Nano-Differential-Scanning-Fluorimetrie für das Screening in der fragmentbasierten Lead-Discovery

Dieses Protokoll ist nützlich für Lead-Discovery-Kampagnen mit fragmentierter Basis als zusätzliches Werkzeug zur Auswahl vielversprechender Fragmente als Heat-Kandidaten. Nano DSO für das Fragmentscreening verwendet eine begrenzte Menge an unmarkierten Proteinproben und kann routinemäßig für fast alle Proteinziele verwendet werden. Diese Methode kann verwendet werden, um alle Sammlungen von Liganden zu screenen.

oder um Wärme von den anderen Methoden zu überprüfen. Nehmen Sie eine Fragmentplatte aus dem minus 20 oder minus 80 Grad Celsius warmen Gefrierschrank heraus und lassen Sie sie bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln auf einem Tischschüttler auftauen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 500 mal G für 30 Sekunden, um alle Tropfen zu sammeln, die an der Seite der Vertiefungen haften.

Nehmen Sie eine MRC-2-Well-Kristallisationsplatte und pipettieren Sie 15 Mikroliter der Protein-Stammlösung mit einer Mehrkanalpipette in jede Sub-Vertiefung. Um Fragment- und Proteinplattendefinitionen auf dem Mosquito zu überprüfen, schalten Sie den Nanospender ein und stellen Sie sicher, dass sich keine Hindernisse um die beweglichen Komponenten herum befinden. Öffnen Sie die grafische Benutzeroberfläche, klicken Sie auf die Registerkarte Setup und prüfen Sie unter Deck configuration, ob die Art der Platte, in die die Verbindungen geliefert werden, und diejenige, in die das Protein übertragen wird, bereits in der Liste der verfügbaren Platten vorhanden sind.

Wenn nicht, klicken Sie auf Optionen und dann auf Platten, und erstellen Sie eine neue Plattendefinition, indem Sie die richtigen Werte für den Eigenschaftentyp eingeben. Geben Sie auf der Registerkarte Setup die Plattenpositionen unter Deckkonfiguration an. Wählen Sie im Dropdown-Menü Grainier U bottom plate für Position eins und MRC 2-well plate für Position zwei und speichern Sie das Protokoll.

Platzieren Sie die Fragmentplatte an Position eins und die Proteinplatte an Position zwei des Decks. Klicken Sie auf der Registerkarte Protokoll auf Datei und wählen Sie das im vorherigen Schritt gespeicherte Protokoll zum Verteilen der Fragmente aus. Definieren Sie das Volumen der zu verteilenden Fragmente als 0,3 Mikroliter.

Definieren Sie für eine typische Platte, bei der die Spalten eins und 12 keine Fragmente enthalten, die Startposition in Spalte zwei und die Endposition in Spalte 11. Wenn in einigen Platten die Spalten zwei oder 11 leer sind, verwenden Sie die Spalten drei und 10 als Start- und Endwerte. Klicken Sie auf Ausführen, um das Programm zu starten.

Nach dem Dosieren, das etwa zwei Minuten dauert, entfernen Sie das Protein und die Fragmentplatten aus dem Roboter und versiegeln Sie sie mit einer klebenden Siegelfolie. Zentrifugieren Sie die Proteinplatte 30 Sekunden lang kurz bei 500 mal G, um jeden Tropfen zu sammeln, der an den Seiten der Vertiefungen haftet, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Untersuchen Sie die Vertiefungen der Proteinplatte visuell auf Ausfällungen, die aufgrund der Zugabe der Fragmente aufgetreten sein könnten.

Wenn in vielen Brunnen Niederschlag beobachtet wird, reduzieren Sie die Konzentration der Fragmente und wiederholen Sie das Experiment. Schalten Sie das Prometheus-Instrument ein. Drücken Sie auf dem Touchscreen die Taste Open Drawer, um auf das Kapillarlademodul des Instruments zuzugreifen.

Entfernen Sie den Magnetstreifen vom Lademodul und reinigen Sie den Spiegel mit Ethanol, um Staubpartikel zu entfernen. Um eine Lösung von der Proteinfragmentplatte in die Kapillaren zu übertragen, legen Sie die Proteinplatte und die Kapillaren neben das Instrument, um einen einfachen Zugang zum Kapillarlademodul zu erhalten. Nehmen Sie eine Kapillare, die sie an einem Ende hält, und berühren Sie die Lösung in der Proteinplatte mit dem anderen Ende der Kapillare, um die Probe zu übertragen.

Tragen Sie immer Handschuhe und achten Sie darauf, die Kapillare in der Mitte nicht zu berühren, da Verunreinigungen der Handschuhe die Messung beeinträchtigen würden. Platzieren Sie die Kapillare in der vorgesehenen Position des Halters, stellen Sie sicher, dass sie richtig ausgerichtet und zentriert ist, wiederholen Sie diese Schritte, um alle Positionen im Lademodul zu füllen. Legen Sie am Ende den Magnetstreifen auf die Kapillaren, um sie an Ort und Stelle zu halten, und drücken Sie Close Drawer, um das Nano-DSF-Experiment zu starten.

Öffnen Sie die Prometheus-Anwendung PR. ThermControl und erstellen Sie ein neues Projekt, indem Sie auf Neue Sitzung starten klicken. Führen Sie zunächst einen Entdeckungsscan durch, um die Fluoreszenz der Proben zu erkennen. Verändern Sie das fluoreszierende Signal der Proben, indem Sie die Anregungsleistung des Lasers anpassen.

Für eine thermische Denaturierung klicken Sie auf die Registerkarte Melting Scan, stellen Sie die Starttemperatur auf 20 Grad Celsius, die Endtemperatur auf 95 Grad Celsius und die Temperaturneigung auf ein Grad Celsius pro Minute ein. Klicken Sie dann auf Messung starten. Die Häufigkeitsverteilung der Verschiebungs- und Schmelztemperatur für das äußere, kinetische oder in Krebs stark exprimierte Protein, die regulatorische Tetratricopeptid-Wiederholungsdomäne der monopolaren Spindelkinase 1 und die SARS-CoV-2 3c-ähnliche Protease werden hier gezeigt.

Negative Werte zeigen eine Verringerung der Schmelztemperatur in Gegenwart eines Fragments an, während ein positiver Wert eine Erhöhung der Schmelztemperatur anzeigt. Für Nsp5 haben alle Fragmente eine destabilisierende Wirkung, während für Hec1 und Mps1 sowohl stabilisierende als auch destabilisierende Treffer beobachtet werden. Dies ist eine kostengünstige und schnelle Methode zum Überprüfen von Fragmentbibliotheken.

Andere Methoden wie NMR oder Röntgenkristallographie können die genaue Bindung von Fragmenten zeigen und sind auch durch INX-Entdeckung verfügbar. Die Ergebnisse mit der Coronavirus-Protease halfen, neue Verbindungen vorzuschlagen, die zu Medikamenten gegen COVID-19 entwickelt werden können.