Fortschrittliches Herzrhythmusmanagement durch Anwendung optogenetischer Multi-Site-Photostimulation bei murinen Herzen

Die physikalisch am meisten zugrunde liegenden Herzflimmern und Defibrillation bleiben nicht vollständig verstanden. Die Optogenetik kann eine Möglichkeit bieten, mehr Einblick in Herzphänomene in einer gut kontrollierten Umgebung zu erhalten. Die lokale Lichtstimulation mittels Mikro-LEDs ermöglicht die Innovation spezifischer Herzgewebebereiche.

Diese gezielte Stimulation ist ein neues Werkzeug, um herzschonende antiarithmetische Therapiemethoden zu entwickeln. Das gezeigte Protokoll kann verwendet werden, um das Herzverhalten während Herzrhythmusstörungen und insbesondere während des Abbruchs zu untersuchen. Prospektiv können die entwickelten Techniken verwendet werden, um klinisch relevantere Großtiermodelle zu untersuchen.

Reinigen Sie vor jedem Versuch alle Röhrchen mit vollständig entmineralisiertem Wasser. Schilddrüsenlösungen mit Carbogen 30 Minuten bei Raumtemperatur belüften und den pH-Wert mit Natronlauge und Salzsäure auf 7,3 einstellen. Heizen Sie das Perfusionssystem mit einer Wasserwärmepumpe auf 37 Grad Celsius.

Halten Sie die Perfusattemperatur im Wasserbad konstant, indem Sie ein zusätzliches Heizelement wie ein wasserdichtes Heizkabel verwenden. Geben Sie 500 Milliliter jeder Schilddrüsenlösung in das entsprechende Reservoir und entlüften Sie die Röhrchen sowie die Blasenfalle, indem Sie Schilddrüsenlösung durch das Perfusionssystem laufen lassen, bis keine eingeschlossenen Luftblasen mehr in den Röhrchen oder in der Blasenfalle zu sehen sind. Belüften Sie die Schilddrüsenlösungen während des gesamten Experiments in den Reservoirs mit Carbogen, um sicherzustellen, dass der pH-Wert des Perfusats später während der Perfusion stabil bleibt.

Nach dem Entfernen des Herzens führen Sie die Feinvorbereitung unter einem stereoskopischen Mikroskop durch. Befestigen Sie die Aorta auf der stumpfen Nadel und fixieren Sie das Gefäß mit Nahtmaterial. Als Kontrolle injizieren Sie eiskalte Schilddrüsenlösung durch die Nadel in das Herz und überprüfen Sie, ob das Herz fest montiert ist.

Übertragen Sie das montierte Herz in das Perfusionssystem und stellen Sie sicher, dass das Perfusat fließt, um zu verhindern, dass Luft in das Herz eindringt, während die Nadel mit der Blasenfalle verbunden wird. Überprüfen Sie, ob das Herz im Wasserbad mit Schilddrüsenlösung bedeckt ist und innerhalb weniger Minuten schlägt. Platzieren Sie eine der EKG-Elektroden so nah wie möglich an der Herzoberfläche, um eine gute Signalqualität zu gewährleisten.

Setzen Sie die zweite EKG-Elektrode in der Schilddrüsenlösung aus und stellen Sie sicher, dass das EKG aufgezeichnet wird. Platzieren Sie das Micro-LED-Array auf dem interessierenden Bereich. Ändern Sie die Perfusion auf niedrige Kalium-Schilddrüse mit Penecidle und lesen Sie das Herz für 15 bis 30 Minuten.

Um Arrhythmien auszulösen, beleuchten Sie das Herz mit LED eins und LED zwei mit einem Zug von 20 bis 50 Lichtimpulsen mit einer Frequenz von 25 bis 35 Hertz, einer Pulsdauer von zwei bis 15 Millisekunden und einer Lichtintensität von 2,8 Milliwatt pro Quadratmillimeter. Wiederholen Sie den Vorgang, bis eine Arrhythmie induziert wird. Sobald eine anhaltende Arrhythmie visuell erkannt wird, wenden Sie einen Impulsstoß mit unterschiedlichen Breiten und Frequenzen an, indem Sie drei, sechs oder neun Mikro-LEDs des Arrays bei einem pulsierenden Strom von 15 Milliampere Piers verwenden.

Wenn die Arrhythmie nach fünf Mikro-LED-Array-basierten Defibrillationsversuchen anhält, klassifizieren Sie den Versuch als fehlgeschlagen und starten Sie die Backup-Defibrillation mit LED eins und LED zwei mit denselben Zeitparametern. Durchbluten Sie das Herz mit der Blebbistatinlösung und warten Sie, bis eine mechanische Entkopplung stattfindet, die erreicht wird, wenn das Herz aufhört zu schlagen, aber ein EKG-Signal noch messbar ist. Geben Sie den Ein-Milliliter-Spannungsfarbstoff, Farbstoff 4-A-N-B-D-Q-P-Q als Bolus in die Blasenfalle der Langendorff-Perfusion und warten Sie fünf bis 10 Minuten, damit der Farbstoff das Herz gleichmäßig durchgehen kann.

Schalten Sie LED drei ein. Fokussieren Sie die Kamera auf die Herzoberfläche und wenden Sie 1,27 Milliwatt pro Quadratmillimeter optischer Leistung an. Schalten Sie die Laborbeleuchtung aus und starten Sie die Aufnahme, um sicherzustellen, dass ein optisches Signal erfasst wird, indem Sie die Frequenz des erhaltenen Signals mit der Frequenz des aufgezeichneten EKGs vergleichen.

Eine Reihe von Experimenten mit unterschiedlichen Frequenzen, Anzahl der Mikro-LED und Pulsdauern wurde an 11 Mäusen getestet und zeigte, dass Impulse von 1 bis 20 Millisekunden mit unterschiedlichen Erfolgsraten defibrillieren können. Es gibt eine signifikante Steigerung der Erfolgsrate der neun LEDs mit Pulsdauern von einer Millisekunde und 20 Millisekunden bei einer Defibrillationsfrequenz von 18 und 20 Hertz, was näher an der analysierten mittleren Arrhythmiefrequenz von 22,55 aller Arrhythmien mit einem Fehlerintervall von plus oder minus vier Komma Null drei Hertz liegt. Zwei verschiedene Defibrillationsversuche mit 14 Hertz Frequenz mit ihren EKG-Aufnahmen und ihren jeweiligen Spektrogrammen werden hier gezeigt.

In einem Beispiel für eine Defibrillation mit 30-Millisekunden-Impulsen steigt die dominante Frequenz der Arrhythmie leicht an, bis die Photostimulation beginnt. Die VF wird in eine VT umgewandelt, bei der die dominante Frequenz auf 14 Hertz sinkt, gefolgt von erfolgloser Beendigung und Rückkehr zu arrhythmischem Verhalten mit einer dominanten Frequenz von 24 Hertz. Im zweiten Beispiel zeigt Segment eins einen VT mit einer dominanten Frequenz von 23 Hertz und seinen harmonischen Komponenten bis zum Beginn der Photostimulation mit einer Pulsbreite von 20 Millisekunden.

Segment drei zeigt einen erfolgreichen Abschluss, der zu einem normalen Sinusrhythmus mit einer Grundfrequenz von 3,5 Hertz und den daraus resultierenden Obertönen führt. Optische Kartierungen mit Hochgeschwindigkeitskameras zeigten eine Änderung der Fluoreszenzintensität während eines einzelnen Herzschlags während eines normalen Sinusrhythmus. Die Dauer der Durchblutung muss alle Bedingungen einhalten, um das Herz gesund zu halten, nämlich die Temperatur, der pH-Wert und die Oxidation müssen konstant bleiben.

Es ist besonders wichtig, dass die Tyroidlösung nicht leer läuft, da Luftblasen im System das Herz schädigen können. Das Micro-Reality-Array bietet große Flexibilität. Sie können verschiedene Stellen des Herzens anvisieren oder sogar mehrere Arrays in einem Experiment kombinieren, um Arrhythmien richtig zu beenden.