Hochdurchsatz-In-vitro-Assay mit patientenabgeleiteten Tumororganoiden

Patientenabgeleitete Tumororganoide rekapitulieren die Architektur und Funktion des Tumorgewebes genau mit besserer Reproduzierbarkeit der Krankheit. Daher kann die Reaktion eines Patienten auf Krebsmedikamente mit diesem Modell genau bewertet werden. Tumororganoide sind für ein In-vitro-Hochdurchsatz-Assay-System oder eine Zellanalyse ungeeignet, da sich in Kultur große Cluster bilden.

Mit dieser Technik wurde ein einfaches und genaueres HTS zur Bewertung von molekular zielgerichteten Medikamenten entwickelt. Da sich die Organoidkultur sehr von der 2D-Kultur unterscheidet, kann man sich zunächst verwirrt über die Kultur fühlen, aber es ist wichtig, die morphologischen Veränderungen der Organoide sorgfältig zu beobachten. Nachdem Sie das gefrorene Vile aus dem flüssigen Stickstoffspeicher entfernt haben, rühren Sie die vom Patienten abgeleiteten Tumororganoide vorsichtig in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für eine Minute.

Entfernen Sie das Abscheuliche aus dem Wasserbad und wischen Sie es mit 70% Ethanol ab. Legen Sie dann die Durchstechflasche in die Biosicherheitswerkbank. Übertragen Sie die Tumororganoide in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das das Medium für Organoide enthält.

Verwenden Sie eine Drei-Milliliter-Transferpipette, um die Tumororganoide und das Medium vorsichtig zu mischen, indem Sie fünfmal auf und ab pipettieren. Pellet entlang der Tumororganoide durch Zentrifugation. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Tumororganoidpellet in fünf Millilitern frischem Medium.

Die Tumororganoidsuspension in einen T25-Kolben geben und bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubieren. Nach einer Woche nach der ersten Passage wird die Tumororganoid-Suspension aus zwei T25-Kolben in zwei Zentrifugenröhrchen überführt und die Tumororganoide durch Zentrifugation pelletiert. Schätzen Sie das Volumen des Tumororganoidpellets und resuspenieren Sie das Pellet in 2,5 Milliliter frischem Medium pro Röhrchen.

Poolen Sie die Tumororganoid-Suspension in einem Schlauch. Die gepoolte Suspension wird in einen T75-Kolben mit 10 Millilitern frischem Medium gegeben und bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubiert. Nach 24 Stunden Mediumwechsel zerkleinern Sie die Tumororganoide mit einem Zellfragmentierungs- und Dispersionsinstrument, das mit einem Filterhalter ausgestattet ist, der einen 70-Mikrometer-Netzfilter enthält.

Verdünnen Sie 15 Milliliter Tumororganoid-Suspension 10 Mal. Verwenden Sie den Zellsuspensionsspender, um 40 Mikroliter verdünnte Tumororganoidsuspension in eine 384-Well-Sphäroid-Mikroplatte mit extrem niedrigem Aufsatz zu säen. Verwenden Sie nach 24 Stunden einen Flüssigkeitshandler, um 0,04 Mikroliter Testmittellösungen aus 10 seriellen Verdünnungen in Endkonzentrationsbereichen von 20 Mikromol bis 1,0 Nanomolar in den Vertiefungen hinzuzufügen, und inkubieren Sie die Platte sechs Tage lang.

Am Ende der Inkubation wird intrazelluläres ATP-Messreagenz in die Testtöpfe gegeben. Verwenden Sie einen Mixer, um den Inhalt der Platte zu mischen und die Platte für 10 Minuten bei etwa 25 Grad Celsius zu inkubieren. Verwenden Sie einen Plattenleser, um den intrazellulären ATP-Gehalt als Lumineszenz zu messen.

Legen Sie nach 24 Stunden der dritten Passage eine 384-Well-Ultra-Low-Attachment-Sphäroid-Mikroplatte mit 40 Mikrolitern Medium pro Well sowie eine Zielplatte auf das Zellpickel- und Bildgebungssystem. Bauen Sie die Kommissionierkammer mit sechs Millilitern Kulturmedium und zentrifugieren Sie bei 1.500 mal G für zwei Minuten, um die Luftblasen zu entfernen. Fügen Sie vier Mikroliter Tumororganoidsuspension in der Kommissionierkammer hinzu und stellen Sie die Kommissionierkammer auf das System.

Lassen Sie die Zellcluster nach der Dispersion eine Minute lang am Boden der Kammer absetzen und beginnen Sie dann mit dem Kammerscanning. Stellen Sie die Kommissioniergröße am System auf 140 bis 160 Mikrometer ein, um die Zellcluster automatisch auszuwählen. Überprüfen Sie als Nächstes die Qualität der ausgewählten Zellcluster auf den gescannten Bildern und übertragen Sie 10 Zellcluster pro Vertiefung mitHilfe von Picking-Tipps in die Zielplatte.

In der aktuellen Studie wurde die Wirkung von Antikrebsmitteln auf das vom Patienten abgeleitete Tumororganoid untersucht. Die hohe Sensitivität für alle Krebsmedikamente zeigte sich an den halbmaximalen Hemmkonzentrationswerten von weniger als zwei Mikromolaren im Bereich unter den Kurvenwerten kleiner als 282. Für eine antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizitätsbewertung wurde die prozentuale Zytolyse von Tumororganoiden in Gegenwart von zwei verschiedenen Antikörpern gemessen.

Die prozentuale Zytolyse nahm mit der Zeit zu. Ohne die Antikörper nach sechs Stunden mit dem Effektor-zu-Ziel-Zell-Verhältnis von eins zu eins erreichte die Zytolyse 45%, während im Verhältnis von zwei zu eins die Zytolyse 70% erreichte Die natürliche Killerzell-vermittelte Zytolyse mit Trastuzumab betrug etwa 60% im Verhältnis von Effektor zu Zielzelle von eins zu eins und 80% im Verhältnis von zwei zu eins nach sechs Stunden. Im Gegensatz dazu hatte Cetuximab einen dosisabhängigen Einfluss auf die natürliche Killerzell-vermittelte Zytolyse.

Bei der höchsten Konzentration von Cetuximab wurde eine Zytolyse von 90% am Effektor-zu-Zielzell-Verhältnis von eins zu eins und eine 100%ige Zytolyse im Verhältnis von zwei zu eins beobachtet, was auf eine hohe Wirksamkeit von Cetuximab hinweist. Ein Hochdurchsatz-Assay-System mit patientenabgeleiteten Tumororganoiden ist der Bewertung potenzieller Krebsmedikamente überlegen und bietet Möglichkeiten für die Arzneimittelbewertung und Fortschritte in der personalisierten Medizin.