Ein dreidimensionales Sphäroidmodell zur Untersuchung der Tumor-Stroma-Wechselwirkung bei hepatozellulären Karzinomen

Es fehlen umfassende In-vitro-Modelle , die die relevante menschliche Krankheit getreu rekapitulieren. Die aktuelle Studie präsentiert die dreidimensionale (3D) Tumorsphäroidbildung und -kultur, ein zuverlässiges In-vitro-Werkzeug zur Untersuchung der Tumor-Stroma-Interaktion beim menschlichen hepatozellulären Karzinom.

3D-Tumorsphäroide haben die herkömmliche 2D-Monolayer-Technik als Goldstandard für die In-vitro-Krebsforschung abgelöst. Diese Modelle erlauben die Kokultur mehrerer Zelltypen, die die Heterogenität der Tumormikroumgebung widerspiegeln und die Nutzung räumlicher Wechselwirkungen ermöglichen. Vorteile der Verwendung der Hängentröpfchenmethode zur Erzeugung von 3D-Sphäroiden sind das Fehlen einer Zell-Kunststoff-Interaktion und die einfache Untersuchung der Interaktion zwischen den Tumorzellen und den Nicht-Tumorzellen.

Diese Technik bietet auch eine reproduzierbare und kostengünstige Möglichkeit, die Tumor-Stroma-Interaktion zu modellieren. 3D-Tumoroide sind wertvolle präklinische Modelle und werden häufig als Drogenscreening-Tool eingesetzt. Diese Methode kann angewendet werden, um die pharmakologischen Wirkungen mehrerer Verbindungen auf das Tumorwachstum und die umgebende Mikroumgebung zu untersuchen.

Der Prozess der Sphäroidbildung ist benutzerfreundlich und erfordert herkömmliche Zellkultur-Laborgeräte. Sphäroide können mit jedem inversen Lichtmikroskop auf dem Tisch abgebildet werden, und die Analyse der Sphäroidgröße und -form kann mit einer weit verbreiteten Online-Bildanalysesoftware durchgeführt werden. Entfernen Sie zunächst Huh7- und Hep3B-HCC-Tumorzelllinien sowie COS-7- und LX2-Fibroblastenzelllinien aus ihrem Lagergestell in flüssigem Stickstoff und tauen Sie sie schnell auf.

Nach dem Auftauen die aufgetauten Zellen mit zwei Millilitern frischem Kulturmedium verdünnen. Zentrifugieren Sie die Zellen. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter frischem Warmkulturmedium.

Dann säen Sie die Zellen in T75-Zellkulturflaschen und inkubieren Sie sie in einem Zellkultur-Inkubator, bis die Zellen 60 bis 70 & Konfluenz erreichen. Zur Zellsammlung das Kulturmedium absaugen und die Zellen dreimal mit PBS waschen. Dann, um die adhäsiven Zellen vom Boden der Kolben zu lösen, fügen Sie zwei Milliliter vorgewärmtes Trypsin hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius.

Nach vier Minuten inaktivieren Sie das Trypsin, indem Sie vier Milliliter vollständiges Kulturmedium hinzufügen und die Zellsuspension sammeln, dann die Zellen zentrifugieren und den Überstand verwerfen, bevor Sie die Zellen in einem Milliliter frischem Kulturmedium wiederverwenden. Zum Schluss fügen Sie weitere drei Milliliter frisches Kulturmedium hinzu. Um die Zellen zu zählen, wirbeln Sie die Zellsuspension vorsichtig.

Mischen Sie dann mit einer 10-Mikroliter-Pipette 10 Mikroliter der Zellsuspension mit 10 Mikrolitern Trypanblau und pipettieren Sie die Mischung viermal vorsichtig nach oben und unten, um eine vollständige Färbung der äußeren Zelloberfläche mit dem Farbstoff zu gewährleisten. Als nächstes legen Sie einen Deckglas über den Hämozytometer-Zählbereich. Legen Sie dann die Pipettenspitze mit der Zellmischung neben den Rand des Deckglases und stoßen Sie den Spitzeninhalt vorsichtig in den Zählschieber aus.

Nachdem Sie einige Minuten gewartet haben, bis sich die Aufschlämmung gelegt hat, befestigen Sie das Hämozytometer auf dem Mikroskoptisch und zählen Sie die Zellen, die die obere oder die rechte Entscheidung überlappen, während Sie vermeiden, dass sich die untere oder die linke Entscheidung überschneidet. Berechnen Sie schließlich die Gesamtzahl der Zellen mit dieser Formel. Nach dem Absaugen des Kulturmediums waschen Sie die LX2-Zellen dreimal mit PBS.

Lösen Sie die Zellen mit Trypsin wie zuvor gezeigt und zentrifugieren Sie sie. Nachdem Sie die Zellen wie zuvor gezeigt gezählt haben, säen Sie einmal 10 bis zur sechsten LX2-Zelle in 10 Kubikzentimeterschalen und inkubieren bei 37 Grad Celsius. Sammeln Sie nach 48 Stunden das fibroblastenkonditionierte Medium und zentrifugieren Sie, um alle schwimmenden Zellen zu pelletieren.

Filter sterilisieren Sie das konditionierte Medium mit einem 0,22-Mikron-Filter, der an einer 20-Milliliter-Spritze befestigt ist. Dann aliquotieren Sie das Medium in zwei Milliliter-Röhrchen zur Lagerung bei minus 80 Grad Celsius. Fügen Sie 10 Milliliter steriles PBS auf den Boden einer 10 Kubikzentimeter schüssel hinzu, um feuchte Bedingungen für die Sphäroide zu schaffen.

Dann suspendieren Sie 1.500 HuH7 HCC-Zellen mit 1.500 COS-7-Säugetierfibroblastenzellen in hängenden Tröpfchen, um Kugeln zu bilden. Drehen Sie den Deckel der Schüssel um, damit das Medium, einschließlich der Zellsuspension, über einer feuchten Umgebung hängen kann. Nach drei Tagen, um Bilder der Sphäroide zu machen, stellen Sie die Schüssel auf die Bühne eines inversen Mikroskops und stellen Sie die Vergrößerung auf das Fünffache ein.

Öffnen Sie als Nächstes die Mikroskopsoftware auf dem angeschlossenen Computer und passen Sie den Fokus an, um ein klares Bild von jedem Sphäroid zu erhalten. Verwenden Sie dann das Schnappwerkzeug der Mikroskopsoftware, um die Bilder zu erfassen und die aufgenommenen Bilder zu speichern. Fügen Sie 10 Milliliter steriles PBS auf den Boden einer 10 Kubikzentimeter schüssel hinzu.

Suspendieren Sie dann 3.000 Hep3B HCC-Zellen in den hängenden Tröpfchen, um Kugeln zu bilden, und drehen Sie den Deckel der Schüssel um, so dass die Tröpfchen drei Tage lang über einer feuchten Umgebung hängen können. Als nächstes übertragen Sie die Hep3B-Sphäroide in 20 Mikroliter frischer Zustandsmedien aus LX2-Zellen in hängenden Tröpfchen. Drehen Sie dann den Deckel der Schale, auf der sich die Sphäroide bilden, um und befestigen Sie den Deckel auf der Bühne eines Lichtmikroskops.

Passen Sie den Feinfokus des Mikroskops an, um jedes Sphäroid wie zuvor gezeigt sichtbar zu machen. Nachdem Sie die Kolbentaste gedrückt haben, um die Luft vorsichtig aus der Mikropipette zu entleeren, führen Sie die Pipettenspitze in das Tröpfchen ein, das das zu übertragende Sphäroid enthält. Kommen Sie dem Sphäroid sehr nahe, ohne es mit der Spitze zu berühren.

Als nächstes lassen Sie den Druck auf den Kolbenknopf vorsichtig los, um das Absaugen des Sphäroides in die Mikropipettenspitze in zwei Mikroliter Medien zu ermöglichen. Dann übertragen Sie das Sphäroid in ein neues Tröpfchen, das an einer neuen 10 Kubikzentimeter Schüssel hängt. Nehmen Sie Bilder der Sphäroide mit fünffacher Vergrößerung mit einem inversen Mikroskop vom Tag des Transfers bis zum siebten Tag der Kultur in den LX2-konditionierten Medien auf.

Um die Bilder der wachsenden Sphäroide zu analysieren, öffnen Sie jedes Sphäroidbild in einer Bildanalysesoftware und verwenden Sie das Freihandauswahlwerkzeug, um jedes Sphäroid zu umreißen. Wählen Sie dann in der Dropdown-Schaltfläche Analyse die Option Messung einstellen, gefolgt von Bereich, und drücken Sie OK. Zeichnen Sie als Nächstes manuell einen Kreis um jedes Sphäroid, und sobald die Kugel eingekreist ist, drücken Sie Strg M, damit das Programm den Sphäroidbereich in Pixeln berechnen kann. Konvertieren Sie dann die Fläche des Sphäroids mit dieser Formel in ein Volumen.

Berechnen Sie schließlich die Änderung des Sphäroidvolumens relativ zu seinem Volumen am ersten Tag der Bildaufnahme. Während der Optimierung der Zelldichte für die Sphäroidbildung ergaben höhere Seeding-Dichten von 12.000 und 6.000 Zellen Sphäroide mit einer asymmetrischen Form, während eine Seeding-Dichte von 3.000 Zellen ein perfektes abgerundetes 3D-Sphäroid ergab. So wurden 3.000 Sphäroide der Zelldichte für weitere Experimente angepasst.

Die longitudinale Beurteilung der proliferativen Wirkung von co-kultivierenden Tumor- und Fibroblastenzelllinien zeigte, dass heterotypische Sphäroide ab dem vierten Tag im Vergleich zu homotypischen Sphärooiden in einer idealen runden Form wuchsen. Heterotypische Sphäroide zeigten zunächst eine schnelle Wachstumsphase vom vierten bis zum siebten Tag, gefolgt von einer langsameren Phase am achten Tag. Das Sphäroidvolumen nahm dann an den Tagen neun und 10 ab, was möglicherweise die Erschöpfung der Nährstoffe oder einen hypoxischen Kern und Zelltod widerspiegelt.

Im Gegensatz dazu zeigten die homotypischen Sphäroide bis zum fünften Tag eine relativ statische Wachstumskurve, gefolgt von einer allmählichen Zunahme ihrer Wachstumskurven ab dem sechsten Tag. Die höhere Wachstumsrate von heterotypischen Sphäroiden deutet darauf hin, dass der direkte Kontakt zwischen Tumor und Fibroblasten die Größe der Tumorsphäroide erhöht. Wenn drei Tage alte homotypische Hep3B-Sphäroide in frischen Medien gezüchtet wurden, bildeten die Zellen nach drei Tagen perfekt abgerundete Sphäroide und zeigten eine fortgesetzte Proliferation bis zum siebten Tag.

Die Wachstumsrate wurde erhöht, wenn Sphäroide in LX2-konditionierten Medien aufrechterhalten wurden, was auf eine fibroblastengetriebene Proliferation von Tumorsphäroiden hindeutet. Es ist wichtig sicherzustellen, dass das sterile BBS auf den Boden des Geschirrs gegeben wird, um einen geeigneten feuchten Zustand für die Sphäroidbildung aufrechtzuerhalten. Seien Sie auch vorsichtig beim Umkehren des Deckels, damit die Sphäroide und die Tröpfchen nicht gestört werden.

3D-Tumorsphäroide können fixiert oder eingefroren und für zukünftige Anwendungen wie Immunchemie oder Immunfluoreszenz sowie RNA-Extraktion für die transkriptomische Analyse gelagert werden. Heterotypische Sphäroide mit vormarkierten Zellen können abgebildet und verfolgt werden, um Einblicke in die Zell-Zell-Interaktionen innerhalb der Tumormikroumgebung zu geben.