Name: DNA-Spannungssonden zur Kartierung der transienten Piconewton-Rezeptor-Kräfte durch Immunzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Erfahren Sie die Kartierung transienter Piconewton-Kräfte durch Immunzellen mit DNA-Spannungssonden. Diese Methode ermöglicht die Speicherung kurzlebiger mechanischer Signale für die spätere Analyse mittels Fluoreszenzmikroskopie.

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Diese Arbeit wurde durch die NIH Grants R01GM131099, NIH R01GM124472 und NSF CAREER 1350829 unterstützt. Wir danken der NIH Tetramer Facility für pMHC-Liganden. Diese Studie wurde zum Teil durch den Emory Comprehensive Glycomics Core unterstützt.

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</ol>

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Mit den hier vorgestellten detaillierten Verfahren kann man DNA-Haarnadel-Spannungssondensubstrate herstellen, um die von Immunzellen produzierte Rezeptorspannung zu kartieren und zu quantifizieren. Wenn Zellen auf das Substrat der DNA-Haarnadel-Spannungssonde plattiert werden, landen, heften sie sich an und breiten sich aus, während die Rezeptoren die Liganden sowohl chemisch als auch mechanisch wahrnehmen, wobei letzteres von unseren Sonden erkannt wird. In einigen Fällen kann es jedoch vorkommen, dass sich die Zellen ...

Immunzellen wehren sich gegen Krankheitserreger und Krebszellen, indem sie kontinuierlich die Oberflächen von Zielzellen nach Antigenen durchsuchen und deren Oberfläche abtasten 1,2. Die Antigenerkennung wird durch die Bindung zwischen dem T-Zell-Rezeptor (TCR) und dem Peptid-Major-Histokompatibilitätskomplex MHC (pMHC) eingeleitet, der auf der Oberfläche der Zielzellen exprimiert wird. Da die TCR-pMHC-Erkennung an der Verbindungsstelle zwischen zwei beweglichen Zellen erfolgt, steht sie seit langem im Verdacht, mechanische Kräfte zu erfahren. Darüber hinaus führte dies zum Mechanosensormodell der TCR-Aktivierung, das darauf hindeutet, dass TCR-Kräfte zu seiner Funktion beitragen 3,4. Um zu verstehen, wann, wo und wie mechanische Kräfte zur Funktion von T-Zellen beitragen, ist es unerlässlich, Werkzeuge zu entwickeln, um die von T-Zellen übertragenen molekularen Kräfte sichtbar zu machen. Traditionell werden Methoden wie Zugkraftmikroskopie (TFM) und Mikrosäulen-Arrays verwendet, um zelluläre Kräfte zu untersuchen 5,6. Die Kraftempfindlichkeit von TFM- und Mikrosäulen-Arrays liegt jedoch im Nanonewton (nN)-Bereich und reicht daher oft nicht aus, um die molekularen Piconewton (pN)-Kräfte zu untersuchen, die von Zellrezeptoren übertragenwerden 7. Um die Kraft und die räumliche Auflösung für die Detektion zu verbessern, leistete unser Labor Pionierarbeit bei der Entwicklung von molekularen Spannungssonden, die ursprünglich mit Polyethylenglykol (PEG)-Polymeren synthetisiert wurden7. Molekulare Spannungssonden bestehen aus einer ausziehbaren molekularen "Feder" (PEG, Protein, DNA), die von einem Fluorophor und Quencher flankiert wird und auf einer Oberfläche verankert ist. Kräfte, die auf den Endpunkt der Sonde ausgeübt werden, führen zu ihrer Verlängerung, trennen Fluorophor und Quencher und erzeugen so ein starkes Fluoreszenzsignal (Abbildung 1A)8,9,10.
In den letzten zehn Jahren haben wir eine Bibliothek verschiedener Klassen von molekularen Zugsonden mit Federelementen aus Nukleinsäuren11, Proteinen10 und Polymeren8 entwickelt. Unter diesen bieten die DNA-basierten Zugsonden das höchste Signal-Rausch-Verhältnis und die größte Kraftempfindlichkeit, die leicht von wenigen pN bis zu ~20 pN11 eingestellt werden kann. Wir haben diese Echtzeit-DNA-Spannungssonden verwendet, um die molekularen Kräfte zu untersuchen, die von vielen verschiedenen Zelltypen erzeugt werden, darunter Fibroblasten, Krebszellen, Blutplättchen und Immunzellen11,12,13. In diesem Manuskript werden Protokolle zur Synthese und Montage von DNA-Zugsonden auf einer Oberfläche beschrieben, um molekulare Rezeptorkräfte mit pN-Kraftauflösung unter Verwendung eines konventionellen Fluoreszenzmikroskops abzubilden. Während das derzeitige Verfahren chemische Modifikationen der Nukleinsäure umfasst, um den fluoreszierenden Reporter einzuführen (Abbildung 1B), ist es wichtig zu beachten, dass viele der Modifikations- und Aufreinigungsschritte an kundenspezifische DNA-Syntheseunternehmen ausgelagert werden können. Daher ist die Technologie der DNA-Spannungssonden einfach und für die breitere Gemeinschaft der Zellbiologie und Mechanobiologie zugänglich.
Kurz gesagt, um DNA-Spannungssensoren zusammenzubauen, wird eine DNA-Haarnadel mit einem fluoreszierenden Ligandenstrang auf einem Arm und einem Quencher-Ankerstrang auf dem anderen Arm hybridisiert und dann auf einem Glassubstrat immobilisiert (Abbildung 1C, Echtzeitspannung). In Abwesenheit einer mechanischen Kraft wird die Haarnadel geschlossen und somit die Fluoreszenz gelöscht. Wenn jedoch die ausgeübte mechanische Kraft größer als F1/2 ist (die Kraft im Gleichgewicht, die zu einer 50%igen Wahrscheinlichkeit der Entfaltung führt), schmilzt die Haarnadel mechanisch und es wird ein fluoreszierendes Signal erzeugt.
Aufbauend auf dem Echtzeit-DNA-Spannungssensor beschreiben wir auch Protokolle zur Kartierung akkumulierter Kräfte, was besonders nützlich ist, um Interaktionen zwischen Rezeptoren auf Immunzellen und ihrem natürlichen Liganden zu untersuchen. Dies liegt daran, dass Immunrezeptoren oft kurzlebige Bindungen aufweisen 3,14. Die akkumulierten Kräfte werden mit einem "verriegelnden" Strang abgebildet, der bevorzugt an offene DNA-Haarnadeln bindet und die Speicherung von Fluoreszenzsignalen ermöglicht, die mit mechanischen Zugereignissen verbunden sind (Abbildung 1C, verriegelte Spannung). Der Verriegelungsstrang ist so konzipiert, dass er eine kryptische Bindungsstelle bindet, die beim mechanisch induzierten Schmelzen der Haarnadel freigelegt wird, und die Haarnadel im offenen Zustand sperrt, indem er die Rückfaltung der Haarnadel blockiert, wodurch das Spannungssignal gespeichert und eine akkumulierte Spannungskarte erzeugt wird. Darüber hinaus ist der Locking-Strang mit einem Acht-Nukleotid-Zehengriff ausgelegt, der eine Zehengriff-vermittelte Strangverdrängungsreaktion mit seinem vollständigen Komplement, dem "entsperrenden" Strang, ermöglicht. Durch das Hinzufügen des Entriegelungsstrangs wird der gebundene Verriegelungsstrang vom Hairpin-Konstrukt abgestreift, wodurch das gespeicherte Spannungssignal gelöscht und der Hairpin wieder in den Echtzeitzustand zurückgesetzt wird.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62348/62348fig01.jpg"> Abbildung 1: Schema der hochmodernen molekularen Spannungssonden. (A) Allgemeines Design einer Echtzeit-Molekularspannungssonde, (B) Stränge für das DNA-basierte Spannungssondenkonstrukt und (C) DNA-basierte Spannungssonden und deren Umschalten zwischen Echtzeitzustand und verriegeltem Zustand. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62348/62348fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Das Hauptprotokoll besteht aus vier Hauptabschnitten - Oligonukleotidpräparation, Oberflächenpräparation, Bildgebung und Datenanalyse. Dieses Protokoll wurde von unserem Labor und anderen erfolgreich in naiven und aktivierten OT-1 CD8+ T-Zellen, OT-II CD4+ Zellen sowie Hybridomen demonstriert und kann angewendet werden, um verschiedene Immunzellrezeptoren zu untersuchen, einschließlich des T-Zell-Rezeptors, des programmierten Zelltodrezeptors (PD1) und der Lymphozytenfunktions-assoziierten Antigen-1-Kräfte (LFA-1). OT-1 CD8+ naive T-Zellen werden in dieser Arbeit als Beispielzelllinie verwendet.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; 3-Hydroxypicolinsäure (3-HPA)</td><td>Sigma</td><td>56197</td><td>maldi-TOF-MS-Matrix</td></tr><tr><td>&nbsp; mPEG-SC</td><td>Biochempeg</td><td>MF001023-2K</td><td>Oberflächenvorbereitung</td></tr> <tr><td>(3-Aminopropyl)triethoxysilan</td><td>Acros</td><td>AC430941000</td><td>Oberflächenvorbereitung</td></tr><tr><td>10x Puffer für die Lyse roter Blutkörperchen</td><td>Biolegend</td><td>00-4333-57</td><td>Puffer</td></tr><tr><td>8,8 nm Goldnanopartikel, Gerbsäure</td><td>Nanocomposix</td><td>kundenspezifische Oberflächenvorbereitung</td><td></td></tr><tr><td>Atto647N NHS-Ester</td><td>Sigma</td><td>18373-1MG-F</td><td>Fluorophor, Oligo prep</td></tr><tr><td>Attofluor Zellkammer, für die Mikroskopie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Imaging BD Spritzen nur mit Luer-Lok</td><td>BD bioscience</td><td>309657</td><td>Zellen</td></tr><tr><td>biotinylierte Anti-Maus CD3e</td><td>ebioscience</td><td>13-0031-82</td><td>Antikörper/Ligand</td></tr><tr><td>Biotinyliertes pMHC Ovalbumin (SIINFEKL)</td><td>NIH Tetramer Core Facility an der Emory University</td><td>NA-Antikörper</td><td>/Ligand</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>735078001</td><td>blockieren unspezifische Wechselwirkungen</td></tr><tr><td>Zellsiebe</td><td>Biologix</td><td>15-1100</td><td>Zellen</td></tr><tr><td>Deckglas Mini-Rack, Teflon</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C14784</td><td>Oberflächenvorbereitung</td></tr><tr><td>Cy3B NHS-Ester</td><td>GE Healthcare</td><td>PA63101</td><td>Fluorophor, Oligovorbereitung</td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td>Puffer</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>459836</td><td>Oberflächenvorbereitung</td></tr><tr><td>Hank' s ausgewogene Salze (HBSS)</td><td>Sigma</td><td>H8264</td><td>Puffer</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td>Oberflächenvorbereitung</td></tr><tr><td>LA-PEG-SC</td><td>Biochempeg</td><td>HE039023-3.4K</td><td>Oberflächenvorbereitung</td></tr><tr><td>Midi MACS (LS) Startup-Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-301</td><td>Zellen</td></tr><tr><td>Maus CD8+ T-Zell-Isolationskit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-075</td><td>Zellen</td></tr><tr><td>Nanosep MF Zentrifugalgeräte</td><td>Pall Labor</td><td>ODM02C35</td><td>Oligo Prep</td></tr><tr><td>Nr. 2 runde Glasdeckgläser</td><td>VWR</td><td>48382-085</td><td>Oberflächenvorbereitung</td></tr><tr><td>NTA-SAM</td><td>Dojindo Molecular Technologies</td><td>N475-10</td><td>Oberflächenvorbereitung</td></tr><tr><td>P2 Gel</td><td>Bio-rad</td><td>1504118</td><td>Oligo Vorbereitung</td></tr><tr><td>Sufurinsäure</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>SX1244-6</td><td>Oberflächenvorbereitung</td></tr><tr><td>Sulfo-NHS-Acetat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26777</td><td>Oberflächenvorbereitung</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent AdvanceBio Oligonukleotid C18 Säule, 4,6 x 150 mm, 2,7 &mu; m</td><td>653950-702</td><td></td><td>Oligonukleotid-Präparat</td></tr><tr><td>Barnstead Nanoreines Wasserreinigungssystem</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Wasser</td></tr><tr><td>CFI Apo 100 mal; NA 1.49 Objektiv</td><td>Nikon</td><td></td><td>Mikroskopie</td></tr><tr><td>Cy5 Würfel</td><td>CHROMA</td><td></td><td>Mikroskopie</td></tr><tr><td>Evolve Electron Multiplying Charge Coupled Device (EMCCD)</td><td>Photometrie</td><td></td><td>Mikroskopie</td></tr><tr><td>Hochleistungsflüssigkeitschromatographie</td><td>Agilent 1100</td><td></td><td>Oligonukleotidvorbereitung</td></tr><tr><td>Intensivlicht-Epifluoreszenzquelle</td><td>Nikon</td><td></td><td>Mikroskopie</td></tr><tr><td>Matrixgestützte Laserdesorptions-/Ionisations-Lichtlaufzeit-Massenspektrometer (MALDI-TOF-MS)</td><td>Voyager STR</td><td></td><td>Oligonukleotidpräparation</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 UV-Vis Spektralphotometer</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Oligonukleotidpräparation</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti inverses Mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td>Mikroskopie</td></tr><tr><td>Nikon Perfect Focus System</td><td>Nikon</td><td></td><td>Mikroskopie</td></tr><tr><td>NIS Elements Software</td><td>Nikon</td><td></td><td>Mikroskopie</td></tr><tr><td>Quad-Band TIRF 405/488/561/647 Würfel</td><td>CHROMA</td><td></td><td>Mikroskopie</td></tr><tr><td>RICM Würfel</td><td>CHROMA</td><td></td><td>Mikroskopie TIRF</td></tr><tr><td>Launcher mit 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW) und 640 nm</td><td>Kohärente</td><td></td><td>Mikroskopie</td></tr><tr><td>TRITC Würfel</td><td>CHROMA</td><td></td><td>Mikroskopie</td></tr><tr><td>oligo name</td><td>5' Modifikation / 3' Modifikation</td><td>sequence (5' bis 3')</td><td>Use</td></tr><tr><td>15mer amin locking strang</td><td>5' Modifikation: keine Modifikation 3' Modifikation: /3AmMO/</td><td>AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA</td><td>Locking Echtzeit-Spannungssignal</td></tr><tr><td>15mer Atto647N Locking-Strang</td><td>5' Modifikation: Atto647N 3' Modifikation: /3AmMO/</td><td>AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA</td><td>Locking Echtzeit-Spannungssignal</td></tr><tr><td>15mer nicht fluoreszent Locking-Strang</td><td>5' Modifikation: keine Modifikation 3' Modifikation: keine Modifikation</td><td>A AAA AAC ATT TAT</td><td>AC locking Echtzeit-Zugsignal für quantitative Analyse</td></tr><tr><td>4,7 pN Haarnadel Strähne</td><td>5' Modifikation: keine Modifikation 3' Modifikation: </stark> keine Modifikation</td><td>GTGAAATACCGCAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC-Haarnadelsonde</td><td></td></tr><tr><td>Amin-Ligandenstrang</td><td>5' Modifikation: /5AmMC6/ 3' Modifikation: /3Bio/</td><td>CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT</td><td>Haarnadelsonde</td></tr><tr><td>BHQ2 Ankerstrang</td><td>5' Modifikation: /5ThiolMC6-D/ 3' Modifikation: /3BHQ_2</td>/<td>TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTT</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Hairpin-Sonde</td></tr><tr><td>Cy3B Ligandenstrang</td><td>5' Modifikation: Cy3B 3' Modifikation: /3Bio/</td><td>CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT</td><td>Haarnadelsonde</td></tr><tr><td>zum Entriegeln</td> des <td>Strangs5' Modifikation: keine Modifikation 3' Modifikation: </stark> keine Modifikation</td><td>TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C</td><td>Freischaltung des akkumulierten Zugsignals</td></tr></tbody></table>

dna-spannungssonden zur kartierung der transienten piconewton-rezeptor-kräfte durch immunzellen

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

Mechanische Kräfte, die an der Verbindungsstelle zwischen zwei benachbarten Zellen und an der Verbindungsstelle zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix übertragen werden, sind entscheidend für die Regulierung vieler Prozesse, die von der Entwicklung bis zur Immunologie reichen. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die Werkzeuge zu entwickeln, um diese Kräfte auf molekularer Ebene zu untersuchen. Unsere Gruppe entwickelte eine Reihe von molekularen Spannungssensoren, um die von Zellen erzeugten und auf bestimmte Liganden übertragenen Kräfte zu quantifizieren und zu visualisieren. Die empfindlichste Klasse von molekularen Spannungssensoren besteht aus Nukleinsäure-Stammschleifen-Haarnadeln. Diese Sensoren verwenden Fluorophor-Quencher-Paare, um die mechanische Dehnung und Entfaltung von DNA-Haarnadeln unter Krafteinwirkung zu melden. Eine Herausforderung bei DNA-Hairpin-Spannungssensoren besteht darin, dass sie reversibel sind, wobei die Hairpin-Spannung beim Beenden der Spannung schnell zurückgefaltet werden kann und somit transiente Kräfte schwer zu erfassen sind. In diesem Artikel beschreiben wir die Protokolle zur Herstellung von DNA-Spannungssensoren, die "verriegelt" und am erneuten Falten gehindert werden können, um das "Speichern" mechanischer Informationen zu ermöglichen. Dies ermöglicht die Aufzeichnung von hochtransienten Piconewton-Kräften, die anschließend durch die Zugabe komplementärer Nukleinsäuren, die die Sperre entfernen, "gelöscht" werden können. Diese Fähigkeit, zwischen Echtzeit-Spannungsmapping und mechanischer Informationsspeicherung umzuschalten, offenbart schwache, kurzlebige und weniger reichlich vorhandene Kräfte, die von T-Zellen üblicherweise als Teil ihrer Immunfunktionen eingesetzt werden.

Hier zeigen wir repräsentative Bilder zur Kontrolle der Oberflächenqualität (Abbildung 4). Eine hochwertige Oberfläche sollte einen sauberen Hintergrund im RICM-Kanal (Abbildung 4B) und eine gleichmäßige Fluoreszenzintensität im Cy3B-Kanal (Abbildung 4C) aufweisen. Bei gleichen bildgebenden Geräten und identischen Aufnahmebedingungen für die Fluoreszenzbildgebung sollte die Hintergrundfluoreszenzintensität bei der Durchführung von E...

In dieser Arbeit wird ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von DNA-basierten Spannungssonden beschrieben, um die von Immunzellen ausgeübten Rezeptorkräfte abzubilden. Dieser Ansatz kann Rezeptorkräfte >4,7 pN in Echtzeit abbilden und Kräfte über die Zeit integrieren.

DNA-Spannungssonden zur Kartierung der transienten Piconewton-Rezeptor-Kräfte durch Immunzellen

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...

Dieses Protokoll bietet eine Methode, um die molekularen Kräfte abzubilden, die von Zellen und insbesondere von Immunzellen erzeugt werden. Das Protokoll ist von entscheidender Bedeutung für Labore, die an der Untersuchung der Mechanotransduktion in der Mechanobiologie interessiert sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie sehr einfach ist und es ermöglicht, die konventionelle Fluoreszenzmikroskopie zu verwenden, um die Kraftübertragung in immortalisierten und primären Zellen zu quantifizieren.Legen Sie zunächst 25-Millimeter-Deckgläser in ein Polytetrafluorethylen-Gestell in einem 50-Milliliter-Becherglas und spülen Sie die Deckgläser dreimal ab, indem Sie sie in Wasser tauchen. Mischen Sie Ethanol und Wasser zu gleichen Teilen und geben Sie 40 Milliliter dieser Lösung in das Becherglas mit dem Gestell und den Deckgläsern. Verschließen Sie dann das Becherglas mit Parafilmband.Reinigen Sie die Deckgläser, indem Sie das Becherglas 15 Minuten lang in einem Ultraschallreiniger beschallen und die Flüssigkeit nach der Beschallung entsorgen. Spülen Sie dann das Becherglas mit dem Rost und den Deckgläsern mindestens sechsmal mit Wasser aus, um verbleibende organische Lösungsmittel zu entfernen. Um eine frische Piranha-Lösung zuzubereiten, geben Sie 30 Milliliter Schwefelsäure in ein 50-Milliliter-Becherglas und fügen Sie langsam 10 Milliliter Wasserstoffperoxid hinzu.Mischen Sie die Piranha-Lösung vorsichtig mit dem Ende einer Glaspipette. Um mit dem Ätzen zu beginnen, geben Sie das Gestell mit den Deckgläsern in das Becherglas mit der Piranha-Lösung und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Deckgläser zu reinigen und zu hydroxylieren. Übertragen Sie dann das Gestell mit einer Pinzette aus Stahl oder Polytetrafluorethylen in ein sauberes 50-Milliliter-Becherglas und spülen Sie es sechsmal mit Wasser ab.Um das Wasser vollständig zu entfernen, tauchen Sie das Gestell mit den Deckgläsern in ein 50-Milliliter-Becherglas mit 40 Milliliter Ethanol. Entsorgen Sie dann das Ethanol. Tauchen Sie das Gestell anschließend eine Stunde lang bei Raumtemperatur in 40 Milliliter Ethanol mit 3 % Aminopropyltriethoxysilan, um die Reaktion mit der Hydroxylgruppe auf den Deckgläsern einzuleiten.Spülen Sie die Oberfläche der Deckgläser sechsmal ab, indem Sie sie in 40 Milliliter Ethanol tauchen, und trocknen Sie sie 20 Minuten lang in einem Ofen bei 80 Grad Celsius. Decken Sie den inneren Boden der Petrischale mit einem Parafilmband ab, um zu verhindern, dass die Deckgläser in die Petrischale rutschen. Legen Sie dann die aminbedeckten Deckgläser mit der zu funktionalisierenden Seite mit DNA-Zugsonden nach oben.Decken Sie die Deckgläser für die spätere Verwendung bei 20 Grad Celsius ab. Um die Amingruppen auf den Deckgläsern zu modifizieren, fügen Sie Liponsäure PEG NHS und mPEG NHS hinzu und inkubieren Sie die Petrischale eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Oberfläche am Ende der Inkubation dreimal mit Wasser ab.Danach werden 100 Mikroliter 0,1 molaren Natriumbicarbonat, das ein Milligramm pro Milliliter Sulfo-NHS-Acetat enthält, in einen Satz Sandwichdeckgläser gegeben und 30 Minuten lang inkubiert, damit die Passivierung stattfinden kann. Geben Sie 0,5 Milliliter Goldnanopartikel in jedes Deckglas und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Deckgläser nach der Inkubation dreimal mit Wasser ab.Nachdem Sie Black Hole Quencher 2-Strang im Verhältnis zehn zu eins in die getemperte DNA-Zugsonde gegeben haben, fügen Sie 100 Mikroliter der Mischung pro zwei Deckgläser hinzu, um das Sandwich herzustellen. Legen Sie vorsichtig eine nasse Labortaschentuchkugel in die Petrischale, weg von den Deckgläsern, und verschließen Sie die Schale mit Parafilmklebeband, um ein Austrocknen der Lösung zu verhindern. Danach die Schüssel mit einer Folie abdecken und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.Montieren Sie am nächsten Tag die Bildgebungskammer und achten Sie darauf, dass beim Festziehen der Kammer keine Oberflächenrisse entstehen. Geben Sie dann 0,5 bis einen Milliliter Hank's Balanced Salt Solution in die Bildgebungskammer. Verwenden Sie den Cy3B-Kanal mit einem 100-fachen Objektiv, um Fluoreszenzsignale von Zellen zu erfassen, die auf die DNA-Haarnadel-Spannungssonden aufgetragen werden, wenn sie sich auszubreiten beginnen.Nach der Herstellung von 100 nicht fluoreszierenden microMolaren Locking-Strang-Material wird es zum gewünschten Zeitpunkt in einer Endkonzentration von einem microMolar in der Bildgebungskammer zu den Zellen gegeben, um das Spannungssignal zu speichern, und es durch Pipettieren mit den Zellen mischen. Nach etwa 10 Minuten Sperre können Sie Zeitrafferfilme oder Endpunktbilder in Epifluoreszenz sowohl für die qualitative Spannungskartierung als auch für die quantitative Analyse aufnehmen. Eine gelungene Oberfläche hatte eine blassrosa Farbe.Die hohe Qualität der Oberfläche wurde mit einem sauberen Untergrund und der Reflexionsinterferenzkontrastmikroskopie bzw. dem RICM-Kanal und einer gleichmäßigen Fluoreszenzintensität im Cy3B-Kanal demonstriert. Zeitrafferbilder der Spannungsverriegelung zeigten, dass sowohl TCR-Anti-CD3-Epsilon- als auch TCR-Peptid-MHC-Spannungssignale aufgrund von Hairpin-Locking und Signalakkumulation verstärkt wurden. Der Verriegelungsstrang zeichnete kurzlebige mechanische Zugereignisse des TCR-Peptids MHCN4 ab null Minuten auf, was die quantitative Analyse erleichterte und das eindeutige Muster der TCR-Peptid-MHC-Kraft aufdeckte, das dem Bullseye-Muster von Immunsynapsen ähnelte.Jeder Schritt bei der Vorbereitung des Substrats erfordert Liebe zum Detail und einen sorgfältigen Umgang mit den Materialien. Diese Technologie ermöglicht die Visualisierung von transienten molekularen Kräften, die an der Zelloberfläche auftreten, wenn sie mit der Umgebung interagiert, insbesondere in den Immunzellen auf der Suche nach Antigene.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir stellen zwei unabhängige, Mikroskop-basierten Tools zur induzierten Nuklear-und Zytoskelett-Verformungen in Einzel-, Wohn adhärente Zellen in Reaktion auf die globale oder lokale Dehnung Anwendung zu messen. Diese Techniken werden verwendet, um nukleare Steifigkeit (dh, Verformbarkeit) zu ermitteln und intrazellulären Kraftübertragung zwischen dem Kern und dem Zytoskelett-Sonde.

Biophysikalische Assays auf die mechanischen Eigenschaften der Interphase Zellkern Probe: Substrat Dehnungs-Anwendung und Mikronadel Manipulation

In diesem Video werden Biomembran-Kraftsonden (BFPs) verwendet, um die Kräfte zwischen Rezeptoren und Liganden zu messen. Diese Technik kann Wechselwirkungen erkennen, indem der Druck überwacht wird, der erforderlich ist, um die Bindungen zwischen dem pMHC, das auf den Sondenkügelchen konjugiert ist, und den TCRs auf den Zielzellen aufzubrechen.

Biomembran-Kraftsonde zur Quantifizierung von Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen

Das Video demonstriert eine Methode zur Bewertung von Rezeptorkräften, die von Immunzellen mit Polyethylenglykol-verankerten Goldnanopartikeln und DNA-Haarnadel-Zugsonden angewendet werden. CD8-positive T-Zell-Wechselwirkungen lösen die Entfaltung der Sonde aus und emittieren Fluoreszenz, während Verriegelungsstränge das Signal zur Quantifizierung der von Immunzellen ausgeübten Kräfte aufrechterhalten.

Verwendung von DNA-basierten Zugsonden zur Bewertung der von Immunzellen ausgeübten Rezeptorkräfte

Wir messen die Spannung zu lösen in einem Axon, die teilweise mit einem Laser dissector durch gleichzeitige Kraft-Spektroskopie-Messung an einem optisch gefangen Sonde haftete an der Membran des Axons durchgeführt wurde lädierten. Das entwickelte Versuchsprotokoll wertet das Axon Haftung auf dem Kultursubstrat.

Messung der Spannungsstifte Während Laser Induced Axon Läsion Axonal Haftung auf dem Substrat und auswerten zu Pikonewton Millisekundenauflösung

Wir beschreiben eine Technik zur gleichzeitigen Messung der kraftregulierten Einzelrezeptor-Liganden-Bindungskinetik und Echtzeit-Bildgebung der Kalzium-Signalübertragung in einem einzelnen T-Lymphozyten.

Fluoreszenz Biomembrane Kraft Sonde: Concurrent Quantifizierung von Rezeptor-Ligand-Kinetik und Binding-induzierte intrazelluläre Signaling auf Einzelzell

Vor kurzem wurde eine Reihe von FRET-basierten Kraft-Biosensoren entwickelt, die die proteinspezifische Auflösung der intrazellulären Kraft ermöglichen. In diesem Protokoll zeigen wir, wie einer dieser Sensoren, der für den Linker des Nukleoskelett-Zytoskelett (LINC)-Komplexproteins Nesprin-2G entwickelt wurde, zur Messung von Aktomyosinkräften auf den nukleären LINC-Komplex verwendet werden kann.

Ein Protokoll für die Verwendung von Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force Biosensoren mechanische Kräfte über den Kern LINC-Komplex zu messen

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Mikropipette-Methode, um eine kontrollierte Kraft direkt in den Zellkern in einer lebenden Zelle anwenden. Dieser Test ermöglicht Verhör der nuklearen mechanischen Eigenschaften in der lebendigen, anhaftende Zelle.

Eine direkte Kraft-Sonde zur Messung der mechanischen Integration zwischen dem Kern und dem Zytoskelett

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die gleichzeitige Verwendung von Förster Resonance Energy Transfer-basierte Spannung Sensoren zur Messung der Belastung und Fluoreszenz Proteingewinnung nach Immunofluoreszenz Proteindynamik ermöglichen die Messung der Kraft-und Kleinschreibung messen Proteindynamik innerhalb von lebenden Zellen.

Messung von Kraft-und Kleinschreibung Proteindynamik in lebenden Zellen mit einer Kombination von fluoreszierenden Techniken

Integrin Spannung spielt eine wichtige Rolle in verschiedenen Zellfunktionen. Mit einem integrativen Spannung Sensor ist Integrin Spannung mit Pikonewton (pN) Empfindlichkeit kalibriert und mit Submikron Auflösung abgebildet.

Imaging-Integrin Spannung und zelluläre Kraft mit Submicron-Auflösung mit einem integrativen Spannung Sensor

Dieses definierte Protokoll beschreibt einen Echtzeit-Hochdurchsatz-Mikroskopie-Ansatz zur Visualisierung und Quantifizierung der Freisetzung von extrazellulären Traps (NET) bei humanen Neutrophilen in vitro. Die reproduzierbare Methode ermöglicht die Untersuchung der Eigenschaften und Kinetik der NET-Freisetzung nach Stimulation mit unterschiedlichen NETosis-Induktoren und ermöglicht die Beurteilung der Pharmakologie von NETosis-Antagonisten.

Echtzeit-Hochdurchsatz-Mikroskopische Quantifizierung der Freisetzung extrazellulärer Fallen bei humanen Neutrophilen und Bewertung der Pharmakologie von Antagonisten

Diese Methode misst die Neigung einer Zelle, ligandenpräsentierende immobilisierte DNA-Duplexen zu brechen, um relative zelluläre Traktionskräfte zu melden. Rupturierte fluoreszierende Oligos werden in die Zelle eingebracht und durch Durchflusszytometrie analysiert, wobei die mechanische Geschichte der Zelle aufgezeichnet wird. Dies ermöglicht die Hochdurchsatzmessung der zellulären Krafterzeugung im Rahmen der zellulären Mechanophänotypisierung.

Durchflusszytometrische Hochdurchsatzmessung des zellulären Mechanotyps auf der Grundlage einer Ruptur und Abgabe von DNA-Spannungssonden in die Zellen

Erfahren Sie die Kartierung transienter Piconewton-Kräfte durch Immunzellen mit DNA-Spannungssonden. Diese Methode ermöglicht die Speicherung kurzlebiger mechanischer Signale für die spätere Analyse mittels Fluoreszenzmikroskopie.

DNA-Spannungssonden zur Kartierung der transienten Piconewton-Rezeptor-Kräfte durch Immunzellen

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