Ernte und Disaggregation: Ein übersehener Schritt in der Erforschung von Biofilmmethoden

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren ist es, Biofilme optimal zu ernten und zu disaggregieren, um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen. In diesem Video werden drei Techniken demonstriert, die sich jeweils auf die Ernte und Disaggregation von einem anderen Oberflächentyp konzentrieren. Dieses Video zeigt die richtigen Techniken zum Vortexen und Beschallen von Biofilmen von einer harten, nicht porösen Oberfläche wie einem Polycarbonat-Coupon aus dem CDC-Biofilmreaktor.

Zweitens, das Abkratzen und Homogenisieren des Biofilms von der harten, nicht porösen Borosilikatglasoberfläche, die üblicherweise im Tropfstromreaktor zu finden ist. Und drittens das Schaben, Wirbeln und Beschallen von Biofilm von einer porösen Silikonschlauchoberfläche, die üblicherweise im Kathetermodell zu finden ist. Hallo, mein Name ist Kelly Buckingham-Meyer hier im Standardized Biofilm Methods Lab.

In unserem Labor unterteilen wir Biofilmmethoden in vier Komponenten: Wachstum, Behandlung, Probenahme und Analyse. In der Peer-Review-Literatur sind Details darüber, wie Biofilme beprobt oder geerntet und von einer Oberfläche disaggregiert werden, typischerweise spärlich. Dies ist der Grund für dieses Video.

Da unser Labor standardisierte Biofilmmethoden entwickelt und testet, haben wir eine umfangreiche Literaturrecherche durchgeführt, bei der die drei gebräuchlichsten Biofilmernte- und Disaggregationsmethoden identifiziert wurden. Diese Methoden sind das Vortexen und Beschallen von Biofilm aus einem Polycarbonat-Coupon, das Abkratzen und Homogenisieren von Biofilm aus einem Borosilikatglas-Coupon und das Kratzen, Vortexen und Beschallen von Biofilmen aus Silikonschläuchen. Während die auf Papier geschriebenen Methoden mächtig sind, hoffen wir, dass das Video mit den technischen Details, die von meiner Kollegin Lindsey Miller und mir präsentiert werden, hilfreich sein wird.

Züchten Sie zunächst reifen Biofilm Pseudomonas aeruginosa 15442 gemäß dem ASTM-Standard E2562, der Standardtestmethode zur Quantifizierung von Pseudomonas aeruginosa-Biofilm, der mit hoher Scherung und kontinuierlichem Fluss unter Verwendung des CDC-Biofilmreaktors gezüchtet wurde. Bereiten Sie am Ende der 48-stündigen Wachstumsperiode die Behandlung und Probe von Coupons gemäß dem ASTM-Standard E2871 vor, der Standardtestmethode zur Bestimmung der Wirksamkeit von Desinfektionsmitteln gegen Biofilme, die im CDC-Biofilmreaktor unter Verwendung der Einzelröhrchenmethode gezüchtet werden. Setzen Sie dann autoklavierte Spritzschutzvorrichtungen aseptisch in sterile konische 50-Milliliter-Schläuche mit flammensterilisierter Pinzette ein.

Wiederholen Sie dies für alle Tuben, die behandelt werden. Rohre für Steuercoupons benötigen keinen Spritzschutz. Entfernen Sie einen Stab aseptisch aus dem CDC-Biofilmreaktor und spülen Sie ihn in 30 Milliliter sterilem Verdünnungswasser ab.

Dadurch werden die lose gebundenen Zellen aus dem Biofilm entfernt. Halten Sie die Stange parallel zur Tischplatte über die Probenröhrchen mit Spritzschutz. Lösen Sie mit einem flammensterilisierten Inbusschlüssel die Stellschrauben, um einen biofilmbeschichteten Coupon in das Rohr fallen zu lassen.

Wiederholen Sie den Vorgang für die gewünschte Anzahl von Gutscheinen. Entfernen Sie die Spritzschutzvorrichtungen und legen Sie die Spritzschutzvorrichtungen zur Sterilisation in einen separaten Behälter. Mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette werden langsam vier Milliliter Behandlung oder Kontrolle in die Röhrchen pipettiert, so dass die Flüssigkeit die Innenseite der Rohrwand hinunterfließt.

Schwenken Sie vorsichtig den Boden des Rohres, so dass Luftblasen unter dem Gutschein verdrängt werden. Rechnen Sie mit 30 bis 60 Sekunden zwischen den einzelnen Hinzufügungen. Am Ende der angegebenen Kontaktzeit pipettieren Sie 36 Milliliter Neutralisator in die Röhrchen in der gleichen Reihenfolge, in der die Behandlung oder Kontrolle angewendet wurde.

Wirbeln Sie jede Röhre auf der höchsten Stufe für 30 plus oder minus fünf Sekunden und stellen Sie sicher, dass ein vollständiger Wirbel erreicht wird. Platzieren Sie die Rohre im Rohrgestell, das im entgasten Ultraschallgerät aufgehängt ist, so, dass der Wasserstand im Bad dem Wasserstand in den Rohren entspricht. Beschallen Sie die Proben mit 45 Kilohertz, 100% Leistung und normaler Funktion für 30 plus oder minus fünf Sekunden.

Wiederholen Sie die Wirbel- und Beschallungszyklen und beenden Sie mit einem letzten Wirbel für insgesamt fünf Zyklen. Zum Schluss verdünnen Sie die Probe seriell, zermalmen Sie die Verdünnung auf R2A-Agar und inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang bei 36 Grad Celsius. Zählen Sie die Kolonien entsprechend der Beschichtungsmethode und zeichnen Sie die Daten auf.

Diese nächste Biofilm-Ernte- und Disaggregationstechnik ist nützlich für harte, porenfreie Coupons, die der Standard im Tropfstromreaktor sind. Züchten Sie einen reifen Pseudomonas aeruginosa 15442 Biofilm gemäß dem ASTM-Standard E2647, der Standardtestmethode zur Quantifizierung von Pseudomonas aeruginosa-Biofilm, der unter Verwendung eines Tropffluss-Biofilmreaktors mit geringer Scherung und kontinuierlichem Fluss angebaut wird. Richten Sie die Probenahmestation so ein, dass sie eine Probenahmetafel, 95% Ethanol in einem Becherglas, einen Alkoholbrenner, Hämostaten, ein Coupon-Entnahmewerkzeug, Bechergläser mit sterilem Verdünnungswasser und Verdünnungsröhrchen zum Spülen der Coupons enthält.

Schalten Sie die Pumpe aus, entfernen Sie die Kanalabdeckung und verwenden Sie ein steriles Coupon-Entfernungswerkzeug und Hämostate, um den Coupon zu entfernen, wobei Sie darauf achten, den Biofilm nicht zu stören. Spülen Sie den Coupon ab, indem Sie vorsichtig mit einer flüssigen Bewegung in 45 Milliliter steriles Verdünnungswasser eintauchen, das in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen enthalten ist. Kehren Sie die Bewegung sofort um, um den Gutschein zu entfernen.

Legen Sie den Gutschein in ein Becherglas mit 45 Millilitern sterilem Verdünnungswasser. Schaben Sie die mit Biofilm überzogene Couponoberfläche mit einem sterilen Spatel oder Schaber etwa 15 Sekunden lang nach unten. Spülen Sie den Spatel oder Schaber ab, indem Sie ihn im Becherglas umrühren.

Wiederholen Sie den Schaben- und Spülvorgang drei- bis viermal, um eine vollständige Abdeckung der Couponoberfläche sicherzustellen. Spülen Sie den Gutschein ab, indem Sie ihn in einem Winkel von 60 Grad über das sterile Becherglas halten und einen Milliliter steriles Verdünnungswasser über die Oberfläche des Coupons pipettieren. Wiederholen Sie dies für insgesamt fünf Spülungen.

Das endgültige Volumen im Becherglas beträgt nun 50 Milliliter. Homogenisieren Sie in der Biosicherheitskabine die geschabte Biofilmprobe. Befestigen Sie eine sterile Homogenisatorsonde am Homogenisator.

Legen Sie die Sondenspitze in die Flüssigkeit, schalten Sie den Homogenisator ein und fahren Sie auf 20.500 U / min hoch. Homogenisieren Sie die Probe für 30 Sekunden. Drehen Sie die Drehzahl herunter und schalten Sie den Homogenisator aus.

Desinfizieren Sie die Sonde zwischen Biofilmproben, indem Sie in neun Millilitern sterilem Verdünnungsrohling bei 20, 500 U / min für 30 Sekunden wie oben beschrieben homogenisieren. Homogenisieren Sie ein Neun-Milliliter-Rohr mit 70% Ethanol für 30 Sekunden und lösen Sie die Sonde und lassen Sie sie eine Minute im Ethanolrohr stehen. Homogenisieren Sie zwei zusätzliche Verdünnungsrohlinge.

Außerdem kann für jede Probe eine sterile Einweg-Homogenisatorsonde verwendet werden. Verdünnen Sie die homogenisierte Probe seriell, plattieren Sie die Verdünnungen auf R2A mit der entsprechenden Beschichtungsmethode und inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang bei 36 Grad Celsius. Zählen Sie die Kolonien und zeichnen Sie die Daten auf.

Diese endgültige Biofilmernte- und Disaggregationstechnik ist nützlich für Biofilme, die in porösen Schläuchen wie den im Kathetermodell verwendeten Silikonschläuchen gezüchtet werden. Um dieses Verfahren zu beginnen, züchten Sie einen reifen E.coli 53498-Biofilm in Silikonkatheterschläuchen. Bereiten Sie die Probenahmematerialien vor: gespülte Röhrchen, ein steriles Zentrifugenröhrchen, eine leere sterile Petrischale, flammensterilisierte Edelstahlhämostate, eine Schere, eine Zeitschaltuhr und ein Lineal.

Wenn die Pumpe pausiert ist, verwenden Sie 70% Ethanol, um die Außenseite des Schlauches zu reinigen. Messen Sie zwei Zentimeter vom Ende aus, vermeiden Sie den am Stecker befestigten Bereich, und markieren Sie Schläuche, um die Schneidstellen zu bestimmen. Schneiden Sie mit einer schwer entflammten Schere den Schlauch auf die Zwei-Zentimeter-Markierung ab.

Spülen Sie das Schlauchsegment aus, um Planktonzellen zu entfernen. Mit flammensterilisierten Pinzetten das Schlauchsegment vorsichtig in 20 Milliliter steriles Verdünnungswasser tauchen und dann sofort entfernen. Legen Sie das Segment in 10 Milliliter Neutralisator.

Bei flammensterilisierten Pinzetten das Schlauchsegment halten und mit einem sterilen hölzernen Applikatorstab kratzen, bis alle inneren Bereiche des Schlauches abgekratzt sind. Spülen Sie den Stick gelegentlich im 10 Milliliter Neutralisator aus und legen Sie das Segment wieder in das Probenröhrchen. Das geschabte Rohrsegment ist jetzt die 10 bis zur Null oder die Nullverdünnung.

Wirbeln Sie jede Röhre auf der höchsten Stufe für 30 plus oder minus fünf Sekunden ein. Legen Sie die Rohre in das im Ultraschallbad aufgehängte Rohrgestell so auf, dass der Wasserstand im Bad dem Flüssigkeitsstand in den Rohren entspricht. Beschallen Sie mit 45 Kilohertz, 100% Leistung und normaler Funktion für 30 plus oder minus fünf Sekunden.

Wiederholen Sie diesen Wirbel- und Beschallungszyklus und beenden Sie ihn dann mit dem letzten Wirbel. Verdünnen Sie die Proben seriell in gepuffertem Wasser. Platte auf tryptic Soja-Agar mit der entsprechenden Beschichtungsmethode und dann die Röhrchen bei 36 plus oder minus zwei Grad Celsius für 24 Stunden inkubieren.

Zählen Sie die Kolonien entsprechend der verwendeten Plattierungsmethode und zeichnen Sie die Daten auf, um das arithmetische Mittel zu berechnen. Diese vier Bilder von Danielle Or und Blaine Fritz tragen alle dazu bei, die Bedeutung dieses Ernte- und Disaggregationsverfahrens zu veranschaulichen. Alle vier dieser Coupons wurden mit Kristallviolett gefärbt, um die Menge an Pseudomonas aeruginosa-Biofilm auf den Coupons vor und nach dem Wirbel- und Ultraschallprozess zu visualisieren.

Coupon A ist vollständig mit Biofilm bedeckt, während die Coupons B, C und D alle wesentlich weniger Biofilm auf ihrer Oberfläche haben. Die Coupons B, C und D wurden alle dem zuvor beschriebenen Wirbel- und Ultraschallprozess unterzogen. Diese beiden Bilder, die Lindsey Miller auf einem konfokalen Mikroskop mit 12,5-facher Vergrößerung aufgenommen hat, zeigen einen Pseudomonas aeruginosa-Biofilm, der mit dem Hintergrundlicht Live/Dead-Fleck behandelt wurde.

Das Bild auf der linken Seite wurde mit 45 Kilohertz und 10% Leistung beschallt, während das Bild auf der rechten Seite mit 45 Kilohertz und 100% Leistung beschallt wurde. Offensichtlich hat der Coupon auf der linken Seite viel mehr Biofilm auf seiner Oberfläche als der Coupon auf der rechten Seite. Diese letzte Abbildung zeigt, wie sich die Manipulation verschiedener Ultraschallparameter auf die Menge des von der Couponoberfläche entfernten Biofilms von Pseudomonas aeruginosa auswirkt.

Alle diese Coupons wurden mit 45 Kilohertz, 100% Leistung und bei normaler Einstellung für 30 plus oder minus fünf Sekunden beschallt. Diese Bilder wurden mit 12,5-facher Vergrößerung von Lindsey Miller aufgenommen. Coupons in Reihe eins wurden in Verdünnungswasser beschallt, während die Coupons in Zeile zwei in DE-neutralisierender Brühe beschallt wurden.

Es scheint, dass auf den Coupons, die in DE-Brühe beschallt wurden, die im Vergleich zum Verdünnungswasser ein Tensid enthält, weniger Biofilm übrig ist. Die Coupons A, B, E und F wurden alle in einem Volumen von 10 Millilitern beschallt, während die Coupons C, D, G und H in 40 Milliliter Lösung beschallt wurden. Auf den Kupons, die in den kleineren Bänden beschallt wurden, befindet sich deutlich weniger Biofilm.

Die Coupons A, C, E und G wurden im Bad mit drei Röhrchen gleichzeitig beschallt, während die Coupons B, D, F und H in einem Bad mit 12 Röhrchen gleichzeitig beschallt wurden. Es scheint, dass die Proben, die mit weniger Röhrchen beschallt wurden, eine überlegene Biofilmernte aufwiesen. Letztendlich scheinen die Minimierung des Volumens in den Röhren, die Verringerung der Anzahl der gleichzeitig beschallten Röhrchen und die Verwendung von DE-neutralisierender Brühe zu einer verbesserten Biofilmernte beizutragen.

Es gibt keine perfekte Methode, um den Biofilm zu ernten und zu disaggregieren, aber einige Ansätze eignen sich besser für verschiedene Oberflächen und / oder Anwendungen. Die in diesem Video gezeigten Techniken sind laut einer Literaturrecherche die drei gebräuchlichsten Methoden. Diese drei Techniken können einen Ausgangspunkt für Forscher bieten.

Es ist wichtig, sich die Zeit zu nehmen, die gewählte Ernte- und Disaggregationsmethode zu validieren. Alle Geräte sind etwas anders, so dass es selbst wenn die Methode standardisiert wurde, immer noch ratsam ist, den Prozess für die verwendete Ausrüstung zu bestätigen. Die Forschung hat gezeigt, dass falsche Entscheidungen zu verzerrten Testergebnissen führen können.

Nach dem Ansehen dieses Videos werden diese Informationen den Forschern hoffentlich helfen, fundiertere Entscheidungen darüber zu treffen, welche Methode verwendet werden soll, und Anleitungen zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit für die drei Oberflächentypen und der ergänzenden Ernte- und Disaggregationstechniken geben.