Name: Generierung menschlicher Gehirnorganoide für die mitochondriale Krankheitsmodellierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Erfahren Sie, wie menschliche Gehirnorganoide aus iPS-Zellen zur Modellierung mitochondrialer Erkrankungen generiert werden. Dieses skalierbare Protokoll ermöglicht die Bewertung mitochondrialer Eigenschaften ohne teure Bioreaktoren.

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Wir danken Miriam Bünning für die technische Unterstützung. Wir danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 an A.P.), Spark und dem Berlin Institute of Health (BIH) (BIH Validation Funds an A.P.), der United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant an A.P.), dem Universitätsklinikum Düsseldorf (Forschungskommission UKD an A.P.) und dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) (d: Bio Young Investigator Grant AZ 031L0211 an A.P.). Die Arbeiten im Labor von C.R.R. wurden von der DFG gefördert (FOR 2795 "Synapsen unter Stress", Ro 2327/13-1).

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<li>Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Colman, R. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+to+profile+the+bioenergetics+of+organoids+using+Seahorse%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100386(2021).</li>
<li>Menacho, C., Prigione, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+mitochondrial+diversity+in+brain+function%3A+from+animal+models+to+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemestry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids.</a> International Journal of Biochemestry & Cell Biology. 123, 105760(2020).</li>
<li>Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upgrading+the+physiological+relevance+of+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Upgrading the physiological relevance of human brain organoids.</a> Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen oder nicht-finanziellen Interessen.

Dieser Artikel beschreibt die reproduzierbare Erzeugung von humanen iPSC-abgeleiteten Gehirnorganoiden und deren Verwendung für die mitochondriale Krankheitsmodellierung. Das hier beschriebene Protokoll wurde auf der Grundlage einer zuvor veröffentlichten Arbeit modifiziert20. Ein großer Vorteil des vorliegenden Protokolls besteht darin, dass es nicht die manuelle Einbettung jedes Organoids in eine Gerüstmatrix erfordert. Tatsächlich wird die Matrixlösung einfach in das Zellkulturmedium gelöst. Da...

Mitochondriale Erkrankungen stellen die größte Klasse angeborener Stoffwechselstörungen dar1. Sie werden durch genetische Mutationen verursacht, die verschiedene mitochondriale Prozesse stören, einschließlich oxidativer Phosphorylierung (OXPHOS)2, Assemblierung der Atmungskette, mitochondrialer Dynamik und mitochondrialer DNA-Transkription oder -Replikation3. Gewebe mit Energiebedarf sind besonders von mitochondrialer Dysfunktion betroffen4. Dementsprechend entwickeln Patienten mit mitochondrialen Erkrankungen typischerweise früh einsetzende neurologische Manifestationen.
Derzeit gibt es keine Behandlungen für Kinder, die von mitochondrialen Erkrankungen betroffen sind5. Ein Haupthindernis für die Entwicklung von Medikamenten mitochondrialen Erkrankungen ist das Fehlen wirksamer Modelle, die den menschlichen Krankheitsverlauf rekapitulieren6. Einige der derzeit untersuchten Tiermodelle weisen die bei den Patienten vorhandenen neurologischen Defekte nicht auf7. Daher sind die Mechanismen, die der neuronalen Pathologie mitochondrialer Erkrankungen zugrunde liegen, noch nicht vollständig verstanden.
Neuere Studien erzeugten iPS-Zellen von Patienten, die von mitochondrialen Erkrankungen betroffen waren, und verwendeten diese Zellen, um patientenspezifische neuronale Zellen zu erhalten. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass genetische Defekte, die mit der mitochondrialen Erkrankung, dem Leigh-Syndrom, assoziiert sind, Aberrationen in der zellulären Bioenergetik8,9, der Proteinsynthese10 und der Calciumhomöostase9,11 verursachen. Diese Berichte lieferten wichtige mechanistische Hinweise auf die neuronale Beeinträchtigung bei mitochondrialen Erkrankungen und ebneten den Weg für die Wirkstoffforschung für diese unheilbaren Krankheiten12.
Zweidimensionale (2D)Kulturen erlauben jedoch keine Untersuchung der architektonischen Komplexität und regionalen Organisation von 3D-Organen13. Zu diesem Zweck kann die Verwendung von 3D-Hirnorganoiden, die aus patientenspezifischen iPS-Zellen14 abgeleitet sind, es den Forschern ermöglichen, zusätzliche wichtige Informationen zu gewinnen und so zu analysieren, wie mitochondriale Erkrankungen die Entwicklung und Funktion des Nervensystems beeinflussen15. Studien, die iPSC-abgeleitete Gehirnorganoide zur Untersuchung mitochondrialer Erkrankungen einsetzen, beginnen, die neurologischen Entwicklungskomponenten mitochondrialer Erkrankungen aufzudecken.
Rückenmarksorganoide, die Mutationen im Zusammenhang mit der mitochondrialen Erkrankung, der mitochondrialen Enzephalopathie, der Laktatazidose und dem Schlaganfall-ähnlichen Episodensyndrom (MELAS) tragen, zeigten eine fehlerhafte Neurogenese und eine verzögerte Motoneurondifferenzierung16. Kortikale Organoide, die von Patienten mit der mitochondrialen Erkrankung, dem Leigh-Syndrom, stammen, zeigten eine reduzierte Größe, Defekte in der neuronalen Epithelknospenbildung und einen Verlust der kortikalen Architektur17. Gehirnorganoide von Patienten mit Leigh-Syndrom zeigten, dass die Krankheitsdefekte auf der Ebene neuronaler Vorläuferzellen beginnen, die sich nicht an den mitochondrialen Stoffwechsel binden können, was zu einer aberranten neuronalen Verzweigung und Morphogenese führt18. So können neuronale Vorläufer ein zelluläres therapeutisches Ziel für mitochondriale Erkrankungen darstellen, und Strategien, die ihre mitochondriale Funktion fördern, können die funktionelle Entwicklung des Nervensystems unterstützen.
Die Verwendung von Gehirnorganoiden könnte helfen, die neurologischen Entwicklungskomponenten von mitochondrialen Erkrankungen aufzudecken. Mitochondriale Erkrankungen werden hauptsächlich als früh einsetzende Neurodegeneration angesehen5. Neuroentwicklungsstörungen treten jedoch auch bei Patienten auf, die von mitochondrialen Erkrankungen betroffen sind, einschließlich Entwicklungsverzögerung und kognitiver Beeinträchtigung19. Patientenspezifische Gehirnorganoide können helfen, diese Aspekte anzugehen und aufzuklären, wie mitochondriale Erkrankungen die Entwicklung des menschlichen Gehirns beeinflussen können. Mitochondriale Dysfunktion könnte auch eine pathogenetische Rolle bei anderen häufigeren neurologischen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit, der Parkinson-Krankheit und der Huntington-Krankheit4 spielen. Daher könnte die Aufklärung der Auswirkungen von mitochondrialen Defekten auf die Neuroentwicklung unter Verwendung von Gehirnorganoiden auch für die Untersuchung dieser Krankheiten von entscheidender Bedeutung sein. Dieses Papier beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung reproduzierbarer Gehirnorganoide, die für die Durchführung der Krankheitsmodellierung von mitochondrialen Erkrankungen verwendet werden können.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Affinity Designer</td><td>Serif (Europe) Ltd</td><td></td><td>Layout-Software; Vektorgrafik-Editor</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Esel Anti-Meerschweinchen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SAB4600033-250UL</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Esel Anti-Maus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-31571</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1397-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&Beta;-Tubulin III (TUJ-1)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8578</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Argon-Laser</td><td>Melles Griot</td><td></td><td>Jeder andere Laser, z.B. Diodenlaser, die 488 emittieren, ist auch in Ordnung</td></tr><tr><td>Ascorbinsäure</td><td>Sigma</td><td>A92902</td><td></td></tr><tr><td>B-27 mit Vitamin A</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>3% in PBS, Lösung bei -20 &deg lagern; C</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-0811</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>Cell Star Zellkultur 6-Well-Platte</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Chemisch definiertes Lipidkonzentrat</td><td>Gibco</td><td>11905031</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop C1</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>Modulares konfokales Mikroskop System</td></tr><tr><td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basalmembran-Matrix, Phenolrot-frei, LDEV-frei</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Matrix-Komponente</td></tr><tr><td>CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>C7026</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>31330038</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2660-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti-Ziege Cy3</td><td>Merck Millipore</td><td>AP180C</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Esel Anti-Maus Cy3</td><td>Merck Millipore</td><td>AP192C</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Esel Anti-Kaninchen Cy3</td><td>Merck Millipore</td><td>AP182C</td><td>1:300</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>DS-Q1Mc Kamera</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse 90i aufrechtes Weitfeldmikroskop</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E 600FN aufrechtes Mikroskop</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ts2 Inverses Mikroskop</td><td>Nikon Microsope Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ-C1 Silver Version 3.91</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>Bildgebungssoftware für konfokales Mikroskop</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>370-86-5</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-291</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow MEM</td><td>Gibco</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>Glaspasteur-Pipette</td><td>Marke</td><td>747715</td><td>Invertiert</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Helium-Neon-Laser</td><td>Melles Griot</td><td></td><td>Jeder andere Laser, z. B. Diodenlaser, die 594 emittieren, ist in Ordnung, auch</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Merck</td><td>H3149-25KU</td><td></td></tr><tr><td>HERACell 240i CO2 Inkubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026331</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>1:2500</td></tr><tr><td>Bild J 1.53c</td><td>Wayne Rasband National Institute of Health</td><td></td><td>Bildverarbeitungssoftware</td></tr><tr><td>Injekt Solo 10 mL/ Luer</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Ersatz</td><td>Gibco</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>Laser (407 nm)</td><td>Coherent</td><td></td><td>Jeder andere Laser, z.B. Diodenlaser, der 407 emittiert, ist auch in Ordnung</td></tr><tr><td>Map2</td><td>Synaptic Systems</td><td>Nr. 188004</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Maxisafe 2030i</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>Stemcell Technology</td><td>85850</td><td>iPSC medium</td></tr><tr><td>Multifuge X3R Zentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>10325804</td><td></td></tr><tr><td>MycoAlert Mycoplasma Detection Kit</td><td>Lonza</td><td># LT07-218</td><td></td></tr><tr><td>N2 Ergänzung</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Nadel zum einmaligen Gebrauch (23G x 1" TW)</td><td>Neoject</td><td>10016</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Aadvanced Research 3.2</td><td>Nikon</td><td></td><td>Imaging software</td></tr><tr><td>Oligomycin A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010</td><td>Heidolph</td><td>543-12310-00</td><td></td></tr><tr><td>PAP Pen</td><td>Sigma</td><td>Z377821-1EA</td><td>Zum Zeichnen von hydrophoben Barrieren auf Objektträgern.</td></tr><tr><td>Papain-Dissoziationssystem-Kit</td><td>Worthington</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Merck</td><td>818715</td><td>4% in PBS, Lösung bei -20 & Grad lagern; C</td></tr><tr><td>Pasteurpipette 7mL</td><td>VWR</td><td>612-1681</td><td>Graduiert bis zu 3 mL</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2&nbsp; &infin;/0.17 WD 1.0</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>Trockenmikroskop</td></tr><tr><td>Objektiv Plan Apo VC 60x / 1.40 Öl DIC N2 &infin;/0.17 WD 0.13</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>Öl-Tauchmikroskop Objektiv</td></tr><tr><td>Petrischale aus Polystyrol (100 mm)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664161</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit Zellsiebkappe (5 mL)</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Glas Antifade Moutant</td><td>Invitrogen</td><td>P36980</td><td></td></tr><tr><td>Qualitatives Filterpapier</td><td>VWR</td><td>516-0813</td><td></td></tr><tr><td>Gesteinshemmer</td><td>Merck</td><td>SCM075</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma</td><td>83-794</td><td></td></tr><tr><td>S100&beta;</td><td>Abcam</td><td>Ab11178</td><td>1:600</td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>13031</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellklingen</td><td>Heinz Herenz Hamburq</td><td>1110918</td><td></td></tr><tr><td>SMI312</td><td>Biolegend</td><td>837904</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Merck/Sigma</td><td>31437-1kg-M</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Roth</td><td>3957</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Dihydrogenphosphat</td><td>Applichem</td><td>131965</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>SOX2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-17320</td><td>1:100</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Zelldissoziationsreagenz</td><td>Gibco/StemPro</td><td>A1110501</td><td>Reagenz A</td></tr><tr><td>Sekundenkleber Gel</td><td>UHU</td><td>63261</td><td>Klebegel</td></tr><tr><td>SuperFrost Plus</td><td>VWR</td><td>631-0108</td><td></td></tr><tr><td>Spritze zum Einmalgebrauch (1 mL)</td><td>BD Plastipak</td><td>300015</td><td></td></tr><tr><td>TB2 Thermoblock</td><td>Biometra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC Plate 24 Well</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>TC Plate 6 Well</td><td>Sarstedt</td><td>83.392</td><td></td></tr><tr><td>TGFbeta3</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-007</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturhaube</td><td>ThermoFisher</td><td>51032711</td><td></td></tr><tr><td>TOM20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-11415</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Merck</td><td>X100-5ML</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome Microm HM 650 V</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Production beendet, jedes andere einstellbare Mikrotom ist auch in Ordnung.</td></tr><tr><td>Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade</td><td>Wilkinson Schwert</td><td>70517470</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Benchkote</td><td>Merck/Sigma</td><td>28418852</td><td></td></tr><tr><td>Wnt Antagonist I</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>3378738</td><td></td></tr><tr><td>XF 96 extrazellulärer Flussanalysator</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100737-101</td><td></td></tr><tr><td>XF Assay DMEM Medium</td><td>Seepferdchen Bioscience</td><td>103680-100</td><td></td></tr><tr><td>XF Kalibrant Lösung</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>XFe96 FluxPak (96-Well-Mikroplatte)</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr></tbody></table>

generierung menschlicher gehirnorganoide für die mitochondriale krankheitsmodellierung

Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling

Mitochondriale Erkrankungen stellen die größte Klasse angeborener Stoffwechselstörungen dar und sind derzeit unheilbar. Diese Erkrankungen verursachen neurologische Entwicklungsdefekte, deren zugrunde liegende Mechanismen noch aufgeklärt werden müssen. Ein Haupthindernis ist der Mangel an effektiven Modellen, die die früh einsetzende neuronale Beeinträchtigung der Patienten rekapitulieren. Fortschritte in der Technologie der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) ermöglichen die Erzeugung von dreidimensionalen (3D) Hirnorganoiden, mit denen die Auswirkungen von Krankheiten auf die Entwicklung und Organisation des Nervensystems untersucht werden können. Forscher, einschließlich dieser Autoren, haben kürzlich menschliche Gehirnorganoide eingeführt, um mitochondriale Störungen zu modellieren. Dieser Artikel berichtet über ein detailliertes Protokoll für die robuste Erzeugung von humanen iPSC-abgeleiteten Gehirnorganoiden und deren Verwendung in mitochondrialen bioenergetischen Profiling- und Bildgebungsanalysen. Diese Experimente werden die Verwendung von Gehirnorganoiden zur Untersuchung von Stoffwechsel- und Entwicklungsstörungen ermöglichen und können entscheidende Informationen liefern, um die neuronale Pathologie mitochondrialer Erkrankungen zu sezieren.

Das hier beschriebene Protokoll erleichtert die robuste Erzeugung von runden Organoiden (Abbildung 1A).&lt; Die erzeugten Organoide enthalten reife Neuronen, die mit Hilfe von axonspezifischen Proteinmarkern (SMI312) und Dendriten (Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 (MAP2)) sichtbar gemacht werden können (Abbildung 1B). Reife Organoide enthalten nicht nur neuronale Zellen (MAP2-positiv), sondern auch Gliazellen ...

Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für die Erzeugung von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Hirnorganoiden und deren Verwendung bei der Modellierung mitochondrialer Erkrankungen.

Generierung menschlicher Gehirnorganoide für die mitochondriale Krankheitsmodellierung

Mitochondrial diseases represent the largest class of inborn errors of metabolism and are currently incurable. These diseases cause neurodevelopmental ...

Dieses Protokoll zielt darauf ab, Gehirnorganoide zu verwenden, um mitochondriale Erkrankungen zu untersuchen. Es wurde entwickelt, um reproduzierbare Gehirnorganoide bei der Beurteilung ihrer mitochondrialen Eigenschaften zu erzeugen. Diese Methode erfordert keine teuren Bioreaktoren und zeitaufwändigen Einbettungsverfahren.Daher ist es einfach zu implementieren und zu skalieren. Dieses Protokoll ermöglicht es, reproduzierbare Hirnorganoide zu erzeugen und ihre mitochondrialen Eigenschaften zu testen. Dies kann zur Identifizierung von interventionellen Zielen für nicht behandelbare Mitochondria-Erkrankungen führen.Zunächst werden menschliche iPS-Zellen unter feederfreien Bedingungen in iPSC-Medium auf beschichteten Sechs-Well-Platten kultiviert und in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid aufbewahrt. Passage der iPS-Zellen bei 80% Konfluenz unter Verwendung von enzymfreiem Ablösungsmedium in Verhältnissen von eins zu vier bis eins zu 12. Um das Überleben der Zellen zu erhöhen, fügen Sie nach jeder Spaltung 10 mikromolare Rho-assoziierte Proteinkinase oder ROCK-Inhibitor hinzu.Dissoziieren Sie die 80% iPSCs am Tag Null. Bereiten Sie das kortikale Differenzierungsmedium eins oder CDM1 vor und erwärmen Sie es bei Raumtemperatur vor, bevor Sie es den Zellen hinzufügen. Waschen Sie die Vertiefungen, die die iPS-Zellen enthalten, mit PBS, um abgestorbene Zellen und Ablagerungen zu entfernen.500 Mikroliter vorgewärmtes Reagenz A in jede Vertiefung geben und fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, um die Zellablösung sicherzustellen. Fügen Sie einen Milliliter iPSC-Medium hinzu, um Reagenz A zu verdünnen, um seine Aktivität zu neutralisieren.Verwenden Sie eine 1.000-Mikroliter-Pipette, um die Zellen durch Auf- und Abpipen zu dissoziieren und die Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu übertragen. Zentrifugieren Sie die iPS-Zellen vorsichtig bei 125 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur und aspirieren Sie dann vorsichtig den Überstand, um das Zellpellet nicht zu stören. Resuspendieren Sie das Pellet mit einem Milliliter CDM1, um eine einzelne Zellsuspension zu erhalten und die Zellzahl zu zählen.Bereiten Sie das Aussaatmedium mit 9.000 iPS-Zellen pro 100 Mikroliter in CDM1 vor, ergänzt mit 20 mikromolaren ROCK-Inhibitoren, drei mikromolaren WNT-Catenin-Inhibitoren oder IWR-1 und fünf mikromolaren SB-431542. 100 Mikroliter Saatmedium pro Vertiefung auf eine 96-Well-V-Bodenplatte geben. Bewahren Sie die Platte in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid auf.Um Neurosphären zu erzeugen, beobachten Sie am ersten Tag, dass sich runde Zellaggregate mit definierten glatten Grenzen bilden. Beachten Sie die toten Zellen um die Aggregate. Kultivieren Sie weiter im Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.Am dritten Tag rühren Sie die Platte, indem Sie dreimal auf die Seiten klopfen, um abgestorbene Zellen zu lösen, und fügen Sie dann 100 Mikroliter CDM1 hinzu, ergänzt mit 20 mikromolaren ROCK-Inhibitoren, drei mikromolaren IWR-1 und fünf mikromolaren SB-431542 zu jeder Vertiefung. Halten Sie die Platte am Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Entfernen Sie am sechsten Tag vorsichtig 80 Mikroliter des überstehenden Mediums aus jeder Vertiefung.Vermeiden Sie es, den Boden des Brunnens zu berühren. Fügen Sie 100 Mikroliter CDM1, ergänzt mit drei mikromolaren IWR-1 und fünf mikromolaren SB-431542, zu jeder Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platte. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt alle drei Tage bis zum 18. Tag.Bereiten Sie am Tag 18, um Neurosphären zu übertragen, CDM2 vor und fügen Sie 10 Milliliter zu einer 100 Millimeter ultra niedrigen Anhaftungszellkulturplatte hinzu. Verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette mit abgeschnittener Spitze, um die runden Neurosphären von der 96-Well-Platte auf die 100-Millimeter-Zellkulturplatte mit extrem niedriger Befestigung zu übertragen. Entfernen Sie fünf Milliliter Medium von der Platte, die die Neurosphären enthält, und fügen Sie fünf Milliliter frisches CDM2 hinzu.Legen Sie die Platte auf einen Orbitalschüttler mit 70 Umdrehungen pro Minute in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Alle drei Tage das überstehende Medium vorsichtig absaugen und durch frisches CDM2 ersetzen. Lassen Sie eine kleine Menge des Mediums, um zu verhindern, dass Neurosphären austrocknen.Bereiten Sie am Tag 35 CDM3 vor. Saugen Sie das Medium von der Platte ab und fügen Sie 10 Milliliter kaltes CDM3 hinzu. Nachdem Sie das Medium gewechselt haben, legen Sie die Platte mit 70 Umdrehungen pro Minute in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid wieder auf einen Orbitalschüttler.Wechseln Sie das Medium alle drei bis fünf Tage, abhängig von der Wachstumsrate, die durch die Farbe des Mediums angezeigt wird. Bereiten Sie am Tag 70 CDM4 vor. Verwenden Sie CDM4 Medium, bis das gewünschte Alter der Organoide erreicht ist.Während dieser Zeit halten Sie die Platte auf einem Orbitalschüttler, der bei 70 Umdrehungen pro Minute in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid eingestellt ist. Wechseln Sie das Medium je nach Wachstumsrate alle drei bis fünf Tage. Bereiten Sie 4% PFA-Lösung vor und legen Sie sie unter eine Sicherheitshaube.Sammeln Sie Gehirnorganoide und übertragen Sie sie vorsichtig mit einer stumpfen Pasteur-Pipette aus drei Millilitern Kunststoff auf eine mit PFA gefüllte Sechs-Well-Platte. Bewahren Sie die Organoide in der PFA-Lösung eine Stunde bei Raumtemperatur auf. Entfernen Sie die PFA vorsichtig mit einer drei Milliliter kunststoffhaltigen Pasteurpipette und waschen Sie die festen Organoide dreimal mit PBS.Lagern Sie die festen Organoide bei vier Grad Celsius in PBS bis zur weiteren Verwendung. Die mit diesem Protokoll erzeugten Organoide enthalten reife Neuronen, die mit Proteinmarkern, die für Axone und Dendriten spezifisch sind, visualisiert werden können. Reife Organoide enthalten nicht nur neuronale Zellen, sondern auch Gliazellen.Mit Hilfe der Sliced-Brain-Organoid-Analyse ist es möglich, SMI 312-positive Axone und MAP2-positive Dendriten oder die S100-Beta-Gliazellen zu überwachen. Darüber hinaus helfen konfokale Bilder, die detaillierte Verteilung und Organisation von SOX2-positiven neuronalen Vorläufern in Bezug auf Beta-3-Tubulin-positive Neuronen zu untersuchen. Gehirnorganoide wurden für mitochondrienspezifische Marker wie Translokase der äußeren Membran oder TOM20 gefärbt.Die bioenergetische Profilierung von Hirnorganoiden wurde durchgeführt, indem sowohl der mitochondriale Metabolismus unter Verwendung der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) als auch der glykolytische Metabolismus unter Verwendung der extrazellulären Säuerungsrate (ECAR) gemessen wurden. Oligomycin verursacht einen Abfall des OCR-Profils und identifiziert daher die OCR, die für die ATP-Produktion benötigt wird. Bei der Oligomycin-Behandlung kann es auch zu einem kompensatorischen Anstieg des ECAR kommen, was darauf hindeutet, dass die Zellen die Glykolyse hochregulieren können, um den metabolischen Stress zu verhindern.Bei der Übertragung der Neurosphären von der 96-Well-Platte auf eine Kulturplatte oder während des Fixiervorgangs ist es wichtig, die Organoide sanft zu behandeln, um sie nicht zu beschädigen. Nach der Erzeugung von Hirnorganoiden wären Multi-Elektroden-Array oder Calcium-Imaging ideale Methoden, um die Funktionalität der Organoide zu testen.

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