Name: Ein dreidimensionales Sphäroidmodell zur Untersuchung der Tumor-Stroma-Wechselwirkung bei hepatozellulären Karzinomen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Erfahren Sie, wie man 3D-Tumorsphäroide mit der Hängenden-Tropfen-Methode erstellt, um Tumor-Stroma-Wechselwirkungen bei hepatozellulären Karzinomen zu untersuchen. Diese kostengünstige Technik ermöglicht reproduzierbare In-vitro-Modelle für die Krebsforschung.

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MYWZ wird vom Secretary of State for Business, Energy and Industrial Strategy und dem Newton Prize 2020 als Teil der offiziellen Entwicklungshilfe "ODA" und des Newton-Fonds des Vereinigten Königreichs finanziert. SS wird durch das Cancer Research UK Advanced Clinician Scientist Fellowship C53575 / A29959 unterstützt. SS, FO und HR erhalten Eine Finanzierung im Rahmen von HUNTER, die durch eine Partnerschaft zwischen Cancer Research UK, der Fondazione AIRC und der Fundacion Cientifica de la Asociacion Espanola Contra el Cancer finanziert wird.

1. Zellpräparation
<ol><li>Führen Sie alle Experimente unter sterilen Bedingungen in einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank mit laminarem Durchfluss der Klasse II durch (siehe Materialtabelle).<ol>
<li>Schalten Sie die Haube ein und ermöglichen Sie die Stabilisierung des Luftstroms.</li>
		<li>Besprühen Sie die innere Haubenoberfläche gründlich mit 70% Ethanol, um mögliche Verunreinigungen durch frühere Benutzer zu vermeiden.</li>
		<li>Bereiten Sie 5% einer Desinfektionslösung in einem 500 ml Glasbecher vor. Verwerfen Sie alle Zellüberstände oder Zelltrümmer in der Lösung.</li>
		<li>Reinigen Sie alle Mikropipetten und Kippboxen gründlich mit 70% Ethanol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie frische Zellkulturmedien vor, indem Sie Dulbeccos modifiziertes Eagle's Medium (DMEM) Hochglukosemedium mit 10% hitzedeaktiviertem fetalem Rinderserum (FBS), 1% Penicillin/Streptomycin (100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin) und 2 mM L-Glutamin ergänzen. Reduzieren Sie für die LX2-hepatische Sternzelllinie die Konzentration des FBS-Supplements auf 2%.</li>
	<li>Warme Nährmedien vor Beginn des Experiments.</li>
	<li>Nehmen Sie Huh7 und Hep3B HCC-Tumorzelllinien und COS7- und LX2-Fibroblastenzelllinien aus ihrem Lagergestell in flüssigem Stickstoff. Kryokonservierte Zellen schnell auftauen.</li>
	<li>Aufgetaute Zellen mit 2 ml frischem Kulturmedium verdünnen. Zentrifugieren Sie Zellen bei 200 x g für 4 min bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in 1 ml frischem Warmkulturmedium.</li>
	<li>Samenzellen im T75-Zellkulturkolben. Inkubieren Sie die Zellen in einem Zellkulturinkubator in 5% CO2 bei 37 °C unter 95% befeuchteten Bedingungen, bis die Zellen 60% -70% Konfluenz erreichen.</li>
</ol>2. Zellsammlung
<ol><li>Nährmedien ansaugen und Zellen dreimal mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) waschen.</li>
	<li>Fügen Sie 2 ml vorgewärmtes 1x Trypsin hinzu, um adhärente Zellen vom Boden der T75-Kolben zu lösen. Bei 37 °C in einem Inkubator für 4 min inkubieren.</li>
	<li>Inaktivieren Sie Trypsin, indem Sie 4 ml vollständiges Kulturmedium hinzufügen. Sammeln Sie die Zellsuspension und zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 4 min bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie die Zellen in 4 ml frischen Kulturmedien.</li>
</ol>3. Zellzählung
<ol><li>Wirbeln Sie die Zellsuspension vorsichtig, um eine homogene Verteilung der Zellen im Zentrifugenröhrchen zu gewährleisten.</li>
	<li>Mischen Sie mit einer 10 μL Pipette 10 μL Zellsuspension mit 10 μL Trypanblau. Pipettieren Sie die Mischung viermal vorsichtig nach oben und unten, um eine vollständige Färbung der äußeren Zelloberfläche mit dem Farbstoff zu gewährleisten.</li>
	<li>Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer.<ol>
<li>Legen Sie zunächst einen Deckglas über den Zählbereich des Hämozytometers, bevor Sie die gefärbte Zellsuspension laden.</li>
		<li>Legen Sie die Pipettenspitze mit der Zellsuspension in die V-Nut des Hämozytometers. Stoßen Sie den Spitzeninhalt vorsichtig in die Zählfolie aus.</li>
		<li>Lassen Sie die Aufschlämmung einige Minuten ruhen, bevor Sie sie für die Zellzählung auf dem Mikroskoptisch fixieren. HINWEIS: Um Doppelzählungen zu vermeiden, zählen Sie nur die Zellen auf den beiden Seiten des großen Quadrats.</li>
		<li>Zählen Sie in Zellen, die die obere oder die rechte Linie überlappen, und vermeiden Sie diejenigen, die sich mit der unteren oder der linken Linie überschneiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen. HINWEIS: Zellzahl pro ml = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62868/62868eq01.jpg">
</li>
</ol>4. Sammlung von fibroblastenkonditionierten Medien (CM)
<ol><li>Saugen Sie Kulturmedien ab und waschen Sie die LX2-Zellen dreimal mit PBS.</li>
	<li>Fügen Sie 2 ml vorgewärmtes 1x Trypsin hinzu, um adhärente Zellen vom Boden der T75-Kolben zu lösen. Den Kolben bei 37 °C in einem Inkubator für 4 min inkubieren.</li>
	<li>Inaktivieren Sie Trypsin, indem Sie 4 ml vollständiges Kulturmedium hinzufügen. Sammeln Sie die Zellsuspension und zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 4 min bei Raumtemperatur. Zählen Sie die Zellen gemäß Schritt 3.</li>
	<li>Säen Sie 1 x 106 LX2 Zellen in 10 cm3 Schalen für 48 h bei 37 °C.</li>
	<li>Sammeln Sie den Fibroblasten CM nach 48 h. Zentrifugieren Sie bei 200 x g für 4 min bei Raumtemperatur, um schwimmende Zellen zu pelletieren. Steriler Filter des CM mit einem 0,22 μm Filter, der auf dem Boden von 20 ml Spritzen befestigt ist.</li>
	<li>Sammeln Sie den Überstand CM. Aliquotieren Sie den CM in 2 ml Röhrchen und lagern Sie ihn bei -80 °C für weitere Anwendungen. HINWEIS: Die Lösung kann 6 Monate bei -80 °C gelagert werden.</li>
</ol>5. Validierung von Zelldichten für perfekte Sphäroide
<ol><li>Saugen Sie Kulturmedien ab und waschen Sie die HCC-Zelllinien dreimal mit PBS.</li>
	<li>Fügen Sie 2 ml vorgewärmtes 1x Trypsin hinzu, um adhärente Zellen vom Boden der T75-Kolben zu lösen. Bei 37 °C in einem Inkubator für 4 min inkubieren.</li>
	<li>Inaktivieren Sie Trypsin, indem Sie 4 ml vollständiges Kulturmedium hinzufügen. Sammeln Sie die Zellsuspension und zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 4 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen gemäß Schritt 3.</li>
	<li>Pipettieren Sie verschiedene Dichten aus den Tumorzelllinien (12000, 6000, 3000, 1500, 1000, 750, 500, 250 und 125 Zellen) in 20 μL Medien auf der Innenfläche eines 10 cm3 großen Deckels einer Petrischale.</li>
	<li>Fügen Sie 10 ml steriles PBS auf den Boden der Schale hinzu, um feuchte Bedingungen für den Prozess der Sphäroidbildung zu schaffen.</li>
	<li>Drehen Sie den Deckel der 10 cm3 großen Schüssel um, damit das Medium, einschließlich der Zellsuspension, über einer feuchten Umgebung hängen kann. Lassen Sie die hängenden Tröpfchen für 3 Tage.</li>
	<li>Machen Sie Bilder der Sphäroide mit 50-facher Vergrößerung mit einem inversen Mikroskop 3 Tage nach dem Aufhängen der ursprünglichen Tröpfchen.</li>
</ol>6. Heterotypischer Tumor/Stroma-Sphäroide
<ol><li>Suspendieren Sie 1500 Huh7 HCC-Zellen mit 1500 COS7-Säugetierfibroblastenzellen (Verhältnis 1: 1) in hängenden Tröpfchen, um Kugeln zu bilden. Fügen Sie 10 ml steriles PBS auf den Boden der Schüssel hinzu, um feuchte Bedingungen für die Sphäroide zu schaffen.</li>
	<li>Drehen Sie den Deckel der 10 cm3 großen Schüssel um, damit das Medium, einschließlich der Zellsuspension, über einer feuchten Umgebung hängen kann. Lassen Sie die hängenden Tröpfchen für 3 Tage.</li>
	<li>Machen Sie Bilder der Sphäroide mit einem inversen Mikroskop von Tag 3 bis Tag 10 der Kultur.<ol>
<li>Stellen Sie die 10 cm3 Schale auf das Mikroskoptisch. Stellen Sie die Vergrößerung des Mikroskops für alle Sphäroide auf das 50-fache ein.</li>
		<li>Öffnen Sie die Mikroskopsoftware auf dem angeschlossenen Computer und passen Sie den Fokus an, um ein klares Bild von jedem Sphäroid zu erhalten. Verwenden Sie das Capture Tool in der Mikroskopsoftware, um die aufgenommenen Bilder zu speichern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Homotypische Hep3B-Sphäroide in LX2 CM
<ol><li>Suspendieren Sie 3000 Hep3B HCC-Zellen in den hängenden Tröpfchen, um Kugeln zu bilden. Fügen Sie 10 ml steriles PBS auf den Boden der Schüssel hinzu, um feuchte Bedingungen für die Sphäroide zu schaffen.</li>
	<li>Drehen Sie den Deckel der 10 cm3 großen Schüssel um, damit das Medium, einschließlich der Zellsuspension, über einer feuchten Umgebung hängen kann. Lassen Sie die hängenden Tröpfchen für 3 Tage.</li>
	<li>Übertragen Sie Hep3B-Sphäroide in 20 μL frisches CM aus LX2-Zellen in hängenden Tröpfchen. HINWEIS: Verwenden Sie sterile autoklavierte ungefilterte 200 μL-Pipettenspitzen beim Sphäroidtransfer, um störungen oder verletzungen der gebildeten Sphäroide zu vermeiden. Dies dient auch dazu, alle verbleibenden Zellen zu eliminieren, die nicht an das einzelne Hauptsphäroid gebunden bleiben.<ol>
<li>Verwenden Sie eine autoklavierte 20-μL-Pipette für den Transferprozess. Stellen Sie das Pipettenvolumen auf 2 μL ein. Befestigen Sie die Pipettenspitze an der Pipette.</li>
		<li>Kehren Sie den Deckel der 10 cm3 großen Schale um, auf der die Sphäroide gebildet wurden. Befestigen Sie den Deckel auf der Bühne eines Lichtmikroskops. Stellen Sie den Feinfokus des Mikroskops ein, um jedes Sphäroid sichtbar zu machen.</li>
		<li>Entleeren Sie die Luft vorsichtig aus der Mikropipette, indem Sie die Kolbentaste drücken. Setzen Sie die Pipettenspitze in das Tröpfchen ein, einschließlich des zu übertragenden Sphäroides. Kommen Sie dem Sphäroid sehr nahe, ohne es mit der Spitze zu berühren.</li>
		<li>Lassen Sie den Druck auf den Kolbenknopf vorsichtig los, um das Absaugen des Sphäroides in die Mikropipettenspitze in 2 μL Medien zu ermöglichen.</li>
		<li>Übertragen Sie das Sphäroid in ein neues Tröpfchen, das an einer neuen 10 cm3 Schale hängt, mit neuen Medien / konditionierten Medien / Behandlung. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Sphäroide mit dem Lichtmikroskop erfolgreich auf die neue 10 cm3 Schale übertragen werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nehmen Sie Bilder der Sphäroide mit 50-facher Vergrößerung mit einem inversen Mikroskop vom Tag des Transfers (Tag 3) bis Tag 7 der Kultur in LX2 CM auf.</li>
</ol>8. Berechnung des Sphäroidvolumens
<ol><li>Weisen Sie jedem Sphäroid eine eindeutige numerische Kennung zu, damit Bilder von übereinstimmenden Sphäroiden täglich erfasst werden können.</li>
	<li>Analysieren Sie Bilder der wachsenden Sphäroide mit einem Bildanalyse-Softwarepaket.<ol>
<li>Öffnen Sie jedes Sphäroidbild innerhalb des Softwarepakets. Verwenden Sie das Freihand-Auswahlwerkzeug und umreißen Sie jedes Sphäroid. Wählen Sie in der Dropdown-Schaltfläche Analyse die Option Messung festlegen und dann Bereich aus. Drücken Sie OK.</li>
		<li>Zeichnen Sie manuell einen Kreis um jedes Sphäroid. Sobald die Kugel eingekreist ist, drücken Sie Strg + M , damit das Programm den Sphäroidbereich in Pixel berechnen kann. Wandeln Sie die Fläche des Sphäroids in ein Volumen um. HINWEIS: Volumen des Sphäroidsmm3 = 0,09403 × <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62868/62868eq02.jpg">
</li>
		<li>Berechnen Sie die Änderung des Sphäroidvolumens relativ zu seinem Volumen am ersten Tag der Bildaufnahme. HINWEIS: Dies dient dazu, das Sphäroidvolumen auf das Startvolumen zu normalisieren und die Genauigkeit angesichts der natürlichen Variation der Startgröße zu verbessern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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FO ist Direktor und Aktionär von Fibrofind Limited.

Der Kontext, in dem die experimentellen Zelllinien wachsen, beeinflusst ihr Genexpressionsprofil, ihre Signalweganalyse und ihre funktionellen Kriterien. In Brustkrebszellen beispielsweise bleibt die Koordination zwischen verschiedenen onkogenen Signalwegen nur erhalten, wenn Krebszellen in 3D-Konformation gezüchtet werden27. Deregulierte Gene in 3D-Melanomen und Brustkrebs-Sphäroiden, aber nicht in den Monolayer-Zellen, sind für den menschlichen In-vivo-Tumor relevanter28,29. Zum Beispiel waren die β1-Integrinspiegel in Brustepithelzellen und Tumorgegenstücken niedriger als die in einem 2D-Format gezüchteten Spiegel29. Darüber hinaus neigen Fibroblasten in 3D-Strukturen dazu, in Bezug auf Morphologie und Geschwindigkeit deutlich zu migrieren, verglichen mit denen, die auf Kunststoff kultiviert werden30. Darüber hinaus aktiviert die mechanische Steifigkeit des Wachstumssubstrats spezifische Signalwege, die die maligne Transformation normaler Epithelzellen durch Deregulation der extrazellulären signalregulierten Kinase (ERK)/Rho in Epithelzellen fördern31. Diese Faktoren begünstigen den Übergang von der konventionellen 2D-Kultur zu 3D-Sphäroidmodellen, da 3D-Kulturen eher mit menschlichen Krankheiten übereinstimmen.
Die aktuelle Studie verwendete herkömmliche Laborwerkzeuge und -zubehör, um ein 3D-Tumor-Sphäroidmodell zu erstellen. Die gebildeten Sphäroide reagierten auf die Proliferationssignale von Fibroblasten, wie ihr signifikant erhöhtes Wachstum zeigt. Dieses Modell gehört zur Kategorie der mehrzelligen Tumorsphäroide. Es gibt drei weitere Kategorien von 3D-Tumorsphäroiden, darunter Tumorosphären32, gewebeabgeleitete Tumorkugeln33,34 und organotypische mehrzellige Sphäroide35. In mehrzelligen Tumorsphäroiden werden Tumorzellen unter Bedingungen mit geringer Adhäsion suspendiert, damit sie sich zu Kugeln zusammenschließen können, ohne den Boden des Kulturgefäßes zu berühren36. Für diese verankerungsunabhängige Technik wurden mehrere Ansätze eingesetzt, die von rotierenden Systemen, Flüssigkeits-Overlay-Techniken bis hin zu unbeschichteten U-förmigen Platten mit extrem niedriger Befestigung reichen37. Bei HCC verwenden die meisten In-vitro-Sphäroidkulturen die 24- oder 96-Well-Platten mit extrem niedriger Bindung, um abgerundete Sphäroide zu bilden18,19,20,21,22. Diese Technik ist jedoch nicht kostengünstig und schließt einen versehentlichen Zell-Kunststoff-Kontakt nicht aus. Andere Systeme verwenden Trans-Wells23 oder Leberschnitte12, um Lebermikrogewebe herzustellen. Die Verwendung von menschlichem Gewebe in translationalen Arbeiten ist der Goldstandard, aber für viele Forschungsgruppen nicht immer verfügbar oder zugänglich. Der aktuelle Ansatz profitierte von der Theorie der hängenden Tröpfchen. Zellsuspension wird hinzugefügt, so dass die Tumorsphäroide in einer zugänglichen Flüssig-Luft-Grenzfläche zu einzelnen abgerundeten Kugeln gebildet werden38. Vorteile der Verwendung dieser Technik sind das Fehlen eines Zell-Kunststoff-Kontakts und die Leichtigkeit, das autokrine und parakrine Übersprechen zwischen Tumor- und Fibroblastenzellen zu untersuchen. Dieses Modell wurde in einer weiteren Studie weiter validiert, in der die Bedeutung des nicht-parenchymalen TREM2 für den Schutz der Leber vor der HCC-Entwicklung entschlüsselt wurde39. Diese Arbeit zeigte, dass das Volumen sowohl von Hep3B- als auch von PLC/PRF5-Sphäroiden in der Kontrolle von LX2 CM höher war als bei TREM2-überexprimierendem LX2 CM in einer Wnt-abhängigen Weise39.
In der aktuellen Studie wurden Fibroblasten vor der Sphäroidbildung mit Tumorzellen gemischt, um die proliferative Wirkung dieser Kokultur zu untersuchen. Andere haben Fibroblasten, Endothelzellen und Immunzellen mit Tumorzellsuspension hinzugefügt, nachdem sie ein Tumorsphäroid gebildet hatten, um die Migration von Stromazellen in den Tumor zu untersuchen40,41. Das aktuelle heterotypische Sphäroidmodell zeigte ein ähnliches Wachstumsmuster wie die zuvor berichteten Modelle und der ursprüngliche In-vivo-Tumor; Sphäroide zeigen ein exponentielles Wachstum, gefolgt von einer verzögerten Wachstumsphase, höchstwahrscheinlich aufgrund der Erschöpfung der Nährstoffe und der Vergrößerung des nekrotischen Kerns42. Anstatt Wachstumsfaktoren und Mitogene hinzuzufügen, um die Sphäroidbildung zu unterstützen, verwendete diese Studie einen physiologischeren Ansatz, indem diese Wachstumsfaktoren aus direktem Kontakt mit Fibroblasten oder ihrem Sekretom im Fibroblasten-CM stammten. Es ist wichtig zu erwähnen, dass LX2-Zellen durch die Behandlung mit TGFβ1 oder PDGF43 weiter aktiviert werden können. LX2-Zellen wurden 48 h lang mit 10 ng/ml TGFβ1 behandelt, bevor das Medium für verschiedene experimentelle Einstellungen entfernt wurde. LX2-Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen (um einen direkten TGFβ1-Effekt auszuschließen), und dann wurden frische Medien für weitere 24 Stunden hinzugefügt, bevor das CM gesammelt wurde. Das aus TGFβ1-stimuliertem LX2 gewonnene CM induzierte das Wachstum der Hep3B-Sphäroide mit einer höheren Rate als das CM aus der Kontrolle LX2 (Daten nicht gezeigt). Dieses flexible System kann sich für Co-Kulturen verschiedener Krebszellen plus/ minus Fibroblasten sowie für von Patienten abgeleitete Linien eignen. Es kann auch einen Screening-Assay mit mittlerem Durchsatz für Medikamente anbieten, der schnell übernommen und in eine translationale Wirkstoffentdeckungspipeline eingefügt werden könnte, um die Dosierung für In-vivo-Studien zu informieren.
Eine Einschränkung der aktuellen Studie ist die Verwendung der immortalisierten Zelllinien bei der Sphäroidbildung anstelle von frisch isolierten HCC-Tumorzellen und krebsassoziierten Fibroblasten. Eine weitere Einschränkung ist der Vergleich des wachstums des homotypischen Hep3B-Sphäroides zwischen CM aus LX2 und in frischen Medien anstelle von CM aus anderen Nicht-Fibroblasten-Zelllinien. Die letztgenannte Einschränkung könnte durch die genetische Veränderung eines Gens von Interesse in den Fibroblasten behoben werden, gefolgt von der Anwendung des CM vom Wildtyp gegenüber dem gentechnisch veränderten Fibroblasten auf homotypische Sphäroide.

Die weltweite Inzidenz und Mortalität durch Leberkrebs hat trotz Fortschritten bei der Behandlung von Lebererkrankungen und den meisten anderen Krebsarten weiter zugenommen. Im Jahr 2018 übertraf Leberkrebs Darm- und Magenkrebs und wurde weltweit zur zweithäufigsten krebsbedingten Todesursache1. Im Jahr 2020 gab es mehr als 9.00.000 neue Diagnosen, was 4,7% der gesamten Krebsfälle weltweit ausmacht1. Dies ist besonders enttäuschend, da die signifikanten Risikofaktoren für die Entwicklung von HCC, der häufigsten Form von Leberkrebs, gut charakterisiert sind2. Zirrhose ist der häufigste Risikofaktor für die Entwicklung von HCC, wobei sich 80% der Fälle vor dem Hintergrund einer etablierten Zirrhose entwickeln2. Zu den chronischen Lebererkrankungen, die zur Zirrhose und damit zum HCC führen, gehören das Hepatitis-B-Virus (HBV), das Hepatitis-C-Virus (HCV), die alkoholbedingte Lebererkrankung (ARLD), die nichtalkoholischen Fettlebererkrankungen (NAFLD) - letztere werden auf Fettleibigkeit und Typ-2-Diabetes mellitus (T2DM) zurückgeführt2,3. Die aktuellen Managementprotokolle für HCC sind stadiumsabhängig und für Patienten mit fortgeschrittenem Krebs, die am häufigsten ein schlechtes Ergebnis haben4, begrenzt. Es gab bedeutende Fortschritte bei der Verwendung von Kinasehemmern und in jüngster Zeit bei immunonkologischen Behandlungen, obwohl realistisch gesehen nur eine Minderheit der Patienten mit fortgeschrittenem Leberkrebs davon profitieren5. Darüber hinaus besteht die Befürchtung, dass HCCs, die bei Patienten mit NAFLD auftreten - der am schnellsten wachsenden zugrunde liegenden Ursache, die mehr als 50% der neu diagnostizierten HCC-Fälle in westlichen Ländern ausmacht - gegen die Checkpoint-Inhibitor-Therapie mit programmiertem Tod 1 (PD1) resistenter sein könnten6.
Es wurde massiv in klinische Studien für Patienten mit HCC investiert, einschließlich signifikanter Verbesserungen bei klinischen Studien und ihren Endpunkten7. Nach einem Jahrzehnt des Scheiterns haben diese Investitionen begonnen, die Möglichkeiten für Patienten zu verändern. Die Realität ist jedoch, dass der Gesamtanteil der Responder nach wie vor relativ gering ist, wobei Patienten, die in Studien rekrutiert werden, oft schlecht die in den Kliniken betreuten Patienten repräsentieren. Die Gefahr besteht darin, dass die Fortschritte kostspielig sind und eher den Wenigen als den Vielen zugute kommen. Da immer mehr Therapiekandidaten für den einmaligen Gebrauch oder eine Kombination entstehen, ist es wichtig, präklinische Modelle zu haben, die die In-vivo-Reaktionen besser vorhersagen. Dabei handelt es sich wahrscheinlich um Modelle, die zusätzliche Faktoren einbeziehen, die zur Variabilität der Patientenreaktionen beitragen, die die menschliche HCC-Heterogenität und pathologische Komplexität besser widerspiegeln8. Systeme, die die pathophysiologischen In-vivo-Bedingungen von HCC nachbilden, werden benötigt, um die Biologie der Tumorevolution, des Wachstums und der Progression zu verstehen. Die bestehenden experimentellen Modelle für chronische Lebererkrankungen und HCC fallen in der Regel in drei Hauptkategorien: in vivo tierbasierte Modelle (überprüft in 9), In-vitro-Kulturen10 und ex vivo11,12-Modelle. Tierbasierte Ansätze werden häufig verwendet, um chronische Lebererkrankungen, einschließlich HCC, zu untersuchen. Die genetische Variabilität, die hohen Betriebskosten und das unterschiedliche Immunsystem zwischen den Arten gehören jedoch zu den Haupteinschränkungen für die Anwendung solcher Modelle9. Während einige Ex-vivo-Modelle im Vergleich zu anderen In-vitro-Zelllinienmodellen ein hervorragendes Werkzeug für die Fokussierung auf menschliches Gewebe bieten, behindern die Gewebeverfügbarkeit und der begrenzte experimentelle Zeitverlauf ihre Nutzung in großem Maßstab.
Auf der anderen Seite bleiben die In-vitro-Zelllinienmodelle eine gute Option für Wissenschaftler, die mit begrenzten Ressourcen arbeiten, mit einem geringeren Bedarf an einer konstanten Versorgung mit frischem menschlichem Gewebe10. Diese Modelle bieten auch ein Werkzeug, das als erster Screen verwendet werden kann, um bei der Zielvalidierung der Arzneimittelauswahl zu helfen, bevor komplexere In-vivo-Modelle verwendet werden. Die jüngste Modifikation der traditionellen 2D-Monoschichtkulturen in 3D-Kulturen hat die Wirksamkeit dieser In-vitro-Modelle verbessert13,14.
3D-In-vitro-Modelle können kritische Merkmale rekapitulieren, die unter normalen und pathologischen Bedingungen beim Menschen beobachtet wurden. Unter physiologischen Bedingungen wird die Signaltransduktion durch zelluläres Übersprechen und Interaktion mit anderen Bindegewebsmolekülen, nämlich den Proteinen der extrazellulären Matrix (ECM), initiiert und bildet ein 3D-Interaktionsnetzwerk15,16. Der Tumor entwickelt sich in einer 3D-kugelförmigen Form während der malignen Transformation, für die Sauerstoff und Nährstoffe in der Nicht-Tumor/Tumor-Interphase leicht reichlich vorhanden sind. Gleichzeitig überwiegen hypoxische Zustände am Tumorkern. Diese Heterogenität in der Nährstoffverfügbarkeit führt zur Aktivierung räumlich unterschiedlicher Signal- und Stoffwechselwege, die die Tumorgenese regulieren. Diese Bedingungen sind in den herkömmlichen 2D-Monolayer-Kulturen14, in denen Zellen auf steifem Kulturplastik in physiologisch irrelevanter Weise wachsen, schlecht rekapituliert. Krebszellen kommunizieren auch mit anderen nicht-parenchymalen Zellen, der primären Quelle von ECM, Wachstum und Invasionssignalen innerhalb der Tumormikroumgebung. Im Gegensatz zu 2D-Kulturen können 3D-In-vitro-Modelle eine geeignetere Plattform bieten, um diese Tumor-Stroma-Interaktion zu untersuchen17.
3D-Modelle sind im HCC-Bereich weit verbreitet und unterscheiden sich in der Art und Weise, wie das Mikrogewebe gebildet wird18,19,20,21,22,23. Die meisten dieser Modelle verwendeten entweder die extrem niedrigen Bindungsplatten18,19,20,21,22 oder Trans-Wells23 im Prozess der Sphäroidbildung. Das beschriebene Protokoll führt die Hängetröpfchentechnik als alternatives, plastikfreies und kostengünstiges in vitro 3D-Tumorsphäroidmodell ein. Dies kann die Beurteilung der parakrinen und autokrinen Rolle von Fibroblasten bei der Proliferation der Tumorzellen im 3D-Format erleichtern.

<table><tbody><tr><td>1x Trypsin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59429C</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biorender</td><td>Biorender.com</td><td>Online</td><td></td></tr><tr><td>Klasse II Laminar Flow BioMAT2 Haube</td><td>Medair Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s modifizierter Eagle" s Medium (DMEM)</td><td>Biosera</td><td>M-D1107</td><td></td></tr><tr><td>Excel Software</td><td>Microsoft Office 365</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism Software</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hitzedeaktiviert fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Life Tech</td><td>105000064</td><td></td></tr><tr><td>Image J Software</td><td>Fiji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (100 Einheiten/ml Penicillin und 100 &mu; g/ml Streptomycin)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale 90 mm, dreifach belüftet</td><td>Greiner</td><td>633175</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blau</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Virkon&trade; Breitspektrum-Desinfektionsmittel, 5kg Eimer</td><td>Rely+On&Trade;</td><td>SCI-129999</td><td></td></tr><tr><td>Ziess inverses Mikroskop</td><td>Ziess</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ein dreidimensionales sphäroidmodell zur untersuchung der tumor-stroma-wechselwirkung bei hepatozellulären karzinomen

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

Die Aggressivität und das Fehlen gut verträglicher und breit wirksamer Behandlungen für das fortgeschrittene hepatozelluläre Karzinom (HCC), die vorherrschende Form von Leberkrebs, rationalisieren seinen Rang als zweithäufigste Ursache für krebsbedingte Todesfälle. Präklinische Modelle müssen angepasst werden, um die menschlichen Bedingungen zu rekapitulieren, um die besten therapeutischen Kandidaten für die klinische Entwicklung auszuwählen und die Bereitstellung personalisierter Medizin zu unterstützen. Dreidimensionale (3D) zelluläre Sphäroidmodelle sind vielversprechend als aufstrebende In-vitro-Alternative zu zweidimensionalen (2D) Monoschichtkulturen. Hier beschreiben wir ein 3D-Tumor-Sphäroidmodell, das die Fähigkeit einzelner Zellen zur Aggregation nutzt, wenn sie in hängenden Tröpfchen gehalten werden, und repräsentativer für eine In-vivo-Umgebung ist als Standard-Monoschichten. Darüber hinaus können 3D-Sphäroide durch die Kombination homotypischer oder heterotypischer Zellen hergestellt werden, die die zelluläre Heterogenität in vivo besser widerspiegeln und möglicherweise die Untersuchung von Umweltinteraktionen ermöglichen, die das Fortschreiten und die Behandlungsreaktionen beeinflussen können. Die aktuelle Forschung optimierte die Zelldichte, um homotypische und heterotypische 3D-Tumorsphäroide zu bilden, indem Zellsuspensionen auf den Lidern von Standard-10 cm3-Petrischalen immobilisiert wurden. Die Längsschnittanalyse wurde durchgeführt, um Wachstumskurven für homotypische versus heterotypische Tumor-/Fibroblasten-Sphäroide zu generieren. Schließlich wurde der proliferative Einfluss von Fibroblasten (COS7-Zellen) und Lebermyofibroblasten (LX2) auf homotypische Tumorsphäroide (Hep3B) untersucht. Eine Seeding-Dichte von 3.000 Zellen (in 20 μL-Medien) ergab erfolgreich heterotypische Huh7/COS7-Sphäroide, die bis zum 8. Kulturtag eine stetige Größenzunahme zeigten, gefolgt von einer Wachstumsverzögerung. Dieser Befund wurde unter Verwendung homotypischer Hep3B-Sphäroide bestätigt, die in LX2 (human hepatic stellate cell line) conditioned medium (CM) kultiviert wurden. LX2 CM löste die Proliferation von Hep3B-Sphäroiden im Vergleich zu Kontrolltumorphäroiden aus. Zusammenfassend hat dieses Protokoll gezeigt, dass 3D-Tumorsphäroide als einfaches, wirtschaftliches und vorgescreentes In-vitro-Werkzeug verwendet werden können, um Tumor-Stroma-Interaktionen umfassender zu untersuchen.

Zellen, die in einem mehrschichtigen 3D-Format kultiviert werden, spiegeln die Komplexität der Tumormikroumgebung genauer wider als herkömmliche 2D-Kulturen24,25. Zuvor haben viele Studien die Sphäroid-Kulturmedien mit verschiedenen Mitogenen und Wachstumsfaktoren26 ergänzt, um die Sphäroidbildung einzuleiten. In dieser Studie liefert die Zugabe von Fibroblasten oder deren CM jedoch essentielle Mitogene und Wachstumsfaktoren, um das Sphäroidwachstum zu beschleunigen.
Abbildung 1 zeigt Daten aus einer Pilotstudie, in der Huh7 menschliche HCC-Zellen in einer absteigenden Aussaatdichte von 12.000 bis zu 125 Zellen in 20 μL frischen Medien für 3 Tage ausgesät wurden. Eine Seeding-Dichte von 12.000 Zellen ergab Sphäroide mit einer asymmetrischen Form, die auch nach Halbierung der Zell-Seeding-Dichte nicht korrigiert wurde. Sphäroide, die aus 3000 Zellen hergestellt wurden, erschienen jedoch abgerundeter (Abbildung 1, obere Reihe). Eine weitere Reduktion der Zellkonzentration gelang weder die Bildung einzelner Kugeln (125, 250, 500 Zelldichtekugeln) noch ein regelmäßiges sphärisch ähnliches Aussehen (1000 und 1500 Zelldichte-Sphäroide). Es ist erwähnenswert, dass viele kleine Kugeln mit einer Dichte von 500 Tumorzellen gebildet wurden; Es wurde jedoch nur ein kleines Sphäroid bei 50-facher Vergrößerung eingefangen (Abbildung 1, obere Reihe). Das gleiche optimierte Protokoll wurde auf die COS7-Nierenfibroblasten-Zelllinie des COS7-Primaten angewendet (Abbildung 1, mittlere Reihe). Die Suspendierung von 125, 250 und 500 COS7-Fibroblasten in 20 μL hängenden Tröpfchen führte zu einem abgerundeten Sphäroid mit mehreren kleineren Sphäroide, während höhere Zelldichten (1000, 1500 und 3000) einzelne halbgerundete Sphäroide bildeten. Ähnlich wie bei den Huh7-Tumorsphäroiden führten höhere Zellsuspensionen (6.000 und 12.000 Zellen/Kugel) zur Bildung unregelmäßiger Zellaggregate, wodurch höhere Zellkonzentrationen verworfen wurden (Abbildung 1, mittlere Reihe). Niedrige Dichten von Huh7/COS7-heterotypischen Zellsuspensionen (125, 250 und 500 Zellen/Kugel) erzeugten ein einzelnes Sphäroid mit mehreren schwebenden oder halb angebrachten Sphäroiden (Abbildung 1, untere Reihe). 1000- und 1500-Zell-heterotypische Sphäroide waren halb abgerundet, während eine Seeding-Dichte von 3000 Zellen (1500 pro Zelltyp) ein abgerundetes 3D-Sphäroid ergab. Wie bereits erwähnt, führten höhere Zelldichten zur Bildung von Aggregaten anstelle von klar definierten Sphäroiden (Abbildung 1, untere Reihe). Zusammenfassend wurden 3000 Sphäroide mit Zelldichte gerundet, ähnlich wie menschliche HCC-Tumore, und für weitere Experimente angepasst. Die Kultivierung der Zellsuspensionen als hängende Tröpfchen für 3 Tage reichte aus, um die Sphäroidbildung zu fördern.
Nach der Optimierung der besten Zellkonzentration und des zeitpunkts für die Sphäroidbildung im aktuellen Kontext wurde die proliferative Wirkung von co-kultivierenden Tumor- und Fibroblastenzelllinien longitudinal bewertet. Abbildungen 2 und Abbildung 3 zeigen Huh7/COS7 heterotypische Sphäroide (3000 Gesamtzellzahlen pro Sphäroid), die von Tag 3 bis Tag 10 überwacht werden. Als Kontrollen dienten homotypische Huh7- und COS7-Sphäroide (je 1500 Zellen). Ab Tag 4 wuchsen heterotypische Sphäroide im Vergleich zu homotypischen Sphäroiden in einer idealen runden Form (Abbildung 2). Das Anfangsvolumen des heterotypischen Sphäroids war größer als das jedes homotypischen Sphäroids. Das Wachstum von Sphäroiden wurde als die Änderung ihres Volumens relativ zum Anfangsvolumen am Tag der Sphäroidbildung berechnet, um eine normale Variation des Sphäroidvolumens zu vermeiden (Tag 3, Abbildung 3). Heterotypische Sphäroide zeigten zunächst eine schnelle Wachstumsphase von Tag 4 bis Tag 7, gefolgt von einer langsameren Wachstumsphase an Tag 8 (Abbildungen 2, obere Reihe und Abbildung 3). Das Sphäroidvolumen nahm an den Tagen 9 und 10 ab, was möglicherweise die Erschöpfung der Nährstoffe oder einen hypoxischen Kern und den Zelltod widerspiegelt.
Im Gegensatz dazu wuchsen homotypische Huh7- und COS7-Sphäroide viel langsamer (Abbildung 2, mittlere und untere Reihe; Abbildung 3). Homotypische Sphäroide zeigten bis zum fünften Tag der Kultur (zwei Tage nach der Sphäroidbildung) eine relativ statische Wachstumskurve. Ab Tag 6 zeigten die homotypischen Sphäroide eine allmähliche Zunahme ihrer Wachstumskurve, wenn auch mit einer signifikant niedrigeren Rate als die der heterotypischen Sphäroide (Abbildung 3). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass tumor/ fibroblasten heterotypische Sphäroide mit einer höheren Rate wachsen als homotypische Sphäroide, was darauf hindeutet, dass der direkte Kontakt von Tumorzellen und Fibroblasten die Größe der Tumorsphäroide erhöht.
Um die oben genannten Ergebnisse zu validieren und den parakrinen Einfluss von mesenchymalen Zellen auf die Proliferation von HCC-Sphäroiden in einem leberbezogenen Kontext zu untersuchen, wurden 3 Tage alte homotypische Hep3B HCC-Sphäroide für weitere 4 Tage in normalen frischen Medien oder CM aus LX2-leberförmigen Sternzellen gezüchtet (Abbildung 4 und Abbildung 5). Auf den ersten Blick bildeten 3000 Hep3B-Zellen nach 3 Tagen perfekt abgerundete Sphäroide (Abbildung 4). Hep3B-Sphäroide zeigten eine kontinuierliche Proliferation in frischen Medien von Tag 3 bis Tag 7 (Abbildung 4, obere Reihe). Die Wachstumsrate wurde erhöht, wenn Hep3B-Sphäroide in LX2 CM beibehalten wurden (Abbildung 4, untere Reihe). Diese medienabhängige Umwandlung im Hep3B-Sphäroidwachstum zeigte statistische Signifikanz von Tag 4 bis zum Ende des Experiments (Abbildung 5), was auf eine fibroblastengetriebene Proliferation von Tumorsphäroiden hindeutet.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie die bestehenden 3D-Sphäroidkulturen erfolgreich modifiziert hat, um das Crosstalk zwischen HCC-Tumorzellen und verschiedenen Fibroblastenzelllinien zu nutzen und die proliferative Bedeutung dieser direkten und indirekten zellulären Interaktion zu untersuchen (Abbildung 6). Eine weitere Charakterisierung der gebildeten Sphäroide ist erforderlich, um die Interaktion von Tumorzellen mit der umgebenden Mikroumgebung zu verbessern.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig01.jpg"> Abbildung 1: Optimierung der optimalen Zelldichte für die Sphäroidbildung. Spalten repräsentieren unterschiedliche Zellaussaatdichten, und Zeilen stellen Sphäroide dar, die aus Huh7-Zellen (obere Reihe), COS7-Zellen (mittlere Reihe) und huh7/COS7-heterotypischen Zellen (untere Zeile) gebildet werden. Die Bilder stellen Sphäroide dar, die nach dem Suspendieren von 125, 250, 500, 1000, 1500, 3000, 6000 und 12000 Zellen (von links nach rechts) in 20 μL-Medien für 3 Tage gebildet wurden. Die Pilotstudie umfasste zwei Sphäroide pro Bedingung, und die Bilder wurden mit 50-facher Vergrößerung aufgenommen, Maßstabsbalken = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig02.jpg"> Abbildung 2: Heterotypisches versus homotypisches Sphäroidwachstum. Spalten stellen den Tag dar, an dem Sphäroidbilder aufgenommen wurden, und Zeilen zeigen repräsentative Bilder für Sphäroide, die aus Huh7-Zellen (obere Reihe), COS7-Zellen (mittlere Reihe) und Huh7/COS7-Zellen (untere Reihe) gebildet wurden. Die Bilder stellen die Sphäroide dar, die nach dem Suspendieren von 3000 Zellen aus jeder Bedingung (homotypisches Huh7, COS7 oder die heterotypischen Sphäroide Huh7 / COS7) verschiedener Zeitpunkte von links nach rechts gebildet wurden. Das Experiment umfasste 10 Sphäroide pro Bedingung, und die Bilder wurden mit 50-facher Vergrößerung aufgenommen, Maßstabsbalken = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig03.jpg"> Abbildung 3: Längsschnittanalyse des heterotypischen versus homotypischen Sphäroidwachstums. Die Grafik zeigt die Wachstumskurve von heterotypischen Huh7/COS7-Sphäroiden gegenüber homotypischen Huh7- und COS7-Sphäroiden. Die Daten werden als Mittelwert ± s.e.m dargestellt; n = 10 unabhängige Sphäroide. ** p &lt; 0,01; P &lt; 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig04.jpg"> Abbildung 4: Wachstum homotypischer Hep3B-Sphäroide in LX2 CM. Spalten stellen den Tag dar, an dem Sphäroidbilder aufgenommen wurden, und Zeilen zeigen repräsentative Bilder von Hep3B-Sphäroiden, die in frischen DMEM-Kulturmedien (obere Reihe) oder LX2 CM (untere Reihe) kultiviert wurden. Das Experiment umfasste sieben Sphäroide pro Bedingung (frische Medien oder LX2 CM), und die Bilder wurden mit 50-facher Vergrößerung aufgenommen, Maßstabsbalken = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig05.jpg"> Abbildung 5: Längsschnittanalyse des homotypischen Hep3B-Sphäroidwachstums. Die Grafik zeigt die Wachstumskurve von Hep3B-Sphäroiden in frischen DMEM-Kulturmedien oder LX2 CM. Die Daten werden als Mittelwert ± s.e.m dargestellt; n = 7 unabhängige Sphäroide. P &lt; 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62868/62868fig06.jpg"> Abbildung 6: Schematische Darstellung des Sphäroidbildungsprozesses. Die Zellsuspension wird auf dem Innendeckel der 10 cm3 Petrischale pipettiert. Der Deckel wird invertiert und 3 Tage lang aufbewahrt, um eine homotypische oder heterotypische Sphäroidbildung zu ermöglichen. Sphäroide Bilder werden mit 50-facher Vergrößerung aufgenommen. Die Abbildung wird mit einem webbasierten wissenschaftlichen Illustrationstool erstellt (siehe Materialverzeichnis). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62868/62868fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Es fehlen umfassende In-vitro-Modelle , die die relevante menschliche Krankheit getreu rekapitulieren. Die aktuelle Studie präsentiert die dreidimensionale (3D) Tumorsphäroidbildung und -kultur, ein zuverlässiges In-vitro-Werkzeug zur Untersuchung der Tumor-Stroma-Interaktion beim menschlichen hepatozellulären Karzinom.

Ein dreidimensionales Sphäroidmodell zur Untersuchung der Tumor-Stroma-Wechselwirkung bei hepatozellulären Karzinomen

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...

3D-Tumorsphäroide haben die herkömmliche 2D-Monolayer-Technik als Goldstandard für die In-vitro-Krebsforschung abgelöst. Diese Modelle erlauben die Kokultur mehrerer Zelltypen, die die Heterogenität der Tumormikroumgebung widerspiegeln und die Nutzung räumlicher Wechselwirkungen ermöglichen. Vorteile der Verwendung der Hängentröpfchenmethode zur Erzeugung von 3D-Sphäroiden sind das Fehlen einer Zell-Kunststoff-Interaktion und die einfache Untersuchung der Interaktion zwischen den Tumorzellen und den Nicht-Tumorzellen.Diese Technik bietet auch eine reproduzierbare und kostengünstige Möglichkeit, die Tumor-Stroma-Interaktion zu modellieren. 3D-Tumoroide sind wertvolle präklinische Modelle und werden häufig als Drogenscreening-Tool eingesetzt. Diese Methode kann angewendet werden, um die pharmakologischen Wirkungen mehrerer Verbindungen auf das Tumorwachstum und die umgebende Mikroumgebung zu untersuchen.Der Prozess der Sphäroidbildung ist benutzerfreundlich und erfordert herkömmliche Zellkultur-Laborgeräte. Sphäroide können mit jedem inversen Lichtmikroskop auf dem Tisch abgebildet werden, und die Analyse der Sphäroidgröße und -form kann mit einer weit verbreiteten Online-Bildanalysesoftware durchgeführt werden. Entfernen Sie zunächst Huh7- und Hep3B-HCC-Tumorzelllinien sowie COS-7- und LX2-Fibroblastenzelllinien aus ihrem Lagergestell in flüssigem Stickstoff und tauen Sie sie schnell auf.Nach dem Auftauen die aufgetauten Zellen mit zwei Millilitern frischem Kulturmedium verdünnen. Zentrifugieren Sie die Zellen. Verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter frischem Warmkulturmedium.Dann säen Sie die Zellen in T75-Zellkulturflaschen und inkubieren Sie sie in einem Zellkultur-Inkubator, bis die Zellen 60 bis 70 & Konfluenz erreichen. Zur Zellsammlung das Kulturmedium absaugen und die Zellen dreimal mit PBS waschen. Dann, um die adhäsiven Zellen vom Boden der Kolben zu lösen, fügen Sie zwei Milliliter vorgewärmtes Trypsin hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius.Nach vier Minuten inaktivieren Sie das Trypsin, indem Sie vier Milliliter vollständiges Kulturmedium hinzufügen und die Zellsuspension sammeln, dann die Zellen zentrifugieren und den Überstand verwerfen, bevor Sie die Zellen in einem Milliliter frischem Kulturmedium wiederverwenden. Zum Schluss fügen Sie weitere drei Milliliter frisches Kulturmedium hinzu. Um die Zellen zu zählen, wirbeln Sie die Zellsuspension vorsichtig.Mischen Sie dann mit einer 10-Mikroliter-Pipette 10 Mikroliter der Zellsuspension mit 10 Mikrolitern Trypanblau und pipettieren Sie die Mischung viermal vorsichtig nach oben und unten, um eine vollständige Färbung der äußeren Zelloberfläche mit dem Farbstoff zu gewährleisten. Als nächstes legen Sie einen Deckglas über den Hämozytometer-Zählbereich. Legen Sie dann die Pipettenspitze mit der Zellmischung neben den Rand des Deckglases und stoßen Sie den Spitzeninhalt vorsichtig in den Zählschieber aus.Nachdem Sie einige Minuten gewartet haben, bis sich die Aufschlämmung gelegt hat, befestigen Sie das Hämozytometer auf dem Mikroskoptisch und zählen Sie die Zellen, die die obere oder die rechte Entscheidung überlappen, während Sie vermeiden, dass sich die untere oder die linke Entscheidung überschneidet. Berechnen Sie schließlich die Gesamtzahl der Zellen mit dieser Formel. Nach dem Absaugen des Kulturmediums waschen Sie die LX2-Zellen dreimal mit PBS.Lösen Sie die Zellen mit Trypsin wie zuvor gezeigt und zentrifugieren Sie sie. Nachdem Sie die Zellen wie zuvor gezeigt gezählt haben, säen Sie einmal 10 bis zur sechsten LX2-Zelle in 10 Kubikzentimeterschalen und inkubieren bei 37 Grad Celsius. Sammeln Sie nach 48 Stunden das fibroblastenkonditionierte Medium und zentrifugieren Sie, um alle schwimmenden Zellen zu pelletieren.Filter sterilisieren Sie das konditionierte Medium mit einem 0,22-Mikron-Filter, der an einer 20-Milliliter-Spritze befestigt ist. Dann aliquotieren Sie das Medium in zwei Milliliter-Röhrchen zur Lagerung bei minus 80 Grad Celsius. Fügen Sie 10 Milliliter steriles PBS auf den Boden einer 10 Kubikzentimeter schüssel hinzu, um feuchte Bedingungen für die Sphäroide zu schaffen.Dann suspendieren Sie 1.500 HuH7 HCC-Zellen mit 1.500 COS-7-Säugetierfibroblastenzellen in hängenden Tröpfchen, um Kugeln zu bilden. Drehen Sie den Deckel der Schüssel um, damit das Medium, einschließlich der Zellsuspension, über einer feuchten Umgebung hängen kann. Nach drei Tagen, um Bilder der Sphäroide zu machen, stellen Sie die Schüssel auf die Bühne eines inversen Mikroskops und stellen Sie die Vergrößerung auf das Fünffache ein.Öffnen Sie als Nächstes die Mikroskopsoftware auf dem angeschlossenen Computer und passen Sie den Fokus an, um ein klares Bild von jedem Sphäroid zu erhalten. Verwenden Sie dann das Schnappwerkzeug der Mikroskopsoftware, um die Bilder zu erfassen und die aufgenommenen Bilder zu speichern. Fügen Sie 10 Milliliter steriles PBS auf den Boden einer 10 Kubikzentimeter schüssel hinzu.Suspendieren Sie dann 3.000 Hep3B HCC-Zellen in den hängenden Tröpfchen, um Kugeln zu bilden, und drehen Sie den Deckel der Schüssel um, so dass die Tröpfchen drei Tage lang über einer feuchten Umgebung hängen können. Als nächstes übertragen Sie die Hep3B-Sphäroide in 20 Mikroliter frischer Zustandsmedien aus LX2-Zellen in hängenden Tröpfchen. Drehen Sie dann den Deckel der Schale, auf der sich die Sphäroide bilden, um und befestigen Sie den Deckel auf der Bühne eines Lichtmikroskops.Passen Sie den Feinfokus des Mikroskops an, um jedes Sphäroid wie zuvor gezeigt sichtbar zu machen. Nachdem Sie die Kolbentaste gedrückt haben, um die Luft vorsichtig aus der Mikropipette zu entleeren, führen Sie die Pipettenspitze in das Tröpfchen ein, das das zu übertragende Sphäroid enthält. Kommen Sie dem Sphäroid sehr nahe, ohne es mit der Spitze zu berühren.Als nächstes lassen Sie den Druck auf den Kolbenknopf vorsichtig los, um das Absaugen des Sphäroides in die Mikropipettenspitze in zwei Mikroliter Medien zu ermöglichen. Dann übertragen Sie das Sphäroid in ein neues Tröpfchen, das an einer neuen 10 Kubikzentimeter Schüssel hängt. Nehmen Sie Bilder der Sphäroide mit fünffacher Vergrößerung mit einem inversen Mikroskop vom Tag des Transfers bis zum siebten Tag der Kultur in den LX2-konditionierten Medien auf.Um die Bilder der wachsenden Sphäroide zu analysieren, öffnen Sie jedes Sphäroidbild in einer Bildanalysesoftware und verwenden Sie das Freihandauswahlwerkzeug, um jedes Sphäroid zu umreißen. Wählen Sie dann in der Dropdown-Schaltfläche Analyse die Option Messung einstellen, gefolgt von Bereich, und drücken Sie OK. Zeichnen Sie als Nächstes manuell einen Kreis um jedes Sphäroid, und sobald die Kugel eingekreist ist, drücken Sie Strg M, damit das Programm den Sphäroidbereich in Pixeln berechnen kann. Konvertieren Sie dann die Fläche des Sphäroids mit dieser Formel in ein Volumen.Berechnen Sie schließlich die Änderung des Sphäroidvolumens relativ zu seinem Volumen am ersten Tag der Bildaufnahme. Während der Optimierung der Zelldichte für die Sphäroidbildung ergaben höhere Seeding-Dichten von 12.000 und 6.000 Zellen Sphäroide mit einer asymmetrischen Form, während eine Seeding-Dichte von 3.000 Zellen ein perfektes abgerundetes 3D-Sphäroid ergab. So wurden 3.000 Sphäroide der Zelldichte für weitere Experimente angepasst.Die longitudinale Beurteilung der proliferativen Wirkung von co-kultivierenden Tumor- und Fibroblastenzelllinien zeigte, dass heterotypische Sphäroide ab dem vierten Tag im Vergleich zu homotypischen Sphärooiden in einer idealen runden Form wuchsen. Heterotypische Sphäroide zeigten zunächst eine schnelle Wachstumsphase vom vierten bis zum siebten Tag, gefolgt von einer langsameren Phase am achten Tag. Das Sphäroidvolumen nahm dann an den Tagen neun und 10 ab, was möglicherweise die Erschöpfung der Nährstoffe oder einen hypoxischen Kern und Zelltod widerspiegelt.Im Gegensatz dazu zeigten die homotypischen Sphäroide bis zum fünften Tag eine relativ statische Wachstumskurve, gefolgt von einer allmählichen Zunahme ihrer Wachstumskurven ab dem sechsten Tag. Die höhere Wachstumsrate von heterotypischen Sphäroiden deutet darauf hin, dass der direkte Kontakt zwischen Tumor und Fibroblasten die Größe der Tumorsphäroide erhöht. Wenn drei Tage alte homotypische Hep3B-Sphäroide in frischen Medien gezüchtet wurden, bildeten die Zellen nach drei Tagen perfekt abgerundete Sphäroide und zeigten eine fortgesetzte Proliferation bis zum siebten Tag.Die Wachstumsrate wurde erhöht, wenn Sphäroide in LX2-konditionierten Medien aufrechterhalten wurden, was auf eine fibroblastengetriebene Proliferation von Tumorsphäroiden hindeutet. Es ist wichtig sicherzustellen, dass das sterile BBS auf den Boden des Geschirrs gegeben wird, um einen geeigneten feuchten Zustand für die Sphäroidbildung aufrechtzuerhalten. Seien Sie auch vorsichtig beim Umkehren des Deckels, damit die Sphäroide und die Tröpfchen nicht gestört werden.3D-Tumorsphäroide können fixiert oder eingefroren und für zukünftige Anwendungen wie Immunchemie oder Immunfluoreszenz sowie RNA-Extraktion für die transkriptomische Analyse gelagert werden. Heterotypische Sphäroide mit vormarkierten Zellen können abgebildet und verfolgt werden, um Einblicke in die Zell-Zell-Interaktionen innerhalb der Tumormikroumgebung zu geben.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Quelle: Guyon, J., et al. Ein 3D-Sphäroidmodell für Glioblastome. J. Vis. exp. (2020)Das Video zeigt die Erstellung eines dreidimensionalen Sphäroidmodells der Tumorzellinvasion. Sphäroide werden aus menschlichen Hirntumorzellen gebildet und in eine Kollagenmatrix eingebettet. Die Tumorzellen an der Peripherie der Sphäroiden nehmen einen invasiven Phänotyp an, sezernieren Proteasen, um das Kollagen abzubauen, und dringen vor, um in die umgebende Matrix einzudringen.

Generierung eines dreidimensionalen Sphäroidmodells der Tumorzellinvasion

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Co-Kultur in drei Dimensionen, das nützlich ist, um multizelluläre Interaktionen und extrazelluläre Matrix-abhängige Modulation des Verhaltens von Krebszellen zu untersuchen. In diesem experimentellen Modell werden Krebszellen auf Kollagengelen kultiviert, die in humane krebsassoziierte Fibroblasten eingebettet sind.

Dreidimensionale Co-Kultur-Modell für Tumor-Stroma-Interaktion

Die Invasion des umgebenden normalen Gewebes ist ein definierendes Merkmal von bösartigen Tumoren. Wir stellen hier einen einfachen, halbautomatischen Mikroplatten-Assay der Invasion in eine natürliche 3D-Biomatrix zur Verfügung, der mit einer Reihe von Modellen fortgeschrittener menschlicher Krebsarten veranschaulicht wurde.

Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Diese Methode bewertet die Invasion von Krebszellen von Sphäroiden in eine umgebende 3D-Matrix.  Sphäroide werden über die Methode der hängenden Tropfenkultur erzeugt und dann in eine Matrix eingebettet, die aus Basalmembranmaterialien und Kollagen vom Typ I besteht.  Die Invasion aus den Sphäroiden wird anschließend überwacht.

Eine Krebszelle Spheroid Assay zur Invasion in einem 3D-Rahmen Beurteilen

Optische Kohärenztomografie (OCT), eine dreidimensionale imaging-Technologie, wurde verwendet, um zu überwachen und zu charakterisieren, die Wachstum Kinetik der vielzelligen Tumor Sphäroide. Präzise volumetrische Quantifizierung der Tumor Sphäroide mit einem Voxel zählen Ansatz und markierungsfreie abgestorbenes Gewebe-Erkennung in der Sphäroide basierend auf intrinsische optische Dämpfung dagegen wurden demonstriert.

Longitudinal morphologischen und physiologischen Überwachung der dreidimensionalen Tumor Sphäroide mit optischen Kohärenztomographie

Ziel dieses Protokolls ist es, ein 3D-In-vitro-Modell zu etablieren, um die Differenzierung krebsassoziierter Fibroblasten (CAFs) in einer tumormassenähnlichen Umgebung zu untersuchen, die in verschiedenen Analysesystemen wie Immunfluoreszenz, Transkription behandelt werden kann. Analyse und Lebenszellbildung.

Ein 3D-Spheroid-Modell als physiologischeres System für krebsassoziierte Fibroblasten Differenzierung und Invasion In Vitro-Studien

Ein neuartiges dreidimensionales Sphäroidmodell, das auf der heterotypischen Interaktion von Tumorzellen und stromalen Fibroblasten basiert, wird etabliert. Hier präsentieren wir Kokultur von Tumorzellen und stromalen Fibroblasten, Zeitraffer-Bildgebung und konfokale Mikroskopie, um die Bildung von Sphäroiden zu visualisieren. Dieses dreidimensionale Modell bietet eine entsprechende Plattform, um Tumor-Stroma-Wechselwirkungen zu untersuchen und Krebstherapeutika zu testen.

Ein neuartiges Stromal Fibroblast-moduliertes 3D-Tumor-Sphäroid-Modell zur Untersuchung der Tumor-Stroma-Interaktion und der Arzneimittelforschung

Hier beschreiben wir einen einfach zu bedienenden Invasionstest für Glioblastom. Dieser Test eignet sich für glioblastom-Stammzellen. Ein Fidschi-Makro zur einfachen Quantifizierung von Invasion, Migration und Proliferation wird ebenfalls beschrieben.

Ein 3D Spheroid Modell für Glioblastom

Dieses Protokoll stellt ein biomimetisches 3D-Modell mit begleitendem fibrotischen Stromfach dar. Hergestellt mit physiologisch relevanten Hydrogelen in Verhältnissen, die die biophysikalischen Eigenschaften der stromalen extrazellulären Matrix imitieren, ein aktiver Mediator von zellulären Wechselwirkungen, Tumorwachstum und Metastasierung.

Ein biomimetisches Modell für Leberkrebs zur Untersuchung von Tumor-Stroma-Wechselwirkungen in einer 3D-Umgebung mit tunablen biophysikalischen Eigenschaften

Multizelluläre 3D-Tumorsphäroide wurden mit Lungenadenokarzinomzellen, Fibroblasten und Monozyten hergestellt, gefolgt von der Isolierung von Krebs-assoziierten Fibroblasten (CAFs) aus diesen Sphäroiden. Isolierte CAFs wurden mit normalen Fibroblasten verglichen, um die mitochondriale Gesundheit zu beurteilen, indem das mitochondriale Transmembranpotential, reaktive Sauerstoffspezies und enzymatische Aktivitäten untersucht wurden.

Bewertung der mitochondrialen Gesundheit in krebsassoziierten Fibroblasten, die aus 3D-multizellulären Lungentumor-Sphäroiden isoliert wurden

Es besteht ein dringender Bedarf an 3D-Krebsmodellen, die heterozelluläre Wechselwirkungen erfassen, um Krebsmetastasen zu untersuchen. Unsere Studie stellt die Erzeugung von heteromultizellulären Stroma-Epithel-Epithelen in einer gerüstfreien und gerüstfreien Umgebung vor, die zur Untersuchung der Invasion und der zellulären räumlichen Verteilungen verwendet werden kann.

Heteromultizelluläre Stromazellen in gerüstfreien 3D-Kulturen von Epithelkarzinomzellen treiben die Invasion voran

Erfahren Sie, wie man 3D-Tumorsphäroide mit der Hängenden-Tropfen-Methode erstellt, um Tumor-Stroma-Wechselwirkungen bei hepatozellulären Karzinomen zu untersuchen. Diese kostengünstige Technik ermöglicht reproduzierbare In-vitro-Modelle für die Krebsforschung.

Ein dreidimensionales Sphäroidmodell zur Untersuchung der Tumor-Stroma-Wechselwirkung bei hepatozellulären Karzinomen

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