Untersuchung struktureller und dynamischer Eigenschaften des Handels subzellulärer Nanostrukturen durch raumzeitliche Fluktuationsspektroskopie

Die Imaging the Right Mean Square Displacement Method ist in der Lage, gleichzeitig sowohl die Struktur als auch die dynamischen Durchschnittseigenschaften eines biologischen Zielobjekts in einer lebenden Probe zu extrahieren. Die Abbildung der Right Mean Square Displacement ist ein schnelles und robustes Verfahren, bei dem keine einzelnen Objekttrajektorien extrahiert werden müssen und keine komplexe Beschriftung erforderlich ist. Es erfordert nur einen optischen Standardaufbau und ein fluoreszierend markiertes Objekt von Interesse.

Die Methode ebnet den Weg für das großflächige, quantitative Screening der strukturellen und dynamischen Veränderungen, die auf der Ebene subzellulärer Nanostrukturen bei verschiedenen pathologischen Zuständen wie Krebs, Diabetes oder neurodegenerativen Erkrankungen gefunden werden. Das Verfahren wird Fabio Azzarello, ein Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Um mit der Subkultierung der Zellen zu beginnen, beginnen Sie mit dem Waschen einer 10 Zentimeter großen, mit Gewebekultur behandelten Schale aus konfluenten Hela-Zellen, zweimal, mit 0,01 molaren PBS.

Dann fügen Sie 1 Milliliter 0,05% Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie das Gericht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für fünf Minuten. Suspendieren Sie die abgelösten Zellen in 9 Milliliter vollständigem DMEM-Medium und sammeln Sie 10 Milliliter Gesamtmedium mit Trypsin im Zentrifugenröhrchen. Samen Sie ungefähr 0,2 Millionen Zellen in jeder 35 Millimeter mal 10 Millimeter großen Schale mit dem endgültigen mittleren Volumen von 1 Milliliter und inkubieren Sie dann die Zellen.

Abhängig von der interessierenden subzellulären Struktur ist eine spezifische Markierungsmethode erforderlich, und sobald die Markierungslösung fertig ist, waschen Sie die Zellen zweimal mit 0,01 molaren PBS. Nachdem Sie PBS durch das farbstoffhaltige Medium ersetzt haben, brüten Sie die Schale gemäß der Empfehlung des Herstellers bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid aus. Waschen Sie die Zellen am Ende der Inkubation vor dem Experiment zweimal mit einem frischen Medium.

Bevor Sie die Zeitraffer-Serienerfassung durchführen, schalten Sie das Steuerungssystem des Mikroskopinkubators ein und lassen Sie das Mikroskop etwa zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid ausgleichen. Verwenden Sie einen 488-Nanometer-Argonlaser zur Anregung von EGFP in transfizierten Zellen und fluoreszenzmarkierten Macropinesomen und sammeln Sie die Fluoreszenzemission zwischen 500 und 600 Nanometern mit einem Standard-Photomultiplikatorröhrendetektor. Verwenden Sie einen 543-Nanometer-Helium-Neon-Laser, um den Fluoreszenzfarbstoff anzuregen, und sammeln Sie die Emission zwischen 555 und 655 Nanometern.

Stellen Sie den Durchmesser des Detektionslochs auf die Größe eines Eri ein. Und sammeln Sie für jede Akquisition eine Reihe von 1000 aufeinanderfolgenden Frames. Stellen Sie die Verweilzeit des Pixels auf 2 Mikrosekunden pro Pixel für eine Framezeit von 129 Millisekunden ein.

Um die instrumentellen Parameter für die Akquisitionen ordnungsgemäß zu initialisieren, öffnen Sie iMSD. M mit dem Software-Texteditor. Legen Sie die Parameter fest, indem Sie Werte für N'as die Anzahl der Bilder in der Zeitreihe, die Pixelgröße in Mikrometern und f'as die zeitliche Auflösung in Sekunden eingeben.

Setzen Sie außerdem die Eingabe der Filterhintergrundkorrektur auf Null, um Rohbilder zu verarbeiten, oder eins, um eine schwellenwertbasierte Hintergrundsubtraktion durchzuführen. Legen Sie als Nächstes den AV-Mautschwellenwert für die Hintergrundkorrektur fest. Wenn der Filterwert auf eins festgelegt ist, werden Pixel mit einer Intensität unterhalb des Schwellenwerts auf Null festgelegt.

Als nächstes legen Sie bit als ganzzahlige Zahl fest, die die Intensitätsstichprobe bestimmt. Speichern Sie den bearbeiteten iMSD, und führen Sie ihn aus. M-Skriptdatei.

Überprüfen Sie die Skriptausführung im Befehlsfenster, und wenn Probleme auftreten, wird die unterbrochene Warnmeldung angezeigt. Importieren Sie nach erfolgreicher Skriptausführung den Bildstapel und subtrahieren Sie bei Bedarf den Hintergrund. Berechnen Sie dann die spacio-temporale Korrelationsfunktion mit der Fourier-Methode.

Passen Sie die räumlich-zeitliche Korrelationsfunktion an eine Gaußsche 2D-Funktion an. Überprüfen Sie als Nächstes die grafische Ausgabe mit der IMSD-Kurve und den entsprechenden Formstückkurven, die in drei separaten Feldern für verschiedene Typen der verwendeten Formformungsgleichung angezeigt werden. Die R-Quadrat-Werte werden in der Diagrammlegende bereitgestellt.

Überprüfen Sie dann die Textausgabe. Die Bildaufnahme von Lysosom als Testorganelle wurde in lebenden Zellen mit der entsprechenden zeitlichen Auflösung und sehr niedriger zeitlicher Auflösung durchgeführt. Die artefaktische Verformung des Lysosoms aufgrund der Organellenbewegung war im Bild mit niedriger Auflösung sichtbar.

Das Intensitätsprofil des Spots wurde mit einem Linienwerkzeug in der Bildanalysesoftware abgeleitet. Dann wurde die Spotdurchmesserschätzung durchgeführt, indem die Intensität durch eine Gaußsche Funktion aufgetragen und interpoliert wurde. Die Erfassung mit hoher Geschwindigkeit ergab eine vergleichbare durchschnittliche Strukturgröße nahe der festen Probe.

Stattdessen erhöhte die Erfassung mit einer langsamen Geschwindigkeit die Strukturgröße, aufgrund der natürlichen Strukturdynamik während der Bildgebung. Die strukturellen und dynamischen Eigenschaften von Macropinesomen wurden während des Handels beobachtet. Die Beobachtungen zeigten eine Abnahme der durchschnittlichen Größe der Macropinosomen.

Die gleichzeitige Zunahme der subdiffusiven Bewegung wurde durch erniedrigte Alpha-Werte gekennzeichnet. Für jede Akquisition wurde die Zunahme der Anzahl der Macropinesomen mit der Zeit beobachtet. Im Gegensatz dazu deuteten ähnliche Messungen, die an ISGs durchgeführt wurden, auf ein sehr anderes Verhalten dieser letzteren Organellen im Vergleich zu Macropinesomen hin.

Tatsächlich zeigen Insulingranulate unveränderte, durchschnittliche strukturelle oder dynamische Eigenschaften, was darauf hindeutet, dass sie in einem stationären Zustand untersucht wurden. Die Methode kann leicht im Dual-Color-Modus angewendet werden, wenn zwei verschiedene subzelluläre Organellen unterschiedlich gekennzeichnet sind. In diesem Fall hebt die Kreuzkorrelationsanalyse mögliche dynamische Wechselwirkungen der beiden Objekte innerhalb der Zelle hervor.