Name: Flüssigkeitschromatographie gekoppelt an Brechungsindex oder massenspektrometrische Detektion zur Metabolitenprofilierung in lysatbasierten zellfreien Systemen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 42 s
Description: Erfahren Sie, wie Flüssigkeitschromatographie mit Brechungsindex- und massenspektrometrischer Detektion zur Metabolitenprofilierung in lysatbasierten zellfreien Systemen eingesetzt wird. Diese Methode ermöglicht die quantitative Analyse von Metaboliten, einschließlich solcher in niedrigen Konzentrationen.

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Diese Forschung wurde vom Genomic Science Program, U.S. Department of Energy, Office of Science, Biological and Environmental Research, als Teil der Plant Microbe Interfaces Scientific Focus Area (http://pmi.ornl.gov) gesponsert. Das Oak Ridge National Laboratory wird von UT-Battelle, LLC, für das US-Energieministerium im Auftrag DE-AC05-00OR22725 verwaltet. Dieses Manuskript wurde von UT-Battelle, LLC unter Vertrag DE-AC05- 00OR22725 mit dem US-Energieministerium verfasst. Die Regierung der Vereinigten Staaten behält und der Herausgeber erkennt durch die Annahme des Artikels zur Veröffentlichung an, dass die Regierung der Vereinigten Staaten eine nicht ausschließliche, bezahlte, unwiderrufliche, weltweite Lizenz zur Veröffentlichung oder Vervielfältigung der veröffentlichten Form dieses Manuskripts behält oder anderen gestattet, dies für Zwecke der Regierung der Vereinigten Staaten zu tun. Das Energieministerium wird der Öffentlichkeit Zugang zu diesen Ergebnissen der vom Bund geförderten Forschung in Übereinstimmung mit dem DOE Public Access Plan (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan) gewähren.

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Die Autoren erklären, dass ihnen keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte bekannt sind.

Der skizzierte HPLC-RID-Ansatz kann verwendet werden, um den Zuckersubstratverbrauch und die anschließende Umwandlung in wichtige organische Säure- und Alkoholprodukte des zentralen Lysatstoffwechsels im Laufe der Zeit erfolgreich zu quantifizieren. Darüber hinaus verwendet dieses Protokoll eine einfache isokratische Methode mit einer einzigen mobilen Phase, erfordert eine minimale Probenvorbereitung und ermöglicht eine einfache gezielte nachgelagerte Analyse. Analyten, die mit der HPLC-RID-Methode gemessen werden, unterscheiden sich ausschließlich durch ihre Retentionszeiten und damit ihre Wechselwirkungen mit dem ausgewählten Säulenharz. Die hier verwendete HPLC-Säule wurde speziell entwickelt, um Kohlenhydrate, organische Säuren und Alkohole durch Kombination von Größenausschluss und Ligandenaustausch (d. H. Ionenmoderierte Partitionschromatographie) zu trennen. Die beschriebene Methode ist daher nützlich für eine gezieltere Analyse von Kohlenhydratsubstraten und ausgewählten Endprodukten von Glukosefermentationswegen, von denen erwartet wird, dass sie in erster Linie lysatbasierte Biotransformationen erleichtern und energetisieren8,15,21. Dieses Protokoll berücksichtigt jedoch nicht die Aktivierung anderer Stoffwechselwege in Zellextrakten. Pipelines, die andere chromatographische Trenntechniken (z. B. hydrophile Interaktionschromatographie), Gradientenelutionsmethoden, kompliziertere Probenvorbereitung (d. h. Derivatisierung) und verschiedene optische Detektoren (z. B. ultraviolettes Licht oder Verdunstungslichtstreudetektoren) verwenden, könnten verwendet werden, um andere Metaboliten wie Aminosäuren und Zuckerphosphate nachzuweisen23,24 . Alternativ kann ein globaler Ansatz zur Untersuchung des Lysatstoffwechsels mit LC-MS / MS verfolgt werden.
Die beschriebene LC-MS/MS-Methode ist ein einziger Workflow zur Messung und Identifizierung eines breiteren Spektrums von Metaboliten. LC-MS/MS ist ein hochmodernes Analysewerkzeug für die Metabolomprofilierung aufgrund seiner Empfindlichkeit und Fähigkeit, Metaboliten durch Retentionszeit und m/z-Verhältnisse mit hoher Auflösung zu unterscheiden16. Mit einem Fokus auf zentrale Kohlenstoffstoffwechselwege und Aminosäureanabolismus wurde der negative Modus MS / MS implementiert, um polare organische Säuren, Zuckerphosphate und Aminosäuren spezifisch nachzuweisen. In Verbindung mit einer Nano-Flüssigkeitschromatographie-Technik bietet die Methode eine hohe Empfindlichkeit für den Nachweis kleiner Moleküle im komplexen Lysathintergrund17. In Bezug auf die Profilierung des lysatbasierten CFME-Stoffwechsels ist eine Einschränkung des beschriebenen LC-MS/MS-Protokolls jedoch seine untere Nachweisgrenze von 50 m/z, die die Messung von Ethanol, einem Hauptprodukt im Lysatglukosestoffwechsel, sowie von Formiaten, die beide ansonsten leicht durch die detaillierte HPLC-RID-Methode quantifiziert werden können, ausschließt. Im Vergleich zu LC-MS/MS hat HPLC-RID den zusätzlichen Vorteil der relativen Zugänglichkeit in Bezug auf Kosten und Schwierigkeitsgrad. Bis zum letzten Punkt kann die Fehlerbehebung bei der hier beschriebenen LC-MS/MS-Methode ein gewisses Maß an Fachwissen in der Massenspektrometrie erfordern. Nichtsdestotrotz hat der MS-Nachweis einzigartig attraktive Anwendungen über RID, da er zusätzlich markierte Isotope in Metabolomen unterscheiden kann, eine ausgezeichnete Technik zum Verständnis der Kohlenstoffbewegung von ergänzten Substraten durch das komplexe Lysat-Stoffwechselnetzwerk18. Ein solcher Ansatz wurde hier angewendet, indem Reaktionen mit 13C6-Glucoseergänzt und die relativen Abundanzwerte von nachgeschalteten 13C-integrierenden Metaboliten analysiert wurden. Die Analyse ermöglichte die Definition von aktiven und inaktiven Signalwegen, unterstützte zuvor berichtete Annahmen und lieferte neue Erkenntnisse über den metabolischen Fluss in Lysaten. Modifikationen können auch innerhalb der Methode für spezifische Analysen vorgenommen werden. Beispielsweise können Standardlösungen von 13C-markierten Zielverbindungen zusammen mit Proben analysiert werden, um absolute quantitative Messungen von Glukosemolekülen im Laufe der Zeit zu erreichen und Rückschlüsse auf Flussverteilungen zu ziehen. Eine bessere Erkennung von positiv geladenen Verbindungen kann auch innerhalb des aktuellen Workflows ermöglicht werden, indem Sequenzen mit .meth-Dateien ausgeführt werden, die für die Erkennung des positiven Modus angepasst sind.
Die analytische Probenahme in beiden beschriebenen Methoden ist komfortabel automatisiert, was eine hohe Reproduzierbarkeit gewährleistet. Darüber hinaus können reibungslose Analyseläufe erwartet werden, solange die ordnungsgemäße Handhabung und Wartung der Instrumente eingehalten wird. Bei der Verwendung dieser Werkzeuge zur Analyse von CFME-Reaktionen sollten kritischere Überlegungen vor und nach der Probenahme angestellt werden. Bei der Probenvorbereitung ist es wichtig, dass Zeitverlaufskontrollen repräsentativ für Zeit-Null sind. Hier wurden Proteine in Lysaten durch Übersäuerung gefällt, um Stoffwechselreaktionen zu stoppen. Für Zeit-Null-Proben wurde das saure Lösungsmittel mit Lysat kombiniert, bevor das glukosehaltige Reaktionsgemisch hinzugefügt wurde. Die Ansäuerung mit Trichloressigsäure stellte effektiv sicher, dass Glukose nicht zum Zeitpunkt Null metabolisiert wird, wie in den HPLC-RID-Daten gezeigt (Abbildung 2). Während in der berichteten LC-MS/MS-Analyse ein ähnliches Verfahren zum Abschrecken des Glukosestoffwechsels durchgeführt wurde, wurden 13C-markierte Metaboliten in Zeit-Null-Proben nachgewiesen, wenn auch mit signifikant niedrigen Abundanzwerten im Vergleich zu Proben, die zu späteren Zeitpunkten extrahiert wurden. Darüber hinaus beschränkten sich diese Beobachtungen auf Zwischenprodukte der Glykolyse. Die Daten deuten darauf hin, dass die Reaktionen nach der Übersäuerung mit dem Extraktionslösungsmittel, das mit dieser hochempfindlichen Methode nachgewiesen wird, ein gewisses Maß an glykolytischer Aktivität beibehalten. Das Ausmaß dieser Aktivität sollte jedoch quantifiziert werden. Eine frühere Studie berichtete, dass saure Extraktionslösungsmittel möglicherweise nicht ausreichend glykolytische Zwischenreaktionen abschrecken, aber einen signifikanten Glukoseverbrauch stoppen können10. Während dies in dem hier verwendeten System noch weiter untersucht werden muss, können drastische Veränderungen der relativen Abundanzwerte zwischen Zeit-Null- und späteren Zeitpunktproben als Trends im Glukosestoffwechsel interpretiert werden. Die Erforschung alternativer Abschreckmethoden wird jedoch in ähnlichen Anwendungen empfohlen, insbesondere zur Gewinnung absoluter Mengen an metabolischen Zwischenprodukten10. Darüber hinaus sollten auch bei nachgelagerten Softwareanalysen bewährte Verfahren beachtet werden. Konsistenz ist unerlässlich, wenn Spitzenbereiche manuell aus RID-Signalen integriert werden, um menschliche Fehler zu reduzieren. Die manuelle Integration sollte auch auf Spitzenbereiche von Standards angewendet werden, wenn manuell integrierte Spitzenbereiche zur Quantifizierung der Metabolitenkonzentrationen in Proben verwendet werden. Während der gesamten gezielten LC-MS/MS-Analyse sollten vorläufige Anmerkungen aus der MZmine-Analyse durch manuelle Peak-Checking mit einem MS-Qualitätsbrowser validiert werden, und m/z-Features sollten nur dann mit Anmerkungen versehen werden, wenn berechnete Massenfehler akzeptabel sind. Hier wurden diese Analysen manuell für einen begrenzten Satz von Zielen durchgeführt, da eine umfassende und robuste Software für die Isotopensuche noch nicht etabliert ist. Solche automatisierten Methoden zur Suche nach 13C-markierten Metaboliten sind jedoch derzeit im Entstehen und würden auch kompliziertere Analysen rationalisieren, wie z.B. die Profilierung von Lysaten jenseits des zentralen Kohlenstoffstoffwechsels25.
Die fortschrittliche Flüssigkeitschromatographie ist eine robuste und weit verbreitete Methode zur Trennung kleiner Moleküle in komplexen Stoffwechselmischungen11. Die beschriebenen Methoden koppeln diese Trenntechnik mit dem Brechungsindex oder dem massenspektrometrischen Nachweis, um Metabolitenumwandlungen in lysatbasierten CFME-Reaktionen erfolgreich zu analysieren. HPLC-RID und LC-MS/ MS sind individuell leistungsfähige Werkzeuge zur Profilierung des aktiven Lysatstoffwechsels, und ihre Komplementarität kann weiter genutzt werden, um die inhärenten Einschränkungen jeder Technik anzugehen. Die berichteten Methoden ermöglichen die Anwendung und Entwicklung von CFME, da sie verwendet werden können, um den Lysatstoffwechsel zu verstehen, Verbesserungen bei gezielten Metabolitenumwandlungen zu überwachen und Veränderungen des Metabolitenflusses bei der Manipulation des Lysatstoffwechsels aufzuklären.

Einschränkungen bei der Entwicklung von Mikroben für die chemische Produktion können durch die Rekapitulation biochemischer Reaktionen in vitro behoben werden, bei denen konkurrierende zelluläre Überlebensfunktionen fehlen1. Darüber hinaus ist die offene Reaktionsumgebung (d.h. das Fehlen einer Zellmembran) besser manipulationsfähig und im Vergleich zu lebenden Zellen leichter zu überwachen. Dieses grundlegende Konzept des zellfreien Metabolic Engineering (CFME) wurde elegant durch die Rekonstitution von Stoffwechselwegen demonstriert, um wertvolle Chemikalien wie Wasserstoff und Monoterpene mit Produktionsmetriken zu synthetisieren, die um Größenordnungen höher sind als bisher in mikrobiellen Zellfabriken1,2,3 . Methoden zur Reinigung ganzer Pfade sind jedoch derzeit zeit- und kostenbehaftet. Alternativ können zellfreie Stoffwechselsysteme aus rohen Zellextrakten durch schnelle und kostengünstige Methoden in Bezug auf die Rekonstitution des gesamten Signalwegs abgeleitet werden4. Der zentrale Stoffwechsel, der in Zellextrakten zurückgehalten wird, kann mit Energiesubstraten (z. B. Glukose und enzymatische Cofaktoren) und Salzen in gepufferten Lösungen ergänzt werden, um zentrale Stoffwechselvorstufen für über 24 h5,6zu erzeugen. Die Zugabe von exogenen Enzymen zur lysatbasierten CFME-Reaktion ermöglicht komplexere Biotransformationen von Glukose in wertvollere Chemikalien bei hohen Titern4,6,7. Obwohl die Ausbeute in diesen Systemen aufgrund ihrer zellähnlichen metabolischen Komplexität tendenziell beeinträchtigt ist, wurden und werden einzigartige Methoden zur Kuratproteome für eine höhere Ertragsumwandlung entwickelt7,8.
Die einfache Durchführung metabolischer Transformationen in lysatbasierten zellfreien Systemen macht diese hervorragenden Plattformen für die Verlagerung der chemischen Herstellung außerhalb der Zelle oder für das Prototyping neuer Wege mit hohem Durchsatz, bevor diese Designs in vivo2,9erstellt und getestet werden. Für beide Anwendungen sind Werkzeuge zur Überwachung metabolischer Umwandlungen oder zur Beobachtung von Allgemeinen Veränderungen des metabolischen Flusses in Lysaten ein wesentlicher Bestandteil der Weiterentwicklung von CFME. Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) kann zur hochauflösenden Trennung der chemischen Bestandteile von CFME-Reaktionen eingesetzt und zur Metabolitenquantifizierung an optische oder massenspektrometrische Detektoren gekoppelt werden5,10. Das zugrunde liegende Prinzip der HPLC besteht darin, dass Analyten, die in einem Lösungsmittel gelöst (d. h. mobile Phase) und durch eine Säule gepumpt werden, mit dem spezifischen Säulenpackungsmaterial (d. H. Stationäre Phase) interagieren11. Abhängig von ihren chemischen Eigenschaften weisen diese Analyten unterschiedliche Retentionszeiten auf, bevor sie schließlich aus der stationären Phase eluiert und von der mobilen Phase zu einem Detektor transportiert werden. Dieser Bericht beschreibt die Vorbereitung und Analyse von E. coli lysat-basierten CFME-Reaktionen durch HPLC-basierte Methoden, die RID- und MS/MS-Detektion nutzen.
Die HPLC gekoppelt an den Brechungsindex-Nachweis (HPLC-RID) ist eine allgemein zugängliche Methode zur schnellen Identifizierung zentraler Stoffwechselvorläufer und Endprodukte. Kurz gesagt, RID misst, wie Analyten die Ablenkung des Lichts durch die mobile Phase12verändern. RID-Signale, die Zielanalyten in Proben entsprechen, können dann durch Vergleiche mit RID-Signalen von Standardlösungen quantifiziert werden. In CFME-Anwendungen wurde diese Art der Detektion am häufigsten mit HPLC-Säulen verwendet, die Verbindungen basierend auf einer Kombination von Größenausschluss und Ligandenaustauschmechanismen oder ionenmoderter Partitionschromatographie5,6,8,13trennen. Diese spezielle Technik wird verwendet, um den Verbrauch von Zuckersubstraten wie Glukose sowie die Bildung von Fermentationsprodukten wie Succinat, Laktat, Formiat, Acetat und Ethanol in lysatbasierten CFME-Reaktionen schnell zu quantifizieren8. Die Aufzeichnung der Konzentrationsänderungen dieser Verbindungen mittels HPLC war nützlich, um sowohl das Potenzial von Rohzellextrakten zur Bündelung zentraler Stoffwechselvorläufer aufzuklären als auch zu verstehen, wie der Signalwegfluss während komplexer metabolischer Umwandlungen von Glukose in Lysaten durch fermentative Wege umgeleitet wird6,8,14. Bahnbrechende CFME-Studien in E. coli-Zellextrakten bestätigen, dass sich Fermentationsverbindungen als Endprodukte des Glukosekatabolismus anreichern und auch als unerwünschte Nebenprodukte in Lysaten vorkommen, die exogene Enzyme überexprimieren6,15. Es wird vermutet, dass der fermentative Stoffwechsel eine notwendige Rolle bei der Regeneration von Redoxäquivalenten von Cofaktoren (d. H. NAD (P) H und ATP) spielt, um glykolytische Reaktionenaufrechtzuerhalten 8. Daher ist eine HPLC-basierte optische Detektionsmethode zur Trennung von Fermentationsprodukten ein nützliches und häufig angewendetes Werkzeug bei der Ausführung verschiedener lysatbasierter CFME-Aufgaben.
CFME kann implementiert werden, um metabolische Endprodukte zu akkumulieren, die keine Kohlenhydrate, organischen Säuren oder Alkohole sind4. Die Messung von Zwischenprodukten, die so schnell verbraucht werden, wie sie synthetisiert werden, kann ebenfalls wünschenswert sein10. Während HPLC-RID in Bezug auf Kosten und Schwierigkeit zugänglich ist, ist diese Methode durch ihre Fähigkeit eingeschränkt, Metaboliten nur anhand der Retentionszeit zu unterscheiden. Ein breiteres Spektrum von Metaboliten kann analysiert werden, wenn die Flüssigkeitschromatographie mit dem MS/MS-Nachweis (LC-MS/MS) gekoppelt ist16. Mit dieser Methode werden Analyten in der mobilen Phase ionisiert und basierend auf den Massen- und Ladungseigenschaften jedes Moleküls differentiell detektiert. Die Kenntnis sowohl des Masse-zu-Ladungs-Verhältnisses (m/z) des Metaboliten als auch der Retentionszeit an der Säule erleichtert somit die Trennung der meisten Stoffwechselzwischen- und Endprodukte mit hoher Auflösung16. Diese Detektionstechnik kann auch mit der Nano-Flüssigkeitschromatographie gekoppelt werden, die viel geringere Durchflussraten und Probeninjektionsvolumina ermöglicht, was einen empfindlicheren Nachweis kleiner Moleküle im komplexen Lysathintergrund ermöglicht17. LC-MS/MS kann zusätzlich mit Isotopenmarkierung angewendet werden, da eingearbeitete Markierungen Veränderungen der m/z-Werte 18 der Analytenbewirken. Zeitpunktmessungen, die aus einer CFME-Reaktion extrahiert werden, die mit einem 13C6-Glukosesubstratergänzt wird, können somit die End- oder Nebenprodukte bestimmen, die speziell aus der ergänzten Glukose gewonnen werden. Obwohl diese Isotopenverfolgungsmethode in CFME-Studien noch nicht häufig angewendet wird, ist sie ein leistungsfähiges Werkzeug zum Verständnis metabolischer Umwandlungen in lysatbasierten CFME-Systemen, zumal Salzkonterionen (d. H. Acetat und Glutamat) in diesen Reaktionen auch als Sekundäreubstrate katabolisiert werden19. Durch den Einsatz dieser Technik kann somit ein umfassendes Bild des Glukosestoffwechsels in Lysaten zeichnen, das bis heute nicht vollständig verstanden wird. Hier beschreibt das Protokoll eine Methode zur Nanoflüssigkeitschromatographie gekoppelt an Nanoelektrospray-Ionisation (Nano-ESI) MS/MS, mit der ein mögliches Modell des Glukosestoffwechsels, insbesondere in E. coli-Lysaten, abgefragt werden kann (Abbildung 1). Das Modell basiert auf Berichten über fermentative Wege und den Pentosephosphatweg, der in E. colilysaten aktiv ist, die aus Stämmenstammen,die in Rich Media gezüchtet werden5,6,8,14. Die Technik wird zusätzlich zur Untersuchung der Aminosäureproduktion eingesetzt, da sich das derzeitige Wissen über den Aminosäureanabolismus aus Glukose in Lysaten auf wenige Beispiele wie die Synthese aromatischer Aminosäuren beschränkt7. Angesichts der meist polaren Natur von Endprodukten und Zwischenprodukten in diesen Signalwegen (d.h. organische Säuren, Zuckerphosphate und Aminosäuren) wurde hier die umkehrphasenförmige Flüssigkeitschromatographie eingesetzt. Diese Technik trennt polare Verbindungen durch Elution von einer unpolaren stationären Phase. Diese Verbindungen wurden dann durch Nano-ESI im negativen Ionenmodus ionisiert, was den Nachweis von Analyten mit mindestens einer negativen Elementarladung ermöglicht und somit für den Nachweis saurer Verbindungen nützlich ist. Diese Technik wird hier verwendet, um glukosebasierte 13C-integrierende Metaboliten zu analysieren und den Nutzen von LC-MS / MS für das Verständnis des Glukosestoffwechsels in Lysaten zu demonstrieren.

<table><tbody><tr><td>0,22 μm m Zentrifugenröhrchenfilter (Spin-Säulen)</td><td>Corning Costar</td><td>8160</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>1260 Infinity Binäre LC-Pumpe</td><td>Agilent</td><td>G1312B</td><td>HPLC-RID-System</td></tr><tr><td>1260 Infinity Hochleistungs-Entgaser</td><td>Agilent</td><td>G4225A</td><td>HPLC-RID-System</td></tr><tr><td>1260 Infinity Brechungsindex-Detektor</td><td>Agilent</td><td>G7162A</td><td>HPLC-RID-System</td></tr><tr><td>1260 Infinity Standard Autosampler</td><td>Agilent</td><td>G1329B</td><td>HPLC-RID-System</td></tr><tr><td>13C6-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>389374</td><td>CFME-Reaktionsmix-Komponente (LC-MS/MS</td></tr><tr><td>)500 mL 0,20 &mu; m Porenfilter (PES-Membran)</td><td>VWR</td><td>10040-436</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril (LC/MS-Qualität)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955</td><td>Lösungsmittelpräparation für LC-MS/MS</td></tr><tr><td>Adenosintriphosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td>CFME-Reaktionsmixkomponente</td></tr><tr><td>Aminex HPX 87-H Säule</td><td>Bio-rad</td><td>1250140</td><td>Chromatographiesäule für HPLC-RID</td></tr><tr><td>Ammoniumacetat (LC/MS-Qualität)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11450</td><td>Lösungsmittelvorbereitung für LC-MS/MS</td></tr><tr><td>Ammoniumglutamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1376</td><td>CFME-Reaktionsmixkomponente</td></tr><tr><td>Autosampler-Fläschchenkappen (gelb, schnapp)</td><td>Thermo Scientific</td><td>C4011-50Y</td><td>Probenlagerung/-abgabe für LC-MS/MS</td></tr><tr><td>Autosampler-Fläschchen (0,30 ml, Polypropylen)</td><td>Wheaton</td><td>W225181</td><td>Probenlagerung/-abgabe für LC-MS/MS</td></tr><tr><td>Tisch-Mikrozentrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9754</td><td>CFME-Reaktionsmixkomponente</td></tr><tr><td>Coenzym A (CoA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td>CFME-Reaktionsmixkomponente</td></tr><tr><td>D-Dextrose (Glukose)</td><td>VWR</td><td>BDH9230</td><td>CFME-Reaktionsmixkomponente</td></tr><tr><td>Dikaliumphosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8281</td><td>CFME-Reaktionsgemischkomponente</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td>Gelöst in S30-Puffer für die Herstellung einer Standardkurvenlösung (HPLC-RID)</td></tr><tr><td>Ameisensäure (LC/MS-Qualität)</td><td>Thermo Scientific</td><td>85178</td><td>Lösungsmittelvorbereitung für LC-MS/MS</td></tr><tr><td>Quarzglas (Innendurchmesser von 100 μm; m, Außendurchmesser von 375 &mu; m)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>WM22005-ND</td><td>Chromatographiesäule für LC-MS/MS</td></tr><tr><td>Eisessigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>S30 Pufferbestandteil</td></tr><tr><td>Isopropanol (LC/MS-Qualität)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A461</td><td>Lösungsmittelpräparat für LC-MS/MS</td></tr><tr><td>Kinetex 5 &mu; m C18 stationäre Phase (100 & Aring;)</td><td>Phenomenex</td><td>N/A; Sonderbestellung</td><td>Chromatographiesäule für LC-MS/MS</td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Velos Pro Massenspektrometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N/A; Sonderbestellung</td><td>Massenspektrometer für LC-MS/MS</td></tr><tr><td>Magnesiumacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661</td><td>S30 Pufferbestandteil</td></tr><tr><td>Magnesiumglutamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td>CFME Reaktionsgemischkomponente</td></tr><tr><td>Methanol (LC/MS-Qualität)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456</td><td>Lösungsmittelpräparation für LC-MS/MS</td></tr><tr><td>NAD+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0632</td><td>CFME-Reaktionsgemischkomponente</td></tr><tr><td>Nanospray Ionisationsquelle</td><td>ThermoFisher Scientific/Proxeon</td><td>ES071 (neuestes Modell)</td><td>Massenspektrometer für LC-MS/MS</td></tr><tr><td>OpenLab CDS (Online) Software</td><td>Agilent</td><td>Version 2.15.26</td><td>Chromatographie-Datensystem zur Erfassung und Analyse von HPLC-Daten</td></tr><tr><td>Orbitrap Velos Pro LTQ Tune Plus Software</td><td>Thermo</td><td>Version 2.7</td><td>Software zur Abstimmung des LC-MS/MS-Systems</td></tr><tr><td>Kaliumacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1190</td><td>S30 Pufferbestandteil</td></tr><tr><td>Kaliumglutamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td>CFME Reaktionsmixkomponente</td></tr><tr><td>Kühlzentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415 C</td><td></td></tr><tr><td>Schraubverschlüsse (mit Septen, 9 mm)</td><td>Supelco</td><td>29315-U</td><td>Probenlagerung/-abgabe für HPLC-RID</td></tr><tr><td>Glasfläschchen mit Schraubgewinde (2 mL)</td><td>Supelco</td><td>29376-U</td><td>Probenlagerung/-abgabe für HPLC-RID</td></tr><tr><td>Natriumacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>241245</td><td>Gelöst in S30-Puffer für die Herstellung von Standardkurvenlösungen (HPLC-RID)</td></tr><tr><td>Natriumformiat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>247596</td><td>Gelöst in S30-Puffer für die Herstellung von Standardkurvenlösungen (HPLC-RID)</td></tr><tr><td>Natriumlactat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71716</td><td>Gelöst in S30-Puffer für die Herstellung von Standardkurvenlösungen (HPLC-RID)</td></tr><tr><td>Bernsteinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398055</td><td>Gelöst in S30-Puffer für die Herstellung von Standardkurvenlösungen (HPLC-RID)</td></tr><tr><td>Schwefelsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td>Lösemittelpräparat für HPLC-RID</td></tr><tr><td>Trichloressigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Acetat</td><td>GoldBio</td><td>T-090-100</td><td>S30 Pufferbestandteil</td></tr><tr><td>Ultimate 3000 LC mit Autosampler</td><td>Dionex</td><td>Solvent Rack: SRD-3600</td><td>Flüssigchromatographie-System für LC-MS/MS-Analysen</td></tr><tr><td>Ultimate 3000 LC mit Autosampler</td><td>Dionex</td><td>Rapid Separation Binäre Pumpe: HPG-3400RS</td><td>Flüssigchromatographie-System für LC-MS/MS-Analysen</td></tr><tr><td>Ultimate 3000 LC mit Autosampler</td><td>Dionex</td><td>Rapid Separation Well Plate Autosampler: WPS-3000TRS</td><td>Flüssigchromatographie-System für LC-MS/MS-Analysen</td></tr><tr><td>Wasser (LC/MS-Qualität)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6500</td><td>Lösungsmittelvorbereitung für LC-MS/MS</td></tr><tr><td>Xcalibur Software</td><td></td><td>Thermo Version 3.0.63</td><td>Datenerfassungs- und Interpretationssoftware für LC-MS/MS</td></tr></tbody></table>

flüssigkeitschromatographie gekoppelt an brechungsindex oder massenspektrometrische detektion zur metabolitenprofilierung in lysatbasierten zellfreien systemen

Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

Die Entwicklung des Zellstoffwechsels für eine gezielte Biosynthese kann umfangreiche DESIGN-Build-Test-Learn-Zyklen (DBTL) erfordern, da der Ingenieur die Überlebensanforderungen der Zelle umrennt. Alternativ kann die Durchführung von DBTL-Zyklen in zellfreien Umgebungen diesen Prozess beschleunigen und Bedenken hinsichtlich der Hostkompatibilität beseitigen. Ein vielversprechender Ansatz für zellfreies Metabolic Engineering (CFME) nutzt metabolisch aktive Rohzellextrakte als Plattformen für die Bioherstellung und für die schnelle Entdeckung und Prototypenerstellung modifizierter Proteine und Signalwege. Die Realisierung dieser Fähigkeiten und die Optimierung der CFME-Leistung erfordern Methoden zur Charakterisierung des Metaboloms von lysatbasierten zellfreien Plattformen. Das heißt, analytische Werkzeuge sind notwendig, um Verbesserungen bei gezielten Metabolitenumwandlungen und bei der Aufklärung von Veränderungen des Metabolitenflusses bei der Manipulation des Lysatstoffwechsels zu überwachen. Hier wurden Metabolitenanalysen mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) in Verbindung mit optischer oder massenspektrometrischer Detektion angewendet, um die Metabolitenproduktion und den Fluss in E. coli S30-Lysaten zu charakterisieren. Konkret beschreibt dieser Bericht die Präparation von Proben aus CFME-Lysaten für HPLC-Analysen mittels Brechungsindexdetektion (RID), um die Erzeugung zentraler Stoffwechselzwischenprodukte und Nebenprodukte bei der Umwandlung von kostengünstigen Substraten (z.B. Glukose) in verschiedene hochwertige Produkte zu quantifizieren. Die Analyse der Metabolitenumwandlung in CFME-Reaktionen, die mit 13C-markierter Glukose durch Umkehrphasenflüssigkeitschromatographie in Verbindung mit der Tandem-Massenspektrometrie (MS/ MS) gefüttert werden, einem leistungsfähigen Werkzeug zur Charakterisierung spezifischer Metabolitenausbeuten und des Lysat-Stoffwechselflusses aus Ausgangsmaterialien, wird ebenfalls vorgestellt. Insgesamt ermöglicht die Anwendung dieser analytischen Methoden auf den CFME-Lysatstoffwechsel die Weiterentwicklung dieser Systeme als alternative Plattformen für die Ausführung schnellerer oder neuartiger Metabolic Engineering-Aufgaben.

Zur Quantifizierung der lysatbasierten zellfreien Synthese gängiger Fermentationsprodukte aus Glukose wurden Lysate aus Stämmen, die in 2xYPTG-Medien gezüchtet wurden, mit 100 μM Glukose als primäre Kohlenstoffquellegefüttert 8. Reaktionen wurden über einen 24-Stunden-Verlauf durch Proteinversauerung gestoppt. Gefilterte Überstände, die Pyruvat, Succinat, Laktat, Formiat, Acetat und Ethanol aus Glukosekatabolismus enthielten, wurden auf das Autosamplermodul eines HPLC-Systems geladen, das mit einem RID-Modul ausgestattet war. Durchstechflaschen mit gefilterten Mischungen fermentativer Endprodukte und Glukose bei 1,17 μM, 2,34 μM, 4,69 μM, 9,38 μM, 18,75 μM, 37,50 μM, 75 μM und 150 μM Konzentrationen im S30-Puffer wurden als Standard auf das Gerät geladen. Analyten wurden isokratisch von einer HPLC-Säule in die RID eluiert. Peaks für Glukose, Succinat, Laktat, Formiat, Acetat und Ethanol im Bereich von 1 bis 150 μM konnten durch RID aufgelöst werden. Peakflächen für Glukose wurden durch manuelle Integration aus den RID-Daten für Zeitverlaufs- und Standardkurvenproben abgeleitet. Extrahierte Spitzenbereiche für Succinat, Laktat, Formiat, Acetat und Ethanol wurden aus automatisch integrierten Signalen entnommen. Alle Standardkurven (Peakfläche vs. bekannte Konzentration) hattenR2-Werte &gt;0,99 und waren linear über den gesamten hier verwendeten Konzentrationsbereich.
Molare Konzentrationen für alle Zielanalyten wurden aus ihren jeweiligen Standardkurven berechnet. Glukose wurde innerhalb der ersten 3 h der Reaktion verbraucht und hauptsächlich zu Laktat fermentiert (Abbildung 2A, B). Die Ethanolakkumulation trat auch signifikant innerhalb der ersten 3 Stunden der Reaktion auf und stoppte danach (Abbildung 2C). Die Beobachtung einer signifikanten Laktat- und Ethanolproduktion mit signifikantem Glukoseverbrauch nach 3 h war nicht beispiellos, da Laktat- und Ethanolproduktionswege die Regeneration von 1 Netto-mol NAD+ aus glykolytischem NADH ermöglichen, das für den fortgesetzten Glukoseverbrauch durch Glykolyse erforderlich ist (Abbildung 1). Laktat und Ethanol können daher als die wichtigsten Fermentationsendprodukte im zellfreien Glukosestoffwechsel auf Lysatbasis angesehen werden. Acetat war in den Reaktionen zunächst als Bestandteil des S30-Puffers vorhanden und akkumulierte unerwartet erst nach 6 h durch Stoffwechsel, wenn sich der Glukoseverbrauch verlangsamt hatte (Abbildung 2D). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die Acetatfermentation nicht unbedingt einen schnellen glykolytischen Fluss in früheren Zeitpunkten ermöglicht. In der Zwischenzeit wurden Formiat und Succinat als kleinere Fermentationsprodukte synthetisiert (Abbildung 2E,F). Insgesamt ermöglichte das Verfahren die absolute Quantifizierung der Zuckersubstraterschöpfung und der fermentativen Produktbildung in E. coli S30-Lysaten.
Hier wurde der MS-Nachweis zum Profil des Lysatglukosestoffwechsels speziell angewendet. Lysate, die aus Stämmen gewonnen wurden, die in 2xYPTG-Medien gezüchtet wurden, wurden mit 13C6-Glukoseals Kohlenstoffquelle gefüttert. CFME-Reaktionen wurden in dreifacher Ausfertigung für 0 h, 1 h, 2 h und 3 h durchgeführt. Proben von jedem Zeitpunkt wurden auf ein LC-System geladen, das mit einer Umkehrphasensäule ausgestattet und mit Fourier-Transformations- und Ionenfallen-Massenspektrometern gekoppelt war. Negative Ionenmodusspektren wurden erhalten und verarbeitet, um organische Säuren, Zuckerphosphate und Aminosäuren zu analysieren. Berechnete theoretische Massen von 13C-markierten Spezies, die zum zentralen Kohlenstoffstoffwechsel gehören, wurden durchsucht, um spezifisch glukosebasierte Verbindungen zu identifizieren. Basierend auf den verwendeten Quellstammkultivierungsbedingungen und früheren Berichten über aktive Signalwege in E. coli CFME wird hier angenommen, dass das Lysatproteom ein metabolisches Netzwerk umfasst, das Glukose in die glykolytische Fermentation einspeist, den Pentosephosphatweg und möglicherweise Aminosäureanabolismus5,6,7,8,14 ( Abbildung1). Daher wurde die Suche auf Mitglieder dieser Signalwege eingegrenzt, von denen 16 Metaboliten, die glucose-abgeleitete 13C-Markierungen enthielten, eindeutig annotiert waren (Ergänzende Tabelle 1).
13 C6-Glucosewurde durch Glykolyse beobachtbar verbraucht, wie die Schwankungen der glykolytischen Zwischenhäufigkeiten belegen ( Abbildung3A-E). In Übereinstimmung mit den HPLC-RID-Daten akkumulierte sich Glukose zu 13C3-Laktatund wurde innerhalb der ersten3h der Reaktion auch zu 13C3-Succinat fermentiert(Abbildung 4A,B). Die Bildung von 13C3-Succinat-Isotopologen unterstützt das vorgeschlagene Modell des Lysatglucosestoffwechsels (Abbildung 1), bei dem Succinat wahrscheinlich durch die Carboxylierung von 3-Kohlenstoffphosphosphoenolpyruvat (PEP) -Molekül und nicht durch den Eintritt eines 2-Kohlenstoff-Acetyl-CoA-Moleküls in den TCA-Zyklus erzeugt wird. Eine Aktivierung des TCA-Zyklus wurde in früheren CFME-Studien angenommen, aber andere 13C-markierte Zwischenprodukte von TCA wurden hier nicht nachgewiesen8,19,21. 13 Die C3-Aspartatsynthese fand jedoch innerhalb des ersten h statt und wurde verbraucht, was die Idee verstärkte, dass PEP direkt in Oxalacetat umgewandelt wird (Abbildung 1, Abbildung 6C). Die Daten spiegeln ein Lysatproteom aus Quellstämmen wider, die während des fermentativen Wachstums auf glukosereichen Medien (2xYPTG) geerntet wurden. Dies würde weiter bedeuten, dass der Rest der TCA-Enzyme, die nicht an der Succinatproduktion beteiligt sind, einen oxidativen TCA-Zweig bilden (Abbildung 1). Keiner der Metaboliten in diesem Signalweg wurde jedoch nachgewiesen, möglicherweise weil hohe Konzentrationen von Glutamat, die der CFME-Reaktion als Salzgegenion zugesetzt wurden, das Fortschreiten dieses Zweiges verhindern. 
Die HPLC-RID-Daten werden zusätzlich durch das Fehlen eines 13C2-Acetat-Nachweises innerhalb des 3-h-Reaktionszeitrahmens ergänzt, was darauf hindeutet, dass sich bis zu 3 h kein Acetat aus Glukose ansammelt(Abbildung 2B). Der direkte Vorläufer von Acetat, Acetylphosphat (Acetyl-P), hat sich jedoch angesammelt, was darauf hindeutet, dass der Pta-Arm des Pta-AckA-Signalwegs zur Acetatsynthese aus Acetyl-CoA aktiv ist (Abbildung 4C, D). Die AckA-katalysierte Dephosphorylierung von 13C2-Acetyl-Pzu 13C2-Acetattritt wahrscheinlich nicht innerhalb dieses Zeitrahmens auf, da Acetat ein Hauptbestandteil des in den Reaktionen verwendeten S30-Puffers ist ( Abbildung1, Abbildung 2B).
Die Einarbeitung von 13C6-Glucose-abgeleiteten Kohlenstoffen zu den Zuckerphosphaten 6-Phosphogluconolacton (6PGL), 6-Phosphogluconat (6PG), Ribulose-5-phosphat (Ru5P) und Sedoheptulose-7-phosphat (S7P) wurde ebenfalls beobachtet (Abbildung 5). Diese Ergebnisse bestätigen die Beteiligung des Pentosephosphatwegs am Lysatglukosestoffwechsel und füttern wahrscheinlich die 13C9-Tyrosinsynthese, die zuvor durch eine proteomische Studie vorgeschlagen wurde, während sie auch eine Vorstufe für die 13C5-Histidinproduktionliefern (Abbildung 6A, B)7. Markiertes Phenylalanin und Tryptophan wurden hier nicht beobachtet, ebenso wenig wie die meisten essentiellen Aminosäuren. Dies ist jedoch nicht ganz überraschend, da der Aminosäureanabolismus wahrscheinlich in Lysaten angereichert wird, die aus Zellen gewonnen werden, die unter nährstoffarmen Bedingungen oder in der stationären Phase7,22gezüchtet wurden . Darüber hinaus deuten die bisherigen Daten darauf hin, dass Zwischenprodukte der Glykolyse und Fermentation in Richtung cofaktorregenerierender Endreaktionen geleitet werden, die die Synthese vieler Aminosäuren aus Glyceraldehyd-3-phosphat, Pyruvat und Acetyl-CoA (d. h. Glycin, Cystein, Serin, Alanin, Valin, Leucin und Lysin) ausschließen müssen (Abbildung 1). Wie bereits erwähnt, wurde innerhalb der ersten Stunde 13C3-Aspartatproduziert, während aus Aspartat abgeleitete 13C-integrierende Aminosäuren (d. H. Threonin, Isoleucin, Methionin und Asparagin) möglicherweise nicht beobachtet wurden, weil aus Glukose gewonnenes Aspartat an der Fermentation beteiligt ist ( Abbildung1, Abbildung 6C). Schließlich könnte der Fluss in Richtung markiertem Glutamat und aus Glutamat gewonnenen Aminosäuren durch hohe Glutamatspiegel in der Reaktionsumgebung behindert worden sein (Abbildung 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig01.jpg"> Abbildung 1: Ein mutmaßliches Stoffwechselmodell von Lysaten, abgeleitet von E. coli BL21DE3-Star, die in hohen Glukosekonzentrationen exponentiell wachsen. Zwischen- und Endprodukte der Glykolyse (grün), des Pentosephosphatweges (dunkelorange) und fermentativer Wege (blau) aus Acetyl-CoA wurden bei CFME auf Lysatbasis berichtet. Das Vorhandensein von Succinatfermentation impliziert die Aktivierung des oxidativen TCA-Zweigs (grau). Aminosäureanabolismus (Gold) in Lysaten ist nicht genau definiert und wird hier untersucht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig02.jpg"> Abbildung 2: HPLC-RID-Daten für den Glukoseverbrauch und die fermentative Endproduktsynthese in CFME-Reaktionen, die mit E. coli-Rohextrakten hergestellt wurden. (A) Glukoseverbrauch und (B) Laktat, (C) Ethanol, (D) Acetat, (E) Formiat und (F) Succinatproduktion in CFME-Reaktionen wurden über 24 h überwacht. Dargestellt werden durchschnittliche mM-Konzentrationen und Fehlerbalken (SE), die mit Standardkurven quantifiziert wurden (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig03.jpg"> Abbildung 3: Zeitverlaufstrends von 13C6-Glucoseund 13C-markierten glykolytischen Zwischenprodukten in E. coli lysat CFME. Relative Häufigkeiten von(A) 13C6-Glucose,(B) 13C6-Glucose-6-phosphat/Fructose-6-phosphat,(C) 13C6-Fructose-1,6-bisphosphat, (D) 13C3-Glyceraldehyd-3-phosphat / Dihydroxyacetonphosphat und (E) 13C6 -Pyruvat bei CFME-Reaktionen über 3 h. Rohe Peakflächen, die von der mzMINE-Software extrahiert wurden, wurden verwendet, um Durchschnittswerte und Fehlerbalken (SE) für positive Annotationen (n = 3) zu berechnen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig04.jpg"> Abbildung 4: Zeitverlaufstrends von Zwischen- und Endprodukten in 13C6-Glukosefermentation in E. colilysat CFME. Relative Häufigkeiten von (A) 13C3-Laktat,(B) 13C3-Succinat, (C) 13C2-Acetylphosphat und (D) 13C2-Acetyl-CoA in CFME-Reaktionen über 3 h. Rohe Peakflächen, die von der mzMINE-Software extrahiert wurden, wurden verwendet, um Durchschnittswerte und Fehlerbalken (SE) für positive Annotationen (n = 3) zu berechnen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig05.jpg"> Abbildung 5: Zeitverlaufstrends von 13C6-Glucose-abgeleiteten Pentosephosphat-Signalweg-Zwischenprodukten in E. colilysat CFME. Relative Häufigkeiten von (A) 13C6-6-phosphogluconolacton, (B) 13C6-6-phosphogluconat, (C) 13C5-Ribulose-5-phosphatund (D) 13C7-sedoheptulose-7-phosphat über 3 h. Rohe Peakflächen, die von der mzMINE-Software extrahiert wurden, wurden verwendet, um Durchschnittswerte und Fehlerbalken (SE) für positive Annotationen (n = 3) zu berechnen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62852/62852fig06.jpg"> Abbildung 6: Zeitverlaufstrends der nachgewiesenen 13C6-Glucose-abgeleiteten Aminosäuren in E. colilysat CFME. Relative Häufigkeiten von (A) 13C9-Tyrosin, (B) 13C5-Histidinund (C) 13C3-Aspartat über 3 h. Rohe Peakflächen, die von der mzMINE-Software extrahiert wurden, wurden verwendet, um Durchschnittswerte und Fehlerbalken (SE) für positive Annotationen (n = 3) zu berechnen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/62852fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Abbildung 1: Repräsentatives HPLC-RID-Chromatogramm, das Spitzen für wichtige fermentative Produkte in einer CFME-Reaktion zeigt, die bei 37 °C für 24 h inkubiert wurde. Glukose-, Succinat-, Laktat-, Formiat-, Acetat- und Ethanolpeaks sind durch ihre Retentionszeiten auf einer HPLC-Säule während der isokratischen Elution mit 5 mM Schwefelsäurelösungsmittel ausreichend unterscheidbar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/JoVE-Suppfig1.eps" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 2: Repräsentative Massenspektren für 13C-markierte Metaboliten, insbesondere (A) Laktat, (B) Glukose und (C) 6-Phosphogluconat (6PG) in einer CFME-Reaktion, die bei 37 °C für 1 h inkubiert <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/JoVE-SuppFig2.eps" target="_blank">wurde.</a>
Ergänzende Tabelle 1: Liste der nachgewiesenen 13C-markierten Metaboliten, Retentionszeiten (abgestimmt auf Die Proben mit MZmine), theoretische vollständig 13C-markierte negative Mode m/z-Werte, m/z-Werte der erkannten Merkmale und berechnete Massenfehler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62852/Supplemental%20Table%201.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Die Protokolle beschreiben Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Methoden, gekoppelt an Brechungsindex oder massenspektrometrische Detektion zur Untersuchung von Stoffwechselreaktionen in komplexen lysatbasierten zellfreien Systemen.

Flüssigkeitschromatographie gekoppelt an Brechungsindex oder massenspektrometrische Detektion zur Metabolitenprofilierung in lysatbasierten zellfreien Systemen

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...

Dieses Protokoll verwendet die Brechungsindexerkennung, um Nebenprodukte des Kohlenstoffstoffwechsels zu messen, die üblicherweise in lysatbasierten, zellfreien Systemen akkumuliert werden. Es nutzt auch die Massenspektrometrie, um ein noch breiteres Panel zentraler Metaboliten nachzuweisen, die in metabolisch aktiven Lysaten erzeugt werden. Die beiden in diesem Protokoll verwendeten Techniken bieten die Möglichkeit, die chemischen Reaktionen, die in einem lysatbasierten, zellfreien System ablaufen, quantitativ zu beschreiben, was es ermöglicht, eine breitere Palette von Metaboliten nachzuweisen, einschließlich solcher, die in niedrigen Konzentrationen im komplexen Lysathintergrund vorhanden sind.Jaime Lorenzo Dinglasan und David Reeves, Diplomforscher der Biosciences Division, demonstrieren die Verfahren. Beginnen Sie mit der Kombination der verschiedenen Komponenten in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, um endgültige Reaktionen mit 4,5 Milligramm pro Milliliter Gesamtlysatprotein vorzubereiten. Bereiten Sie zellfreie Metabolic Engineering- oder CFME-Reaktionen mit Endvolumina von 50 Mikrolitern in dreifacher Ausfertigung pro Zeitpunkt vor.Beenden Sie die dreifachen Reaktionen zu den richtigen Zeitpunkten sofort, indem Sie dem endgültigen Reaktionsvolumen jeder Probe ein gleiches Volumen von 5% Trichloressigsäure hinzufügen. Dann verdünnen Sie jede Probe, indem Sie jedem Reaktionsgemisch das Zweifache des Volumens an sterilem Wasser hinzufügen. Um die Zeit Null zu rekapitulieren, mischen Sie das gleiche Volumen von 5% Trichloressigsäure wie das gesamte Endreaktionsvolumen mit dem Lysat, bevor Sie den Rest der Reaktionskomponenten hinzufügen.Dieser Säuerungsschritt löst Lysatenzyme aus, bevor sie Glukose signifikant verstoffwechseln. Wirbeln Sie die Proben und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang auf einer Mikrozentrifuge auf dem Tisch mit 11.600 g und übertragen Sie die Überstände, die die organischen Analyten enthalten, in saubere Röhrchen. Lagern Sie die Proben bei minus 20 Grad Celsius, wenn später HPLC-Analysen durchgeführt werden sollen.Stellen Sie sicher, dass Sie die gelagerten Proben auf Eis auftauen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Filtern Sie jeden Überstand mit einem 0,22-Mikrometer-Porenfilter. Nach der Zentrifuge jedes Filtrat in eine saubere HPLC-Glasfläschchen geben.Legen Sie die Fläschchen auf das Autosampler-Fach des HPLC-Systems, das bereits für die Analyse eingerichtet wurde. Wählen Sie in der Menüleiste Sequenz, Neue Sequenzvorlage aus. Wählen Sie Sequenz aus.Sequenzvorlage als Sequenzvorlagennamen speichern S.Wählen Sie Sequenz, Sequenztabelle. Hängen Sie N Zeilen an, die N Fläschchen entsprechen. Geben Sie dann die Positionen der Durchstechflasche und die Probennamen unter Der durchstechflasche bzw. Probenname entsprechend ihrer Anordnung auf dem Autosampler-Fach ein.Wählen Sie die im Manuskript beschrieben generierte Methode aus dem Dropdown-Menü Methodenname aus und geben Sie 50 Mikroliter als Injektion pro Durchstechflasche für jede Zeile ein. Klicken Sie auf Übernehmen, und speichern Sie die Sequenzvorlage, indem Sie Sequenz, Sequenzvorlage speichern auswählen. Stellen Sie sicher, dass die Sequenzvorlage geladen ist, indem Sie Sequenz, Sequenzvorlage laden, Sequenzvorlagenname S auswählen.Nachdem Sie eine stabile Baseline auf dem Online-Plot erreicht haben, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bedienfeld RID-Modul, Steuerung, Aus Recyclingventil, um den Lösungsmittelfluss durch den RID-Detektor zum Abfall zu leiten.Um die Datenerfassung zu starten, wählen Sie in der Menüleiste Sequenz und dann Sequenztabelle, Ausführen aus. Wählen Sie im Menü Ansicht die Option Datenanalyseansicht aus. Suchen Sie den Namen der Sequenzdatei aus der Dateiliste auf der linken Seite des Bildschirms.Wechseln Sie im mittleren Bereich des Bildschirms zu Signalansichtsauswahl, RID-Signal, um die Beispielchromatogramme anzuzeigen. Wählen Sie im oberen Bereich des Bildschirms eine Zeile aus, die einem der Beispiele entspricht. Peaks, die den Zielanalyten entsprechen, werden entlang der Retentionszeitachse als Glukose, Succinat, Laktat, Formiat, Acetat und Ethanol in Proben angeordnet, in denen alle diese Metaboliten vorhanden sind.Erkennen Sie, ob die Peaks of Interest von der Software gut integriert sind. Eine rote Linie sollte automatisch als Basis jedes Peaks gezeichnet werden. Wenn die rote Linie schief ist, ist die automatische Integration fehlgeschlagen.Wählen Sie dann die Schaltfläche Manuelle Integration aus dem Integration Tool Set und zeichnen Sie manuell eine Peak-Basis, um den Peak-Bereich zu integrieren. Wählen Sie das Cursor-Werkzeug aus dem Common Tool Set aus, um auf richtig integrierte Peaks zu klicken. Der Peak-Bereich und die entsprechende Reaktionszeit des ausgewählten Peaks werden als Tabellenzeile im unteren Bereich des Bildschirms hervorgehoben.Um Spitzenbereiche zu exportieren, wählen Sie Datei, Exportieren, Integrationsergebnisse. Zeichnen Sie Spitzenflächenwerte im Vergleich zu bekannten Konzentrationen von Proben in einer Tabelle auf. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die dargestellten Daten, und wählen Sie dann Trendlinie hinzufügen, Trendlinie formatieren, Formel im Diagramm anzeigen aus.Verwenden Sie in einer separaten Tabelle die Gleichungen der Standardkurventrendlinien, um Spitzenflächenwerte für jeden Analyten aus jeder Probe in Konzentrationen umzuwandeln. Berechnen Sie die durchschnittlichen Spitzenbereiche und Standardfehlerwerte über Triplikate hinweg für die Datenvisualisierung. Richten Sie dreifache Reaktionen pro Zeitpunkt, außer Zeit Null, auf Eis ein, wie im Manuskript beschrieben.Verwenden Sie anstelle von Glukose eine Endkonzentration von 100-Millimolar-Glukose-13C6 in den Reaktionen. Inkubieren Sie die Reaktionen bei 37 Grad Celsius für eine, zwei und drei Stunden. Um mit der Analyse zu beginnen, pipetieren Sie jeder Probe ein äquivalentes Volumen des Extraktionslösungsmittels.Wenn die Proben eingefroren wurden, fügen Sie das Extraktionslösungsmittel hinzu, bevor die Proben vollständig auftauen, um die Reaktivierung des Glukosestoffwechsels zu verhindern. Führen Sie alle Probenverarbeitungsschritte auf Eis durch. Um die Zeit Null zu rekapitulieren, pipetten Sie das Endvolumen des Extraktionslösungsmittels auf ein geeignetes Lysatvolumen für die gewünschte Endkonzentration von 4,5 Milligramm pro Milliliter in 50 Mikroliter Reaktionsvolumen.Fügen Sie den Rest der Reaktionskomponenten wie zuvor beschrieben hinzu. Dieser Säuerungsschritt löst Lysatenzyme aus, bevor sie Glukose signifikant verstoffwechseln. Inkubieren Sie die Proben in Extraktionslösungsmittel auf Eis für 30 Minuten unter sanftem Schütteln.Dann zentrifugieren Sie die Proben bei 21.000 mal g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius, um den Überstand vom gefällten Protein zu trennen. 50 Mikroliter des Überstands in Autosampler-Fläschchen geben und die Fläschchen innerhalb des vier Grad Celsius Autosamplers auf das Fach legen. Nachdem Sie das Gerät für die Analyse vorbereitet haben, richten Sie eine Laufsequenz mit der Datenerfassungs- und Interpretationssoftware des LC-MS/MS-Systems ein.Klicken Sie in Roadmap, Sequence Setup mit der rechten Maustaste auf die Tabelle, um so viele Zeilen wie Beispiele einzufügen. Stellen Sie für jede Reihe das Injektionsvolumen auf fünf Mikroliter und die Position auf die jeweilige Position der Durchstechflasche auf dem Autosampler-Fach ein. Geben Sie Dateinamen als Beispielnamen ein und legen Sie den gewünschten Dateipfad für die Ausführungsergebnisse fest.Um den Lauf zu starten, markieren Sie alle Dateinamen in der Sequenz. Wählen Sie in der Menüleiste Aktionen, Sequenz ausführen aus. Öffnen Sie MZmine und importieren Sie die zuvor erhaltenen Rohausgabedateien.Wählen Sie in der Menüleiste Rohdatenmethoden, Rohdatenimport und dann die Dateien aus, die den Beispielen entsprechen. Befolgen Sie die im Manuskript beschriebenen Schritte, um die MZmine-Analyse abzuschließen. Exportieren Sie die rohen Peak-Bereiche am Ende der MZmine-Analyse als CSV-Datei.Öffnen Sie eine Tabelle, um die Massen von 13C-markierten Metaboliten aus dem Glukosestoffwechsel für die gezielte Suche zu berechnen. Verwenden Sie berechnete Massen von 13C-markierten Metaboliten, um Masse-zu-Ladung-Merkmale aus MZmine-Ergebnissen zu suchen und zu kommentieren. Überprüfen Sie manuell die Spektren der mutmaßlichen Anmerkungen in einem Qualitätsbrowser, um die Anmerkungen zu bestätigen.Öffnen Sie Roadmap, Qual Browser. Öffnen Sie in der Symbolleiste die Rohdatei, um MS-Rohdaten jedes Beispiels zu importieren. Zeichnen Sie eine Linie unter den gewünschten Bereich der Retentionszeiten, die der mutmaßlichen Anmerkung auf dem Gesamtionenchromatogramm entspricht, um ein Massenspektrum anzuzeigen.In HPLC-RID-Experimenten wurde Glukose innerhalb der ersten drei Stunden nach der Reaktion verbraucht und hauptsächlich zu Laktat fermentiert. Die Ethanolakkumulation trat auch signifikant innerhalb der ersten drei Stunden der Reaktion auf und stoppte danach. Acetat war in den Reaktionen zunächst als Bestandteil des S30-Puffers vorhanden und sammelte sich aufgrund des Stoffwechsels erst nach sechs Stunden an, als sich der Glukosekonsum verlangsamt hatte.Laktat und Ethanol können daher als die wichtigsten Fermentationsendprodukte im lysatbasierten, zellfreien Glukosestoffwechsel angesehen werden. Es wurde beobachtet, dass sowohl Formiat als auch Succinat als kleinere Fermentationsprodukte synthetisiert wurden. Glucose-13C6 wurde durch Glykolyse beobachtbar verbraucht, wie die Schwankungen der glykolytischen Zwischenprodukte zeigen.In Übereinstimmung mit den HPLC-Brechungsindex-Nachweisdaten akkumulierte sich Glukose zu Laktat-13C3 und wurde innerhalb der ersten drei Stunden nach der Reaktion auch zu Succinat-13C3 fermentiert. Die Aufnahme von Glucose-13C6-abgeleiteten Kohlenstoffen in die Zuckerphosphate 6-Phosphogluconolacton, 6-Phosphogluconat, Ribulose-5-phosphat und Sedoheptulose-7-phosphat wurde ebenfalls beobachtet, was die Beteiligung des Pentosephosphatwegs am Lysatglukosestoffwechsel bestätigt. Es wurde festgestellt, dass der Lysatglukosestoffwechsel die Tyrosin-13C9-Synthese nährt und gleichzeitig einen Vorläufer für die Histidin-13C5-Produktion bietet.Wichtig ist, dass die Kontrollproben die Zeit Null genau darstellen. Stellen Sie daher sicher, dass die Proteine im Lysat vor dem Mischen in die Lösung, die Die Energiequellen enthält, inaktiviert werden. Stellen Sie außerdem sicher, dass die automatische Integration von Peaks aus Testproben, Kontrollproben und Standards konsistent ist, so dass extrahierte Peak-Bereiche vergleichbar sind.

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Biotechnik

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Flüssigkeitschromatographie gekoppelt an Brechungsindex oder massenspektrometrische Detektion zur Metabolitenprofilierung in lysatbasierten zellfreien Systemen (Video) | JoVE Journal

Flüssigkeitschromatographie gekoppelt an Brechungsindex oder massenspektrometrische Detektion zur Metabolitenprofilierung in lysatbasierten zellfreien Systemen

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