In vitro Multiparametrische Zellanalyse durch mikroorganisch ladungsmodulierte Feldeffekt-Transistorarrays

Diese Methode bietet eine originelle Lösung für die Zellanalyse, ein Bereich, dem derzeit geeignete Aufzeichnungssysteme fehlen, die multiparametrisch, biokompatibel, mechanisch konform und schließlich kostengünstig sind. Mit dieser Methode ist es möglich, Sensorsysteme mit unterschiedlichen Sensorfähigkeiten zu erhalten, wie z.B. die Fähigkeit, sowohl die elektrische als auch die metabolische Aktivität von Zellen mit einem einzigen Typ von elektronischen organischen Geräten zu überwachen. Neben der Reduzierung von In-vivo-Tierversuchen sind multiparametrische In-vitro-Systeme ein äußerst vielversprechendes Werkzeug in einer Vielzahl von biomedizinischen Bereichen, wie der personalisierten Medizin und Studien zu neurodegenerativen Erkrankungen.

In der hohen Vielseitigkeit des organischen Ladungs-Modulator-Feldeffekttransistors ist es auch möglich, andere Sensoren zu integrieren, wie z.B. Sensoren zur Detektion von Volumen verschiedener Biomarker. Schneiden Sie 6 mal 6 Quadratzentimeter Stücke von einer neuen 250 Mikrometer PET-Platte und spülen Sie dann die PET-Substrate mit Aceton, Isopropylalkohol und deionisiertem Wasser ab. Trocknen Sie sie mit Bächen und Stickstoff und lagern Sie sie in sauberen Plastik-Petrischalen.

Für die Titanabscheidung werden die Substrate mit Plasmasauerstoff vorgereinigt und auf den Substrathalter in der Hinterzimmerkammer des thermischen Verdampfers gelegt. Als nächstes geben Sie 60 Milligramm Titan in den Tiegel, schließen sie den Verschluss und pumpen Sie die Verdampfungskammer hinunter, bis sie 10 bis zur 6-Tour erreicht. Erhöhen Sie die Leistung des Verdampfers, bis der Tiegel rot leuchtet, und warten Sie 30 Sekunden.

Öffnen Sie dann den Verschluss, erhöhen Sie die Leistung auf 60% und warten Sie 60 Sekunden. Schließen Sie nach 60 Sekunden den Verschluss und schalten Sie die Stromversorgung aus. Legen Sie zur Musterung jeweils ein Substrat auf den Spin Coater, der sich in einem Abzug befindet.

Geben Sie mit einer Einweg-Kunststoffpipette vier Milliliter Fotolack auf das Substrat, um eine zwei Mikrometer dicke Fotolackschicht unter Verwendung der im Textmanuskript genannten Spinbeschichtungsparameter zu erhalten. Backen Sie den Fotolack weich, indem Sie das Substrat auf eine Heizplatte legen und das Substrat dann in einer mit Aluminiumfolie umwickelten Petrischale oder einem Kunststoffbehälter aufbewahren. Als nächstes platzieren Sie das Substrat in einem Brahma-Graphen und positionieren Sie die photolithographische Plastikmaske, aber das gewünschte floating Gate-Layout auf dem Substrat, setzen Sie die Maske für eine Minute UV-Licht von oben aus.

Entfernen Sie dann vorsichtig die Maske, achten Sie darauf, die seitlichen Bewegungen der Maske über das Substrat zu minimieren, und tauchen Sie das Substrat für 10 Sekunden in einen Glasbehälter, der mit der sich entwickelnden Lösung gefüllt ist. Dann spülen Sie es schnell in deionisiertem Wasser, ätzen Sie das freiliegende Titan, indem Sie es für 15 Sekunden in die Titanätzlösung tauchen, dann mit deionisiertem Wasser abspülen und mit Stickstoff trocknen. Untersuchen Sie optisch das Substrat und entfernen Sie den Fotolack mit Aceton.

Dann spülen Sie das Substrat mit Isopropylalkohol und entionisiertem Wasser ab und trocknen Sie es mit Stickstoff. Für die dielektrische Gate-Abscheidung geben Sie 300 Milligramm Parylen-C-Dimer auf den Parylen-Coater und stellen die Druckwerte ein. Nach der Abscheidung reinigen Sie die Substrate mit Aceton, Isopropylalkohol und deionisiertem Wasser und trocknen Sie sie wie zuvor gezeigt mit Stickstoff.

Nachdem Sie den Fotolack wie zuvor demonstriert auf dem Substrat abgeschieden haben, legen Sie das Substrat in einen Bromographen und positionieren Sie die photolithographische Maske aus Kunststoff auf dem Substrat für die Vorspannung unter einem stereoskopischen Mikroskop. Entfernen Sie nach einer einminütigen UV-Belichtung von oben vorsichtig die Maske wie zuvor gezeigt. Entwickeln Sie den Fotolack wie zuvor gezeigt und setzen Sie dann das Substrat mit dem gemusterten Fotowiderstand Sauerstoffplasma aus, um das Parylen c aus den Erfassungsbereichen zu entfernen.

Legen Sie die Substrate für 10 Sekunden in einen mit Aceton gefüllten Glasbehälter in das Ultraschallbad, um den Fotolack vollständig zu entfernen, spülen Sie die Substrate dann mit Aceton, Isopropylalkohol und Wasser ab und trocknen Sie sie wie zuvor gezeigt mit Stickstoff. Nachdem Sie den Fotolack auf dem Substrat abgelegt haben, wie zuvor gezeigt, legen Sie das Substrat in einen Burmographen und positionieren sie auf dem Substrat eine photolithographische Plastikmaske mit einfachen schwarzen Rechtecken, die die Transistorbereiche vollständig bedeckten. Entfernen Sie nach einer einminütigen Exposition gegenüber UV-Licht von oben und unten vorsichtig die Maske und entwickeln Sie den Fotolack, wie zuvor gezeigt.

Reinigen Sie die Substrate mit der schonenden Plasmabehandlung, um die Haftung des Metalls auf dem Parylen c zu fördern, und legen Sie sie dann auf den Substrathalter in der Vakuumkammer des thermischen Verdampfers. 30 Milligramm Gold in den Tiegel geben, den Verschluss schließen und die Verdampfungskammer hinunterpumpen, bis sie 10 bis minus fünf Tor erreicht. Erhöhen Sie die Leistung des Verdampfers, bis der Tiegel rot leuchtet, und warten Sie 30 Sekunden.

Öffnen Sie den Verschluss, erhöhen Sie die Leistung auf 40% und warten Sie 60 Sekunden. Schließen Sie dann den Verschluss und schalten Sie die Stromversorgung aus. Legen Sie die Substrate für 10 Sekunden in einen Acetonbehälter im Ultraschallbad, um den Fotolack abzuheben und so das Gold aus dem Transistorkanal zu entfernen.

Spülen, trocknen und deponieren Sie den Fotolack auf den Substraten, wie zuvor gezeigt. Nachdem Sie das Substrat in einen Bromographen gelegt haben, positionieren Sie auf dem Substrat eine photolithographische Plastikmaske mit den gewünschten Quellen, Abflüssen und Kontrolltoranordnung. Entfernen Sie nach einer einminütigen UV-Belichtung von oben vorsichtig die Maske und entwickeln Sie den Fotolack wie zuvor gezeigt.

Ätzen Sie das freiliegende Gold, indem Sie es für 10 Sekunden in die Goldätzlösung tauchen, dann mit entionisiertem Wasser abspülen und mit Stickstoff trocknen, wie gezeigt. Nach optischer Inspektion des Substrats den Fotolack mit Aceton entfernen, mit Isopropylalkohol und deionisiertem Wasser abspülen und mit Stickstoff trocknen. Nach dem Abscheiden des Fotolacks auf dem Substrat wird das Substrat und ein Bromograph auf dem Substrat eine photolithographische Kunststoffmaske mit Öffnungen platziert, die den pH-Messbereichen des OCMFET entsprechen.

Nach einer einminütigen UV-Belichtung von oben vorsichtig entfernen Sie die Maske wie zuvor gezeigt. Entwickeln Sie den Fotolack wie zuvor demonstriert, schützen Sie dann das gesamte Gerät mit Ausnahme der pH-Messbereiche mit Polyimid-Isolierband und legen Sie eine 500-Nanometer-Schicht Parylen C mit den im Textmanuskript genannten Parametern auf das Substrat. Nachdem Sie das Polyamid-Isolierband vorsichtig entfernt haben, setzen Sie das Substrat Sauerstoffplasma aus, um das Parylen C auf den pH-Messbereichen der OCMFETs zu aktivieren.

Legen Sie dann die Substrate für 10 Sekunden in einen Acetonbehälter im Ultraschallbad, um den Fotolack vollständig zu entfernen. Spülen Sie die Substrate mit Aceton und Isopropylalkohol ab und trocknen Sie sie mit Stickstoff. Legen Sie die Substrate auf eine Heizplatte bei 50 Grad Celsius, bevor Sie ein Ein-Mikroliter-Tröpfchen Halbleiterlösung auf jeden Kanalbereich gießen.

Decken Sie das gesamte Substrat mit dem Deckel ab und trocknen Sie es 30 Minuten lang unter einer chemischen Haube ab. Schneiden Sie das Gerät aus dem PET aus, entweder manuell oder mit einem Laserschneider. Eine konfluente Kultur von Rattenkardiomyozyten, die an der Oberfläche eines MOA hafteten, war immunhaft für das sarkomerische Protein Tropomyosin.

Ein Beispiel für ein einzelnes Kardiomyozytensignal, das mit einem OCMFET gemessen wurde, ist hier gezeigt. Das Gerät konnte sowohl spontane zelluläre elektrische Aktivität als auch die Aktivität erkennen, die bei der Verabreichung verschiedener Chemikalien oder Medikamente induziert wird. Dank der Array-Konfiguration des MOA sollte die Ausbreitungsgeschwindigkeit des Herzsignals innerhalb der Zellkultur abgeschätzt werden.

Der OCMFET war auch in der Lage, neuronale Feldpotentiale mit bemerkenswerter Stabilität und guten Signal-Rausch-Verhältnissen zu verstärken. Die unterschiedlichen Reaktionen eines pH-sensitiven und pH-insensitiven Kanals eines MOA auf chemische Stimulation mit Bikukulin und Tetrodotoxin zeigten die Fähigkeit des Geräts, zwischen verschiedenen zellulären Stoffwechselzuständen zu unterscheiden. Überprüfen Sie das Substrat sorgfältig vor jedem Schritt des Herstellungsprotokolls.

Dies wird die Ausbeute des Prozesses dramatisch erhöhen. Durch die Verwendung verschiedener Funktionalisierungsmethoden ist es möglich, chemische und physikalische Sensoren zu erhalten, die in Anwendungen wie Labor auf einem Chip und Roboterhaut eingesetzt werden können.