Direkter Nachweis von Isolevuglandinen in Geweben mittels eines D11 scFv-alkalischen Phosphatase-Fusionsproteins und Immunfluoreszenz

Isolevuglandine werden mit mehreren Krankheiten, insbesondere Herz-Kreislauf-Erkrankungen, in Verbindung gebracht. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Isolevuglandine in Geweben mit dem alkalischen Phosphatase-Fusionsprotein D11 und Immunfluoreszenz nachzuweisen. Aktuelle Nachweismethoden sind teuer oder erfordern einen Sekundärantikörper für einen E-Tag.

Es ist schwierig, einen zuverlässigen Sekundärantikörper zu finden, aber dieses Protokoll eliminiert den Schritt des sekundären Antikörpers. Tauchen Sie die Objektträger von in Maus und menschlichem Paraffin eingebettetem Gewebe dreimal fünf Minuten lang in Xylol ein, um das Gewebe zu entparfizinieren. Um das Gewebe zu rehydrieren, waschen Sie das Gewebe zweimal mit 95%Ethanol, gefolgt von zwei Waschgängen mit 70%Ethanol und dann zweimal mit 50%igem Ethanol, das in Wasser zubereitet wird.

Waschen Sie die Objektträger dreimal in trisgepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween 20, indem Sie den Objektträgerhalter mit TBST füllen. Verwerfen Sie dann die TBST. Legen Sie die Objektträger in vorgeheizten Natriumcitratpuffer und inkubieren Sie sie in einem Schnellkochtopf, der auf vier Minuten bei hohem Druck eingestellt ist, um eine Gesamtzeit von 20 Minuten für die Antigengewinnung zu erhalten.

Nehmen Sie am Ende der Inkubation die Objektträger aus dem Schnellkochtopf und lassen Sie sie 20 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen. Waschen Sie die Objektträger wie gezeigt dreimal schnell mit TBST. Blockieren Sie die Objektträger, indem Sie 2 % BSA, aufgelöst in TBST, hinzufügen.

Decken Sie die Objektträger mit Paraffinklebeband ab und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie nach der Inkubation den blockierenden Puffer. Geben Sie 200 Mikroliter der in TBST hergestellten alkalischen D11-Phosphatase in die Objektträger und decken Sie die Objektträger mit Paraffinband ab.

Nachdem die Objektträger drei Stunden lang in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur inkubiert wurden, waschen Sie die Objektträger dreimal mit TBST. Entwickeln Sie die Objektträger mit einem kalorimetrischen alkalischen Phosphatase-Entwickler für die Immunhistochemie oder einem fluoreszierenden alkalischen Phosphatase-Entwickler für die Immunfluoreszenz. Waschen Sie die Objektträger einmal mit TBST, um den überschüssigen Entwickler zu entfernen und eine weitere Farbentwicklung zu verhindern.

Die Objektträger werden mit einem Mikrogramm pro Milliliter HEX-Kernfärbung gegengefärbt, die in PBS für die Immunfluoreszenz hergestellt wurde. Waschen Sie die Objektträger dann einmal mit TBST, um überschüssige Gegenflecken zu entfernen. Verwenden Sie das Eindeckmedium, um das Deckglas auf die entwickelten Objektträger zu legen.

Betrachten Sie die Objektträger unter einem Inverslichtmikroskop für die Immunhistochemie oder einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop für die Immunfluoreszenz. Vier Negativkontrollexperimente können durchgeführt werden, um die Spezifität der D11 AP-Färbung für Isolevuglandin zu bestätigen. Im ersten Negativkontrollexperiment wurde das Gewebe mit D11 AP inkubiert, das in TBST verdünnt wurde, oder TBST allein.

Inkubieren Sie dann das Gewebe mit verdünntem D11 AP und bakteriellem pariplasmatischem Extrakt, der in TBST verdünnt ist, ohne den D11 AP-Linker. Für den kompetitiven Assay werden isoLG und isoLG, die an Mausserumalbumin adduziert wurden, in einem molaren Verhältnis von acht zu eins hergestellt. D11 AP eins bis 10 in TBST verdünnen.

Anschließend wird das verdünnte D11 AP mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Isolevuglandin-adduziertem MSA oder nicht-adduziertem MSA für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. D11 AP mit Isolevuglandin MSA oder D11 AP mit nicht adduziertem MSA zur Färbung in das Gewebe geben. Verwenden Sie einen relevanten variablen Einzelkettenfragment-Antikörper D20, um das Gewebe für das endgültige Negativkontrollset zu färben.

Die Immunfluoreszenz der Aorta bei hypertensiven und normotensiven Mäusen wurde mit diesem Protokoll untersucht. Die Färbung mit D11 AP zeigte eine erhöhte Konzentration von isoLGs in der Aorta von Mäusen mit Angiotensin II-induzierter Hypertonie im Vergleich zu den Kontrollmäusen. Das D11 AP wurde verwendet, um die im Darmgewebe von Patienten mit Bluthochdruck und normotensiven Menschen vorhandenen Isolevuglandine nachzuweisen.

Das Gewebe der Patienten mit Bluthochdruck wies erhöhte Konzentrationen von Isolevuglandinen auf. Das Gewebe wurde mit pariplasmatischem Extrakt und ohne D11 AP gefärbt. Die hellere Färbung wurde in dem mit D11 AP gefärbten Gewebe im Vergleich zu dem mit pariplasmatischem Extrakt gefärbten Gewebe beobachtet, was bestätigt, dass die Färbung nicht auf die nicht konjugierte bakterielle alkalische Phosphatase zurückzuführen ist, die im pariplasmatischen Extrakt vorhanden ist. Im kompetitiven Assay zeigte das mit D11 AP gefärbte Gewebe, das mit dem isoLG-Konkurrenten vorinkubiert wurde, eine verminderte Färbung, ähnlich der Färbung, die in Geweben mit D11 AP beobachtet wurde, was eine Spezifität für D11 AP zu Isolevuglandinen zeigt.

In der Negativkontrolle führte die Färbung der Mausaorta mit D11 AP zu einer starken Färbung im Vergleich zu D20, was auf die Spezifität von D11 AP gegenüber Isolevuglandinen in der hypertensiven Aorta hinweist. Es ist wichtig, alle im Gewebe vorhandenen endogenen alkalischen Phosphatasen zu inaktivieren, um die Hintergrundfärbung zu begrenzen.