Kapillarelektrophorese-basierter Wasserstoff/Deuterium-Austausch zur Konformationscharakterisierung von Proteinen mit Top-down-Massenspektrometrie

Diese Methode ermöglicht die Trennung von koexistierenden Proteinspezies, einschließlich verschiedener Konformer oder Varianten, und die Online-Charakterisierung ihrer Strukturunterschiede höherer Ordnung in einer einzigen CEMS-Messung. Es nutzt den elektrophoretischen Effekt, um eine Umgebung von nahezu 100% Dauer für die HDX-Reaktionen und die orthogonale Trennung der koexistierenden Proteinspezies während HDX für die Top-Down-MS-Analyse bereitzustellen. Beginnen Sie mit der Vorkonditionierung der Kapillarelektrophorese, des Wasserstoffdeuteriumaustauschs oder des CE-HDX-Setups.

Verwenden Sie Ultraschall in einer Mischung aus 50% Methanol, 49% Wasser und 1% Ameisensäure, reinigen Sie den Fluss durch die mikroflächliche CE-MS-Grenzfläche für mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur. Montieren Sie die HPC-modifizierte Kapillare auf dem Kapillarelektropherese- oder CE-Instrument. Spülen Sie die Kapillare mit Hintergrundelektrolytlösung oder BGE für 10 Minuten mit dem automatischen Probenehmer ab und lassen Sie sie mit dem BGE gefüllt.

Verwenden Sie eine angemessene Länge des unmodifizierten Kapillarschlauchs für Quarzglas als Infusionsschlauch für die Modifikatorlösung. Verwenden Sie eine Union und eine geeignete Hülse, um den Modifikatorschlauch mit einer gasdichten Glasspritze mit einer stumpfen Temperatur zu verbinden, und spülen Sie den Schlauch mit der Modifikatorlösung mindestens 10 Minuten lang mit einer Infusionspumpe ab. Setzen Sie die Auslässe der HPC-codierten CE-Kapillar- und Modifikatorschläuche, die mit den entsprechenden Lösungen beladen sind, in die gereinigte CE-MS-Schnittstelle ein.

Schieben Sie die Spritze mit den Infusionspumpen so vor, dass die Modifikatorlösung die Spitze der Grenzfläche erreicht. Montieren Sie die montierte CE-MS-Grenzfläche auf einem Nano-Elektronensprüh-Ionisationsquellengehäuse eines Massenspektrometers. Legen Sie eine Sprühspannung von 3-5 Kilovolt an die CE-MS-Schnittstelle an.

Gießen Sie die Modifikatorlösung mit der Infuser-Pumpe bei einer Durchflussrate von 0,1-10 Mikrolitern pro Minute und sorgen Sie für ein stabiles Elektrospray an der Spitze der CE-MS-Schnittstelle. Platzieren Sie die Probendurchstechflasche mit der BGE und dem automatischen Probenehmer, die später zur Erfassung von leeren Elektropherogrammen und leeren Massenspektren verwendet werden. Schätzen Sie das Injektionsvolumen anhand der Beziehung zwischen Injektionsvolumen und Injektionsparametern.

Und injizieren Sie die Probenlösung mit dem automatischen Probenehmer bei zwei PSI für eine angemessene Dauer. Beginnen Sie die CE-Trennung, indem Sie eine elektrophoretische Spannung von 20 Kilovolt in einem Infusionsdruck von 0-2 PSI anlegen und das Elektropherogramm erfassen. In der Zwischenzeit erfassen Sie die MS-Daten im chromatographischen Modus, in dem der Ionenstromgraph als Funktion der Zeit erfasst wird und die entsprechenden MS-Scans nicht automatisch zu einem einzigen Spektrum kombiniert werden.

Speichern Sie das leere Elektropherogramm und die Massenspektren als Referenzen. Legen Sie die Probenfläschchen mit den gewünschten Konzentrationen der Proteinprobenlösungen in den Autosampler und erfassen Sie die Elektropherogramme und MS1-Spektren der elektrophoretisch getrennten und deuteriummarkierten Proteinspezies. Führen Sie Tandem-Ms.-Messungen für die interessierenden Spezies durch, entweder nach der Erfassung der MS1-Spektren innerhalb desselben Laufs oder in einem nachfolgenden separaten Durchlauf.

Nach jeder Messung spülen Sie die Kapillare mit BGE bei einem Druck von 20 PSI für mindestens 10 Minuten. Reinigen Sie die CEMS-Schnittstelle und alle Schläuche zur Lagerung nach Abschluss der Experimente. Erfassen Sie einen Datensatz der HDX-Endpunktprobe mit MS im direkten Infusionsmodus.

Ein niedriger Infusionsdruck führte zu einer besseren Trennung der CE-Spitzen, führte jedoch zu einer Erhöhung sowohl der Migrationszeit als auch der Dauer des Experiments. Eine längere HDX-Reaktionszeit führte zu einem höheren Grad an Enthärtung der Proteinanalyten. Die A- und B-Varianz von Beta-Immunglobulin oder Beta-IG, die sich in ihrer Sequenz nur durch zwei Aminosäurereste unterscheiden, führte zu zwei ausreichend getrennten Peaks im EIC-abgeleiteten Elektropherogramm.

Die differentielle Deuterium-markierte Varianz führte zu einer deutlichen Massenverteilung der Ionen. Eine geringere Anzahl in der relativen Häufigkeit von Z-Ionen als C-Ionen wurde aufgrund der einzigartigen dysofiierten Verknüpfung bei der Bestätigung von Beta-IG beobachtet, die die Fragmentierungseffizienz zwischen CS 82 und CS 176 begrenzt. Die meisten Fragmentionen, die aus Beta-IGA und Beta-IGB hergestellt werden, weisen ein ähnliches Ausmaß an Deuteriumaufnahme auf.

Die größeren Segmente, die die Sequenzvariationsstellen von Beta-IGA abdeckten, waren jedoch in einem signifikant größeren Ausmaß als Beta-IGB deduziert. Der pH-Wert von BGE wird entsprechend dem isoelektrischen Punkt der Probe eingestellt, um die Proteinaggregation zu verhindern und die Trennung unter Beibehaltung des Komplexes zu erleichtern.