequenz von 23 Hertz und seinen harmonischen Komponenten bis zum Beginn der Photostimulation mit einer Pulsbreite von 20 Millisekunden.Segment drei zeigt einen erfolgreichen Abschluss, der zu einem normalen Sinusrhythmus mit einer Grundfrequenz von 3,5 Hertz und den daraus resultierenden Obertönen führt. Optische Kartierungen mit Hochgeschwindigkeitskameras zeigten eine Änderung der Fluoreszenzintensität während eines einzelnen Herzschlags während eines normalen Sinusrhythmus. Die Dauer der Durchblutung muss alle Bedingungen einhalten, um das Herz gesund zu halten, nämlich die Temperatur, der pH-Wert und die Oxidation müssen konstant bleiben.Es ist besonders wichtig, dass die Tyroidlösung nicht leer läuft, da Luftblasen im System das Herz schädigen können. Das Micro-Reality-Array bietet große Flexibilität. Sie können verschiedene Stellen des Herzens anvisieren oder sogar mehrere Arrays in einem Experiment kombinieren, um Arrhythmien richtig zu beenden.

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Dieser Artikel beschreibt ein hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung Technik optisch Bild Aktionspotential Bewegung auf der Oberfläche von Langendorff-perfundierten Rattenherzen mit einem potentiometrischen Farbstoff (di-8-ANEPPS).

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Wir präsentieren ein Protokoll zur Bewertung der elektromechanischen Wirkungen der GtACR1-Aktivierung in Kaninchen-Kardiomyozyten. Wir bieten detaillierte Informationen über Zellisolation, Kultivierung und adenovirale Transduktion sowie über funktionelle Experimente mit den Patch-Clamp- und Carbonfaser-Techniken.

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Das vorliegende Protokoll beschreibt die Erzeugung von Drosophila melanogaster , die eNpHR2.0 oder ReaChR-Opsine im Herzen exprimieren, für die OCT-Bildgebung und die optogenetische Herzschrittbildung. Detaillierte Anweisungen für die Drosophila OCT-Bildgebung und Herzschlagmodulation, einschließlich der Simulation von wiederherstellbarem Herzstillstand, Bradykardie und Tachykardie bei lebenden Tieren in verschiedenen Entwicklungsstadien, werden berichtet.

Entwicklung von Drosophila melanogaster Modellen für die Bildgebung und optogenetische Kontrolle der Herzfunktion

Dieses Protokoll führt eine optische Dual-Dye-Kartierung von Mausherzen ein, die von Wildtyp- und Knock-in-Tieren mit katecholaminerger polymorpher ventrikulärer Tachykardie betroffen sind, einschließlich elektrophysiologischer Messungen der Transmembranspannung und intrazellulärerCa2+ -Transienten mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung.

Optisches Dual-Dye-Mapping von Herzen aus RyR2R2474S Knock-In-Mäusen mit katecholaminerger polymorpher ventrikulärer Tachykardie

Dieses Protokoll veranschaulicht ein Verfahren zur optogenetischen Stimulation von intrinsischen Herzneuronen in transgenen Mausherzen. Der beschriebene Ansatz wird verwendet, um die Kinetik der plötzlichen Aktivierung von Herzneuronen in ex vivo perfundierten Herzen und die Wechselwirkungen zwischen cholinerger und katecholaminerger Aktivität zu untersuchen.

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Die Steuerung von Herzzellen und -gewebe mit Licht ermöglicht eine berührungslose Stimulation, wodurch der natürliche Zustand und die Funktion der Zellen erhalten bleiben, was sie zu einem wertvollen Ansatz sowohl für die Grundlagenforschung als auch für therapeutische Anwendungen macht.

Ein kardiales mikrophysiologisches System zur Untersuchung der Ca2+ -Ausbreitung durch nicht-genetische optische Stimulation

Erfahren Sie die optogenetische Photostimulation von Langendorff-perfundierten murinen Herzen mit einer 3 x 3 Micro-LED-Anordnung. Diese Methode ermöglicht präzise, regionsspezifische Kontrolle kardialer Arrhythmien und bietet eine schonendere Alternative zur elektrischen Defibrillation.

Fortschrittliches Herzrhythmusmanagement durch Anwendung optogenetischer Multi-Site-Photostimulation bei murinen Herzen

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