Name: Profilierung der H3K4me3-Modifikation in Pflanzen mittels Spaltung unter Targets und Tagmentation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Lernen Sie die optimierte CUT&Tag-Methode zur Epigenom-Profilierung in Pflanzen. Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente Analyse von Histon-H3-Lysin-4-Trimethylierung in Baumwollblättern für die Chromatin-Forschung.

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Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430) und Fundamental Research Funds für die Central Universities, das Hainan Yazhou Bay Seed Lab (JBGS, B21HJ0403), die Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (320LH002) und das JCIC-MCP-Projekt finanziell unterstützt.

1. Transposase- und Lagerlösungen vorbereiten (Tag 1)
HINWEIS: In diesem Teil werden die Oligonukleotidadapter mit Tn5-Transposase komplexiert, um eine aktive Transposase zu erzeugen.
<ol><li>Verdünnen Sie Primer (Primer A, Primer B und Primer C) auf 100 μM-Konzentration mit dem Glühpuffer (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) (siehe Tabelle 1 für Sequenzinformationen von Primern und Tabelle 2 für die Rezepte für Arbeitslösungen). Bis zum Gebrauch bei -20 °C lagern.</li>
	<li>Richten Sie die folgenden beiden Reaktionen in PCR-Röhrchen ein: Reaktion 1 (Adapter AB), 10 μL 100 μM Primer A, 10 μL 100 μM Primer B; Reaktion 2 (Adapter AC), 10 μL 100 μM Primer A, 10 μL 100 μM Primer C.</li>
	<li>Glühen Sie die Adapter in der PCR-Maschine mit folgendem Programm: Heizdeckel (102 °C), 75 °C für 15 min, 60 °C für 10 min, 50 °C für 10 min, 40 °C für 10 min, 25 °C für 30 min. HINWEIS: Die Adapter sind teilweise doppelsträngige DNA-Moleküle (Konzentration = 50 pmol/μL).</li>
	<li>Richten Sie die folgende Reaktion in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen ein: 10 μL pA-Tn5-Transposase (500 ng/μL oder 7,5 pmol/μL), 0,75 μL Adapter-AB (50 pmol/μL), 0,75 μL Adapter-AC (50 pmol/μL), 7 μL Kopplungspuffer. 20x vorsichtig gut mischen und bei 30 °C in einem Wasserbad 1 h inkubieren. Die Endkonzentration der Transposase = 4 pmol/μL. Bis zur Verwendung bei -20 °C lagern. HINWEIS: Molverhältnis des Adapters AB: Adapter AC: Transposase = 0,5:0,5:1.</li>
	<li>Bereiten Sie die Stammlösungen gemäß den Rezepturen in Tabelle 2 vor und autoklavieren oder filtern Sie die Stammlösungen zum Sterilisieren.</li>
	<li>Autoklavieren und sterilisieren Sie Scheren, Filterpapier, ein Edelstahlsieb, einen Mörser, Stößel usw.</li>
</ol>2. Nuklei-Isolierung (Tag 2)
<ol><li>Die Zentrifuge auf 4 °C vorkühlen. Für jeweils 1 g des Ausgangsmaterials (Baumwollblätter) sind 25 ml Kernisolationspuffer A (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 20 mL Kernisolationspuffer B (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 mL Kernwaschpuffer (10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 mM Spermidin, Proteaseinhibitor-Cocktail 0,1%), 1 mL Antikörperpuffer (50 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,5 mM Spermidin, 1 mg/ml BSA, Proteaseinhibitor-Cocktail 0,1%, 0,05% mit Digitonin). Lassen Sie die Röhren bis zum Gebrauch auf Eis sitzen.</li>
	<li>Mahlen Sie frische Blätter (~ 1 g) in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver und geben Sie es in ein 50-ml-Röhrchen, das 25 ml gekühlten Kernisolationspuffer A enthält.</li>
	<li>Mischen Sie die Pufferlösung vorsichtig und inkubieren Sie das Rohr auf Eis für 5 Minuten mit sanftem Schütteln, um das Material gleichmäßig zu verteilen.</li>
	<li>Zentrifuge für 5 min bei 500 rcf bei 4 °C, um das Zellpellet zu bilden.</li>
	<li>Dekantieren Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet mit 20 ml gekühltem nuklearem Isolationspuffer B, ergänzt durch 0,5% Triton X-100. Drehen Sie das Rohr vorsichtig um, um das Pellet vollständig zu resuspendieren. HINWEIS: Der 20 ml nukleare Isolationspuffer B ist für 1 g Ausgangsmaterial anwendbar, und dieses Volumen kann entsprechend skaliert werden.<ol>
<li>Führen Sie einen Pilotassay durch, um die Wirkung der Serienkonzentration von Triton X-100 zu testen (z. B. 2 ml Kernisolationspuffer B mit jeweils 0,1%, 0,25%, 0,5% und 1% Triton X-100 für 100 mg gemahlenes Gewebe). Die geeignete Konzentration von Triton X-100 wird durch eine Ansammlung von weißen/grauen Kernen am Boden und einen dunkelgrünen Überstand nach Lyse und Zentrifugieren bei niedriger Geschwindigkeit (< 500 rcf für 4 min) angezeigt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Filtern Sie das resultierende Zelllysat mit einer Kombination aus zwei Sieben: einem 500-Mesh-Sieb auf der Oberseite, um die größeren Gewebeablagerungen zu entfernen, und einem 1000-Mesh-Sieb auf der Unterseite, um die Kerne zu sammeln. HINWEIS: Wählen Sie eine geeignete Maschenweite für die Siebe in Abhängigkeit von der Kerngröße der Pflanzen.</li>
	<li>Verwenden Sie steriles Filterpapier auf der Rückseite des Siebes, um kleinzellige Ablagerungen im Lysat zu absorbieren.</li>
	<li>Die verbleibenden lysathaltigen Kerne auf der Oberseite des 1000-Mesh-Siebes werden auf vier frische 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen übertragen.</li>
	<li>Zentrifuge für 4 min bei 300 rcf bei 4 °C, um die Kerne zu sammeln.</li>
	<li>Entfernen Sie so viel wie möglich vom Überstand mit einer Pipettenspitze und waschen Sie das Pellet mit Kernwaschpuffer.</li>
	<li>Fügen Sie 800 μL des Kernwaschpuffers hinzu und drehen Sie die Röhrchen vorsichtig um, um das Pellet wieder zu suspendieren. Drehen Sie das Rohr erneut für 4 min bei 300 rcf bei 4 °C.</li>
	<li>Führen Sie insgesamt 3 Wäschen durch.</li>
	<li>(Optional) Stellen Sie die Kerne unter einem Mikroskop für die DAPI-Färbung dar.<ol>
<li>Übertragen Sie 100 μL Kernsuspension in den Kernwaschpuffer aus Schritt 2.11. zu einer neuen 1,5 ml Röhre. 900 μL Kernwaschpuffer und 2 μL DAPI-Stammlösung (1 mg/ml) hinzufügen, um eine endgültige Arbeitskonzentration von 2 μg/ml für DAPI zu erreichen. Inkubieren Sie die Röhre im Dunkeln für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Nach dem Färben 4 min bei 300 rcf bei 4 °C zentrifugieren, um die Kerne zu sammeln.</li>
		<li>Entfernen Sie so viel wie möglich vom Überstand mit einer Pipettenspitze. 3 mal mit 800 μL des Kernwaschpuffers waschen.</li>
		<li>Entfernen Sie so viel wie möglich vom Überstand und suspendieren Sie die Kerne mit 100 μL Kernwaschpuffer.</li>
		<li>Stellen Sie die Kerne unter einem Fluoreszenzmikroskop mit dem DAPI-Kanal dar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kombinieren Sie die Kerne aus zwei Röhrchen (~ 50 μL Kernvolumen in jeder 1,5 mL Röhre). Zentrifuge für 4 min bei 300 rcf bei 4 °C. Entfernen Sie so viel wie möglich vom verbleibenden Puffer mit einer Pipettenspitze.</li>
</ol>3. Antikörper-Inkubation
<ol><li>Resuspendieren Sie jeweils 50 μL Kerne in einem 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml Antikörperpuffer.</li>
	<li>Richten Sie die folgenden Reaktionen in 1,5-ml-Röhrchen ein: zwei biologische Replikate von IgG-Kontrollgruppen mit 150 μL Kernen (~ 1 μg Chromatin) und 2 μL IgG (1 mg/ml) in jeder Röhre, zwei biologische Replikate von H3K4me3-Assay-Gruppen mit 150 μL Kernen und 2 μL Anti-H3K4me3-Antikörper (1 mg/ml) in jeder Tube.</li>
	<li>Mischen Sie die Lösung vorsichtig und lassen Sie die Röhrchen auf einem horizontalen Schüttler für die Hybridisierung über Nacht bei 4 ° C und 12 U / min.</li>
	<li>Die Zentrifuge auf 4 °C vorkühlen. Bereiten Sie frischen 50 ml Immunpräzipitations-Waschpuffer (IP) (10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 mM Spermidin, Proteaseinhibitor-Cocktail 0,1%, 0,05% mit Digitonin) in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen vor. Lassen Sie die Röhre auf Eis sitzen.</li>
	<li>Zentrieren Sie die Röhrchen für 4 min bei 300 rcf bei 4 °C. Entfernen Sie den Antikörperpuffer aus jedem Röhrchen.</li>
	<li>800 μL IP-Waschpuffer in jedes Röhrchen geben und vorsichtig mischen. Lassen Sie die Rohre 5 min bei Raumtemperatur und 12 U/min auf einem horizontalen Schüttler.</li>
	<li>Nach dem Waschen zentrifugieren Sie die Röhrchen für 4 min bei 300 rcf bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipettenspitze. HINWEIS: Um eine Störung des Kernpellets zu vermeiden, lassen Sie ~ 50-80 μL des Puffers mit den Kernen liegen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.6.-3.7. zwei weitere Male.</li>
	<li>Nach der dritten Wäsche 2 min bei 300 rcf bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den verbleibenden Puffer so weit wie möglich.</li>
</ol>4. Transposase-Inkubation
<ol><li>Machen Sie frischen 1 ml Transposase-Inkubationspuffer (10 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 mM Spermidin, Proteasehemmer-Cocktail 0,1%, 0,05% mit Digitonin), indem Sie 1 ml des IP-Waschpuffers mit 30 μL von 5 M NaCl mischen.</li>
	<li>Um die Tn5-Transposasemischung für die Inkubation vorzubereiten, fügen Sie 1 μL der Transposase zu jeweils 150 μL des Transposase-Inkubationspuffers hinzu. HINWEIS: Bereiten Sie die Transposase-Lösungsmischung zuerst entsprechend der Anzahl der Reaktionen vor und fügen Sie dann jedem Röhrchen ein Aliquot von 150 μL hinzu.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Kerne mit 150 μL Transposaselösung.</li>
	<li>Lassen Sie die Rohre bei 12 U / min für 2-3 h bei Raumtemperatur auf einem horizontalen Schüttler und mischen Sie alle 10-15 min.</li>
	<li>Nach der Transposase-Inkubation zentrifugieren Sie die Röhrchen für 4 min bei 300 rcf bei 4 °C. Entfernen Sie den Transposase-Inkubationspuffer in jedem Röhrchen.</li>
	<li>Waschen Sie die Schläuche mit IP-Waschpuffer. Dazu fügen Sie jedem Röhrchen 800 μL IP-Waschpuffer hinzu, mischen Sie vorsichtig und lassen Sie die Röhrchen bei 12 U / min für 5 min bei Raumtemperatur auf einem horizontalen Shaker.</li>
	<li>Zentrifuge für 4 min bei 300 rcf bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipettenspitze.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.6.-4.7. zwei weitere Male.</li>
	<li>Nach der dritten Wäsche 2 min bei 300 rcf bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den verbleibenden Puffer so weit wie möglich.</li>
</ol>5. Tagmentierung
<ol><li>Machen Sie 2 ml des Tagmentationspuffers (10 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 mM Spermidin, Proteaseinhibitor-Cocktail 0,1%, 10 mM MgCl2, 0,05% mit Digitonin) frisch, indem Sie 2 ml IP-Waschpuffer mit 60 μL 5 M NaCl und 20 μL 1 M MgCl2 mischen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Kerne mit 300 μL Tagmentationspuffer.</li>
	<li>Mischen Sie die Lösung und inkubieren Sie sie in einem 37 °C warmen Wasserbad für 1 h zur Tagmentation.</li>
	<li>Stoppen Sie die Tagmentation mit 10 μL 0,5 M EDTA (Endkonzentration ~15 mM) und 30 μL von 10% SDS (Endkonzentration 1%).</li>
</ol>6. DNA-Extraktion und NGS-Bibliotheksaufbau
<ol><li>Fügen Sie 300 μL CTAB-DNA-Extraktionspuffer wie beschrieben hinzu7. Die Röhrchen in einem 65 °C warmen Wasserbad für 30 min inkubieren. Invertieren, um alle ~ 10 Minuten zu mischen.</li>
	<li>600 μL Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25:24:1) in jede Tube geben. Gründlich mischen.</li>
	<li>Vorzentrifugieren Sie die Phase-Lock-Gelröhrchen für 2 min bei 13.000 rcf bei 4 °C. Übertragen Sie die obige Lösung auf Phase-Lock-Gelröhrchen.</li>
	<li>Zentrifuge für 10 min bei 13.000 rcf bei 4 °C.</li>
	<li>Übertragen Sie den Überstand (~600 μL) auf eine neue 1,5 mL Röhre.</li>
	<li>Fügen Sie 600 μL Chloroform zu jedem Röhrchen hinzu. Gründlich mischen.</li>
	<li>Zentrifuge für 10 min bei 13.000 rcf bei 4 °C.</li>
	<li>Übertragen Sie den Überstand (~600 μL) auf ein neues 1,5 ml Röhrchen.</li>
	<li>12 μL 100% Ethanol und 2 μL GlycoBlue Coprecipitant hinzufügen. Gründlich mischen und bei -20 °C für 1 h lagern.</li>
	<li>Zentrifuge für 10 min bei 13.000 rcf bei 4 °C.</li>
	<li>Dekantieren Sie den Überstand. Waschen Sie das DNA-Pellet mit 75% (v/v) Ethanol und zentrifugieren Sie für 5 min bei 13.000 rcf bei 4 °C.</li>
	<li>Dekantieren Sie den Überstand. Das DNA-Pellet an der Luft trocknen und die DNA in 25 μL ddH2O resuspendieren.</li>
	<li>Richten Sie die PCR-Reaktion wie folgt ein. Für insgesamt 50 μL Reaktion fügen Sie 24 μL DNA, 11 μL ddH2O, 10 μL 5x TAE-Puffer, 2 μL P5-Primer (10 μM), 2 μL P7-Primer (10 μM) und 1 μL TruePrep Amplify Enzym hinzu. PCR-Programm: 72 °C für 3 min, 98 °C für 30 s; dann 14 Zyklen von 98 °C für 30 s, 60 °C für 30 s und 72 °C für 30 s, gefolgt von 72 °C für 5 min. HINWEIS: Die ersten 72 °C für 3 min zur Verlängerung können nicht übersprungen werden. Eine Überamplifikation der Bibliothek wird zu einem hohen Niveau an PCR-Duplikaten im NGS führen. Beginnen Sie mit 12-14 PCR-Zyklen in der PCR-Reaktion für H3K4me3, wenn ~ 1 μg Chromatin in jeder Reaktion verwendet werden.</li>
	<li>Laden Sie 2 μL der PCR-Produkte auf 1,5% Agarosegel für die Elektrophorese.</li>
	<li>Reinigen Sie die PCR-Produkte mit kommerziellen DNA-Reinigungsmagnetkügelchen.</li>
	<li>Quantifizieren Sie die Bibliothek mit einem Fluorometer und einer Agarosegelelektrophorese. HINWEIS: Die effektive Konzentration der Bibliothek sollte >2 nM durch qPCR betragen, um eine gute Qualität zu gewährleisten.</li>
	<li>Führen Sie Next-Generation-Sequencing (NGS) und Datenanalysen durch.</li>
</ol>

<ol><li>Abascal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+ENCODE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Perspectives on ENCODE.</a> Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUT%26Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930(2019).</li>
<li>Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+chromatin+profiling+of+H3K4me3+modification+in+cotton+using+CUT%26Tag%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag.</a> Plant Methods. 16, 120(2020).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+low-cost+chromatin+profiling+with+CUT%26Tag%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).</li>
<li>Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+CUT%26Tag+profiles+histone+modifications+and+transcription+factors+in+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues.</a> Nature Biotechnology. , (2021).</li>
<li>Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+extraction+of+cotton+%28Gossypium+spp.%29+genomic+DNA+suitable+for+RFLP+or+PCR+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).</li>
<li>Haring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> Plant Methods. 3 (1), 11(2007).</li>
<li>Ouyang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+low-input+profiling+of+histone+marks+in+plants+using+nucleus+CUT%26Tag%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 634679(2021).</li>
<li>Swift, J., Coruzzi, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+matter+of+time+-+How+transient+transcription+factor+interactions+create+dynamic+gene+regulatory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Gene+Regulatory+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A matter of time - How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+a+method+for+assaying+chromatin+accessibility+genome-wide%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).</li>
</ol>

Alle Autoren haben keine Interessenkonflikte mit einem Unternehmen, das eines der oben genannten Produkte handelt.

Hier haben wir CUT & Tag beschrieben, eine Technologie zur Generierung von DNA-Bibliotheken mit hoher Auflösung und außergewöhnlich niedrigem Hintergrund unter Verwendung einer kleinen Anzahl von Zellen mit einem vereinfachten Verfahren im Vergleich zur Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP). Unser Erfolg mit der H3K4me3-Profilierung in Baumwollblättern legt nahe, dass CUT&Tag, das ursprünglich für tierische Zellen entwickelt wurde, auch für Pflanzenzellen verwendet werden kann. Sowohl das Tris-Puffersystem, das <sup class=...

Transkriptionsfaktor-bindende DNA-Stellen und offenes Chromatin, das mit Histon-Modifikationsmarkierungen assoziiert ist, spielen eine entscheidende funktionelle Rolle bei der Regulierung der Genexpression und sind die Hauptschwerpunkte der epigenetischen Forschung1. Herkömmlicherweise wurde der Chromatin-Immunpräzipitationsassay (ChIP) in Verbindung mit der Tiefensequenzierung (ChIP-seq) für die genomweite Identifizierung spezifischer Chromatin-Histon-Modifikation oder DNA-Ziele mit spezifischen Proteinen verwendet und ist im Bereich der Epigenetik weit verbreitet2. Die CUT&Tag-Technologie (Cleavage under targets and tagmentation) wurde ursprünglich vom Henikoff Lab entwickelt, um die proteinassoziierten DNA-Fragmente im gesamten Genom zu erfassen5. Im Vergleich zu ChIP kann CUT&Tag DNA-Bibliotheken mit hoher Auflösung und außergewöhnlich niedrigem Hintergrund mit einer kleinen Anzahl von Zellen mit einem vereinfachten Verfahren generieren3. Bisher wurden Methoden zur Analyse von Chromatinregionen mit spezifischen Histonmodifikationen mittels CUT&Tag in tierischen Zellen etabliert4,5. Konkret wurde Single-Cell CUT&Tag (scCUT&Tag) auch erfolgreich für menschliche Gewebe und Zellen entwickelt6. Aufgrund der Komplexität der Zellwand und der Sekundärmetaboliten ist CUT&Tag für Pflanzengewebe jedoch immer noch eine technische Herausforderung.
Zuvor berichteten wir über ein CUT&Tag-Protokoll mit intakten Kernen, die aus allotetraploiden Baumwollblättern isoliert wurden4. Um die Effizienz der Nukleisolierung und DNA-Erfassung unter Verwendung von Pflanzengewebe zu demonstrieren, wird hier das Profiling-Verfahren vorgestellt. Zu den wichtigsten Schritten gehören die Isolierung intakter Kerne, die In-situ-Inkubation mit dem Antikörper zur Chromatinmodifikation, die Transposase-Inkubation , die Adapterintegration und die DNA-Bibliotheksvorbereitung . Die Fehlersuche konzentriert sich auf die Vorbereitung der CUT&Tag-Bibliothek für die Isolierung und Qualitätskontrolle der Pflanzenkerne. 
In dieser Studie stellen wir eine verfeinerte CUT&Tag-Strategie für Pflanzen vor. Wir bieten nicht nur ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die H3K4me3-Profilierung in Baumwollblättern, sondern auch eine optimierte Methodik für die Isolierung von Pflanzenkernen, einschließlich der Strategie zur Auswahl der Reinigungsmittelkonzentration für die richtige Zelllyse und der Strategie zur Filterung der Kerne. Detaillierte Schritte mit kritischen Kommentaren sind ebenfalls in diesem aktualisierten Protokoll enthalten.

<table><tbody><tr><td>Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-H3K4me3</td><td>Millipore</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>Normales Kaninchen-IgG</td><td>Millipore</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td>Rinderserumalbumin (BSA)10 mg/ml BSA-Stammlösung <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> herstellen.<td></td><td></td><td> Bei -20° lagern; C</td></tr><tr><td>Digitonin (~50% (TLC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td>Herstellung einer 5%igen Digitonin-Stammlösung (200 mg Digitonin [~50% Reinheit] auf 2 mL DMSO). Hinweis: Mit einem 0,22-Mikron-Filter sterilisieren. Bei -20° lagern; C</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Chloroform-Ethylendiamintetraessigsäure<td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(EDTA)</td><td></td><td></td><td>0,5 M EDTA (pH = 8,5) Stammlösung herstellen. Hinweis: Für die Herstellung von 100 ml 0,5 M EDTA (pH = 8,5) werden ca. 2 g Natriumhydroxid (NaOH)-Pellets benötigt, um den pH-Wert</td></tr> einzustellen <tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/ml)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid (MgCl2)</td><td></td><td></td><td>Herstellung von 1 M MgCl2 Stammlösung</td></tr><tr><td>Proteasehemmer Cocktail</td><td>Calbiochem</td><td>539133-1SET</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td></td><td></td><td>1 M KCl-Stammlösung</td></tr><tr><td>herstellen Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1,v:v:v)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td></td><td></td><td>5 M NaCl-Stammlösung</td></tr><tr><td>Spermidin</td><td></td><td></td><td>herstellen 2 M Spermidin-Stammlösung herstellen, bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td></td><td></td><td>10%ige SDS-Stammlösung herstellen. Hinweis: Nicht autoklavieren; Sterilisieren mit einem 0,22-Mikron-Filter</td></tr><tr><td>Tris-Basis</td><td></td><td></td><td>Herstellung 1 M Tris (pH = 8,0) Stammlösung</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>Herstellung 20% Triton X-100 Stammlösung</td></tr><tr><td>Enzym</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hyperaktive pG-Tn5/pA-Tn5-Transposase für CUT& Tag</td><td>Vazyme</td><td>S602/S603</td><td>Überprüfen Sie die Antikörperaffinität des Proteins A oder Proteins G, das mit dem Tn5 fusioniert ist. Im Allgemeinen weisen die Proteine A und G eine breite Antikörperaffinität auf. Protein A hat jedoch eine relativ höhere Affinität zu Kaninchen-Antikörpern und Protein G eine relativ höhere Affinität zu Maus-Antikörpern. Wählen Sie die geeigneten Transposase-Produkte aus, die zu Ihrem Antikörper passen.</td></tr><tr><td>TruePrep Amplify Enzym</td><td>Vazyme</td><td>TD601</td><td></td></tr><tr><td>Ausrüstung</td>Zentrifuge Eppendorf 5424R PCR-Maschine <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI9700</td><td></td></tr><tr><td>Orbitalschüttler</td><td>MIULAB</td><td>HS-25</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> NanoDrop One&nbsp; Spektralphotometer Thermo Scientific <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr></tbody></table>

profilierung der h3k4me3-modifikation in pflanzen mittels spaltung unter targets und tagmentation

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

Epigenomische Regulation auf chromatischer Ebene, einschließlich DNA- und Histonmodifikationen, Verhalten von Transkriptionsfaktoren und nicht-kodierende RNAs mit ihren rekrutierten Proteinen, führen zu einer zeitlichen und räumlichen Kontrolle der Genexpression. Spaltung unter Targets und Tagmentation (CUT & Tag) ist eine Enzym-Tethering-Methode, bei der das spezifische Chromatinprotein zuerst durch seinen spezifischen Antikörper erkannt wird und dann der Antikörper ein Protein-A-Transposase-Fusionsprotein (pA-Tn5) anbindet, das das gezielte Chromatin in situ durch die Aktivierung von Magnesiumionen spaltet. Hier stellen wir unser zuvor veröffentlichtes CUT&Tag-Protokoll zur Verfügung, das intakte Kerne verwendet, die aus allortetraploiden Baumwollblättern mit Modifikation isoliert wurden. Dieses Schritt-für-Schritt-Protokoll kann für die epigenomische Forschung an Pflanzen verwendet werden. Darüber hinaus werden wesentliche Modifikationen zur Isolierung von Pflanzenkernen mit kritischen Anmerkungen versehen.

Abbildung 1 zeigt den CUT&amp;Tag-Workflow. Abbildung 2 zeigt die DAPI-Färbung der intakten Kerne. Ziel des Schrittes "Nuklei-Isolierung" war es, die intakten Kerne in ausreichender Menge für die anschließende CUT&amp;Tag-Reaktion zu erhalten. Abbildung 3 zeigt die Agarosegelelektrophorese von PCR-Produkten. Die IgG-Negativkontrolle wird parallel zum Aufbau des Experiments benötigt. Im Vergleich zur IgG-Kontrollgruppe reichte der Gr...

Cleavage under targets and tagmentation (CUT&Tag) ist eine effiziente Chromatin-Epigenom-Profiling-Strategie. Dieses Protokoll stellt eine verfeinerte CUT&Tag-Strategie für die Profilierung von Histonmodifikationen in Pflanzen dar.

Profilierung der H3K4me3-Modifikation in Pflanzen mittels Spaltung unter Targets und Tagmentation

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...

Das übergeordnete Ziel des Experiments war es, proteinassoziierte DNA-Fragmente im gesamten Genom zu identifizieren, die den Status des Chromatins widerspiegelten. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden drei Spezialoperationen durchgeführt. Zunächst wurden die intakten Kerne von Pflanzenzellen isoliert.Zweitens wurden Modifikationen des Chromatins durch einen spezifischen Antikörper in situ erkannt. Drittens spaltet der Antikörper, der ein Protein-A-Transposase-Fusionsprotein, Tn5-Transposase, bindet, das Chromatin in situ unter der Aktivierung von Magnesiumionen. Die DNA-Fragmente und Chromatinmodifikations-Bindungsstellen wurden dann mit Adaptern integriert und für die DNA-Präparation vorbereitet.Polymerase-Kettenreaktionsanreicherung verbesserte die Sequenzierung der Erzeugung. Die Regulation der Epigenomik auf chromatischer Ebene, einschließlich DNA- und Histonmodifikationen, Verhalten von Transkriptionsfaktoren und nicht-kodierenden RNAs mit ihren rekrutierten Proteinen, führt zu einer zeitlichen und räumlichen Kontrolle der Genexpression. Die von Henikoff Lab entwickelte CUT&Tag-Technologie ist eine Enzym-Tethering-Methode für die Chromatin-Epigenomik-Profilierung mit hoher Effizienz.Hier verwenden wir die Baumwollblätter als experimentelle Materialien und führen die Chromatinprofilierung am Beispiel des Antikörpers der Histon-H3-Lysin-4-Trimethylierung durch. Wir bieten ein verfeinertes Protokoll mit Video für die CUT & Tag-Leistung in Anlagen. Für jede Probenvorbereitung mit CUT&Tag wurden Gramm Baumwollblattgewebe gesammelt.Das Blatt wurde zu einem feinen Pulver mit flüssigem Stickstoff gemahlen und in ein 50 ml Falkenröhrchen mit 25 ml gekühltem Kernisolationspuffer A überführt.Die Pufferlösung wurde vorsichtig gemischt, und das Rohr wurde fünf Minuten lang mit sanftem Schütteln auf Eis inkubiert, um das Material gleichmäßig zu dispergieren. Es wurde dann bei 500 relativer Zentrifugalkraft oder rcf, bei 4 Grad Celsius, für fünf Minuten gedreht, um das Zellpellet zu bilden. Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet wurde mit 20 ml gekühltem nuklearem Isolationspuffer B resuspendiert, ergänzt durch 0,5% Triton.Das Rohr wurde sanft invertiert, um das Pellet vollständig zu resuspendieren. Das resultierende Zelllysat wurde dann mit einer Kombination von zwei Sieben filtriert, ein 500-mesh-Sieb wurde oben verwendet, um die größeren Gewebeablagerungen zu entfernen. Und ein 1000-Mesh-Sieb wurde auf der Unterseite verwendet, um die Kerne zu sammeln.Die Wahl der geeigneten Maschenweite der Siebe hängt von der Größe der Kerne der Pflanzen ab. Auf der Rückseite des Siebes wurde steriles Filterpapier verwendet, um einen Teil des Lysats und kleinzelligen Ablagerungen zu absorbieren. Das Lysat, das die Kerne enthielt, wurde in ein frisches 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt und vier Minuten lang bei 300 rcf bei 4 Grad Celsius Celsius gedreht, um die Kerne zu sammeln.Nach der Zentrifugation wurde eine Pipettenspitze verwendet, um so viel wie möglich vom Überstand zu entfernen. Eine Menge von 800 Mikrolitern, ein nuklearer Waschpuffer wurde hinzugefügt. Und die Röhre wurde sanft invertiert, um die Kerne wieder aufzuhängen.Die Röhre wurde bei 300 rcf erneut gedreht, vier Minuten lang bei 4 Grad Celsius. Nach insgesamt drei Wäschen wurden die resultierenden Kerne in einem frischen 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zusammengefügt und bei 300 rcf für vier Minuten bei 4 Grad Celsius gedreht. Eine Pipettenspitze wurde verwendet, um den verbleibenden Puffer so weit wie möglich zu entfernen.Der nächste Schritt war die Inkubation des Antikörpers. Ein Aliquot von 50 Mikrolitern Kernen wurde in 1 Milliliter Antikörperpuffer resuspendiert, ergänzt mit EDTA, BSA, Proteaseinhibitor-Cocktail in Digitonin. Ein Aliquot von 150 Mikrolitern der Kernsuspension wurde für eine Reaktion in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen gegeben, zwei Mikroliter Antikörper wurden zu jeder Tube gegeben.In diesem Assay wurden zwei biologische Replikate für die Anti-Histon-H3-Lysin-4-Trimethylierungs-Antikörper- und Immunglobulin-G-Negativkontrollgruppen nach der Zugabe von Antikörpern eingerichtet. Die Lösung wurde schonend gemischt, und die Rohre wurden auf einem horizontalen Shaker für die Hybridisierung über Nacht bei vier Grad Celsius in 12 U / min belassen. Am nächsten Morgen wurden die Röhrchen herausgenommen und die Kerne mit 800 Mikrolitern Immunfällungswaschpuffer gewaschen.Das Rohr wurde zum Mischen sanft invertiert und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 12 U / min auf dem horizontalen Schüttler belassen. Nach dem Waschen wurde das Rohr bei 300 rcf für vier Minuten bei vier Grad Celsius gedreht. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand mit einer Pipettenspitze entfernt.Dies wurde für insgesamt drei Wäschen wiederholt. Nach der dritten Wäsche wurde das Rohr zwei Minuten lang bei vier Grad Celsius mit einem 300 rcf gesponnen, und eine Pipettenspitze wurde verwendet, um den verbleibenden Puffer so weit wie möglich zu entfernen. Zur Vorbereitung der Tn5-Transposasemischung für die Inkubation.Ein Mikroliter Transposase wurde zu je 150 Mikrolitern des Transposase-Inkubationspuffers hinzugefügt. Wir empfehlen, die Transposase-Lösungsmischung zuerst entsprechend der Anzahl der Reaktionen zuzubereiten. Und dann ein Aliquot von 150 Mikrolitern zu jeder Röhre hinzufügen.Die Lösung wurde vorsichtig gemischt und zwei Stunden lang bei Raumtemperatur bei 12 U / min auf einem horizontalen Schüttler belassen. Die Röhrchen wurden alle 10 bis 15 Minuten vorsichtig gemischt. Nach der Inkubation wurden die Kerne dreimal mit 800 Mikrolitern Immunfällungswaschpuffer bei Raumtemperatur gewaschen, um die ungebundene Tn5-Transposase zu entfernen.Nach der dritten Wäsche wurde das Rohr bei 300 rcf für zwei Minuten bei vier Grad Celsius gedreht, und eine Pipettenspitze wurde verwendet, um den verbleibenden Puffer zu entfernen. Für den Tagmentationsschritt wurden 300 Mikroliter Tagmentationspuffer in das Reaktionsrohr gegeben. Die Lösung wurde gut gemischt und bei 37 Grad Celsius für eine Stunde inkubiert.Nach der Inkubation wurden 10 Mikroliter von 0,5 Mol pro Liter EDTA bei 30 Mikrolitern von 10% SDS hinzugefügt, um die Reaktion zu bestimmen. Die nächsten 300 Mikroliter DNA-Extraktionspuffer wurden hinzugefügt. Es wurde eine unregelmäßige DNA-Extraktion durchgeführt.Die DNA-Fragmente wurden in 25 Mikrolitern sterilem Wasser gelöst. 24 Mikroliter wurden für die PCR-Amplifikation im NGS-Bibliotheksbau verwendet. Diese Abbildung zeigt den intakten Kernfleck mit DAPI in der Abbildung, unter einem Mikroskop eine ausreichende Menge an intakten und relativ sauberen Kernen zu erhalten, ist der kritische Schritt für CUT & Tag.Nach der PCR wurden zwei Mikroliter übertragen und die Größe der DNA auf 1,5%Agarosegel überprüft. Diese Abbildung zeigt, dass sie mit der Immunglobulin-Gen-Negativkontrolle verglichen wird. Der Großteil der DNA-Fragmente aus der Histone H3 Lysine 4 Trimethylierungsprobe sollte zwischen 280 und 500 Basenpaaren liegen.Die DNA-Fragmente können gereinigt und dann durch Hochdurchsatz-Sequenzierung profiliert werden. Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse der Generierungssequenzierung für den Antihiston H3 Lysine 4 Trimethylierung Antikörper im Vergleich zu den Immunglobulin G Negativkontrollgruppen. Diese Technologie generiert die DNA-Bibliotheken mit hoher Auflösung und außergewöhnlich niedrigem Hintergrund unter Verwendung einer kleinen Anzahl von Zellen mit einem vereinfachten Verfahren im Vergleich zu ChIP-seq.CUT&Tag ist eine neue Methode und noch in Arbeit.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eine zuverlässige und nützlicher Ansatz zur Histon-Modifikationen auf spezifische Pflanzen-Gene erkennen beschrieben. Der Ansatz kombiniert Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) und real-time quantitative PCR. Es ermöglicht den Nachweis von Histon-Modifikationen auf bestimmte Gene mit eine Rolle in verschiedenen physiologischen Prozessen.

Erkennung von Histon-Modifikationen in Pflanzenblättern

Durch die Kombination von nativen und Vernetzungs Chromatinimmunpräzipitation mit hochauflösender Massenspektrometrie ermöglicht ChroP Ansatz, um die Verbund Proteom-Architektur der Histon-Modifikationen, Varianten und Nicht-Histon-Proteine ​​synergizing bei funktionell unterschiedlichen Chromatindomänen sezieren.

Der Ansatz kombiniert ChroP ChIP und Massenspektrometrie zu sezieren Locus-spezifische Proteomik Landschaften des Chromatin

Wir bieten hier eine effiziente und zuverlässige Protokoll für die Immunfärbung, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, DNA-Färbung, gefolgt von quantitativen und hochauflösende Bildgebung in der whole-mount Arabidopsis thaliana Samenanlagen. Diese Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um Chromatin-Modifikationen und Zellkernarchitektur zu analysieren.

Eine effiziente Methode zur quantitativen, Einzel-Zell-Analyse von Chromatin Modifikation und Reaktor Architektur in Whole-Mount-Samenanlagen in<em&gt; Arabidopsis</em

Chromatinimmunpräzipitation ist eine leistungsstarke Technik zur Identifizierung von DNA-Bindungsstellen von Arabidopsis-Proteine ​​in vivo. Dieses Verfahren besteht aus Chromatin Vernetzung und Fragmentierung, Immunopräzipitation mit selektiver Antikörper gegen das Protein von Interesse und qPCR-Analyse der gebundenen DNA. Wir beschreiben eine einfache ChIP Assay für Arabidopsis-Pflanzen optimiert.

Chromatinimmunpräzipitation Assay zur Identifizierung von Arabidopsis-Protein-DNA-Wechselwirkungen<em&gt; In-vivo-</em

Wir präsentieren Ihnen eine effektive und reproduzierbare Methode zum isolieren und Kultur neurale Vorläuferzellen aus embryonalen und postnatale Hirngewebe für Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) von Histon 3 Lysin 79 Dimethylation (H3K79me2) - eine Histon-Markierung befindet sich innerhalb der globulären Domäne des Histon 3.

Isolierung und Kultivierung von neuronalen Vorläuferzellen gefolgt von Chromatin Immunopräzipitation Histon 3 Lysin 79 Dimethylation Marke

Das Protokoll wurde entwickelt, um intakte Histone effektiv aus Sorghumblattmaterialien für die Profilierung von histonenposttranslationalen Modifikationen zu extrahieren, die als potenzielle epigenetische Marker dienen können, um die Konstruktion von dürreresistenten Kulturen zu unterstützen.

Isolierung von Histon von Sorghum Blattgewebe für Top Down Mass Spektrometrie Profilierung von potenziellen epigenetischen Markern

Hier stellen wir ein Protokoll zur Analyse der genomweiten Verteilung von Histonmodifikationen vor, das neue Zielgene in der Pathogenese von M. oryzae und anderen filamentösen Pilzen identifizieren kann.

Genomweite Analyse der Histonmodifikationsverteilung mit der Chromatin-Immunpräzipitationssequenzierungsmethode in Magnaporthe Oryzae

Ein analytischer Arbeitsablauf, der auf Flüssigkeitschromatographie, Mobilitätsspektrometrie mit gefangenen Ionen und Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) basiert, für eine hochzuverlässige und hochgradig reproduzierbare "Bottom-up"-Analyse von Histonmodifikationen und -identifizierung basierend auf Hauptparametern (Retentionszeit [RT], Kollisionsquerschnitt [CCS] und genaues Masse-zu-Ladungs-Verhältnis [m/z]).

Histonmodifikations-Screening mittels Flüssigkeitschromatographie, Ionenmobilitätsspektrometrie und Flugzeit-Massenspektrometrie

Forscher, die neu auf dem Gebiet der Epigenetik sind, werden in CUT&amp;Tag eine deutlich einfachere Alternative zu ChIP-Assays finden. CUT&amp;Tag hat die epigenetischen Studien an seltenen und primären Zellpopulationen enorm begünstigt und qualitativ hochwertige Daten von sehr wenigen Zellen generiert. Dieses Protokoll beschreibt die Durchführung von H3K4me1 CUT&amp;Tag-Assays an Mausmyoblasten, die aus den Hintergliedmaßenmuskeln der Maus isoliert wurden.

Verwendung des CUT&#38;Tag-Assays (Cleavage under Targets and Tagmentation) in der Maus-Myoblastenforschung

Dieses Protokoll ermöglicht eine effiziente Histonextraktion aus verschiedenen klinischen Proben für eine anschließende posttranslationale Modifikationsanalyse mittels LC-MS/MS. Durch die robuste Erkennung wichtiger Histonmodifikationen dient sie als wertvolles Werkzeug für umfassende epigenetische Profilierung in großen klinischen Kohorten.

Extraktion von Histonen aus klinischen Proben für epigenetische Profilierung mittels Massenspektrometrie

Diese Studie präsentiert ein räumliches Trekker–CUT&amp;Tag-Multiom-Protokoll, das direkte räumliche Barcodierung eines Gewebeschnitts mit einer Einzelzell-Multiomanalyse kombiniert. Dieser Ansatz ermöglicht räumlich aufgelöste Einzelzellprofilierung der Genexpression und der Histon-H3K27ac-Modifikation gleichzeitig und bietet mechanistische Einblicke in die Genregulation im Kontext der Gewebemikroanatomie.

räumlich aufgelöste, integrierte einzelzellige multiomische Profilierung des Transkriptoms und epigenomischen Zielen in gefrorenen Gewebeschnitten

Lernen Sie die optimierte CUT&Tag-Methode zur Epigenom-Profilierung in Pflanzen. Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente Analyse von Histon-H3-Lysin-4-Trimethylierung in Baumwollblättern für die Chromatin-Forschung.

Profilierung der H3K4me3-Modifikation in Pflanzen mittels Spaltung unter Targets und Tagmentation

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