Name: Aufzeichnung der Netzwerkaktivität in spinalen nozizeptiven Schaltkreisen unter Verwendung von Mikroelektrodenarrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Erfahren Sie die Aufzeichnung von Netzwerkaktivität in spinalen nozizeptiven Schaltkreisen mit Mikroelektrodenarrays. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Schmerzverarbeitung und das Screening potenzieller antinozizeptiver Verbindungen.

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Diese Arbeit wurde vom National Health and Medical Research Council (NHMRC) of Australia (Zuschüsse 631000, 1043933, 1144638 und 1184974 an B.A.G. und R.J.C.) und dem Hunter Medical Research Institute (Zuschuss an B.A.G. und R.J.C.) finanziert.

<ol><li>Smith, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calretinin+positive+neurons+form+an+excitatory+amplifier+network+in+the+spinal+cord+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Calretinin positive neurons form an excitatory amplifier network in the spinal cord dorsal horn.</a> eLife. 8, 49190(2019).</li>
<li>Smith, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+calretinin-expressing+neurons+in+the+mouse+superficial+dorsal+horn%3A+implications+for+spinal+pain+processing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of calretinin-expressing neurons in the mouse superficial dorsal horn: implications for spinal pain processing.</a> The Journal of physiology. 593 (19), 4319-4339 (2015).</li>
<li>Boyle, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+spinal+microcircuit+that+gates+myelinated+afferent+input%3A+Implications+for+tactile+allodynia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Defining a spinal microcircuit that gates myelinated afferent input: Implications for tactile allodynia.</a> Cell Reports. 28 (2), 526-540 (2019).</li>
<li>Browne, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+cross-referencing+of+inhibitory+and+excitatory+interneuron+populations+to+dissect+neuronal+heterogeneity+in+the+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transgenic cross-referencing of inhibitory and excitatory interneuron populations to dissect neuronal heterogeneity in the dorsal horn.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 32(2020).</li>
<li>Graham, B. A., Hughes, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rewards%2C+perils+and+pitfalls+of+untangling+spinal+pain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rewards, perils and pitfalls of untangling spinal pain circuits.</a> Current Opinion in Physiology. 11, 35-41 (2019).</li>
<li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).</li>
<li>Hughes, D. I., Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+targets%3A+inhibitory+interneurons+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Central nervous system targets: inhibitory interneurons in the spinal cord.</a> Neurotherapeutics. 17 (3), 874-885 (2020).</li>
<li>Duan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+spinal+circuits+transmitting+and+gating+mechanical+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain.</a> Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).</li>
<li>Hachisuka, J., Chiang, M. C., Ross, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Itch+and+neuropathis+itch%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Itch and neuropathis itch.</a> Pain. 159 (3), 603(2018).</li>
<li>Foster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation%2C+silencing%2C+and+activation+establish+glycinergic+dorsal+horn+neurons+as+key+components+of+a+spinal+gate+for+pain+and+itch%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch.</a> Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).</li>
<li>Bourane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+spinal+circuit+for+light+touch+and+fine+motor+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control.</a> Cell. 160 (3), 503-515 (2015).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+spinal+circuits+involved+in+touch-evoked+dynamic+mechanical+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of spinal circuits involved in touch-evoked dynamic mechanical pain.</a> Nature neuroscience. 20 (6), 804-814 (2017).</li>
<li>Peirs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+allodynia+circuitry+in+the+dorsal+horn+is+defined+by+the+nature+of+the+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mechanical allodynia circuitry in the dorsal horn is defined by the nature of the injury.</a> Neuron. 109 (1), 73-90 (2021).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+dissection+of+the+role+of+somatostatin+in+itch+and+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circuit dissection of the role of somatostatin in itch and pain.</a> Nature Neuroscience. 21 (5), 707-716 (2018).</li>
<li>Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+neuronal+function+through+microelectrode+array+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Revealing neuronal function through microelectrode array recordings.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, 423(2015).</li>
<li>Nam, Y., Wheeler, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+microelectrode+array+technology+and+neural+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">In vitro microelectrode array technology and neural recordings.</a> Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).</li>
<li>Johnstone, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+arrays%3A+a+physiologically+based+neurotoxicity+testing+platform+for+the+21st+century%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Microelectrode arrays: a physiologically based neurotoxicity testing platform for the 21st century.</a> Neurotoxicology. 31 (4), 331-350 (2010).</li>
<li>Stett, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+application+of+microelectrode+arrays+in+drug+discovery+and+basic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biological application of microelectrode arrays in drug discovery and basic research.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 377 (3), 486-495 (2003).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+and+recent+development+of+the+microelectrode+arrays+%28MEAs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Trends and recent development of the microelectrode arrays (MEAs).</a> Biosensors and Bioelectronics. 175 (1), 112854(2020).</li>
<li>Chapman, R. J., Cilia La Corte, P. F., Asghar, A. U. R., King, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network-based+activity+induced+by+4-aminopyridine+in+rat+dorsal+horn+in+vitro+is+mediated+by+both+chemical+and+electrical+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Network-based activity induced by 4-aminopyridine in rat dorsal horn in vitro is mediated by both chemical and electrical synapses.</a> The Journal of Physiology. 587, Pt 11 2499-2510 (2009).</li>
<li>Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epileptiform+activity+in+rat+spinal+dorsal+horn+in+vitro+has+common+features+with+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Epileptiform activity in rat spinal dorsal horn in vitro has common features with neuropathic pain.</a> Pain. 105 (1-2), 327-338 (2003).</li>
<li>Kay, C. W., Ursu, D., Sher, E., King, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Cx36+and+Cx43+in+4-aminopyridine-induced+rhythmic+activity+in+the+spinal+nociceptive+dorsal+horn%3A+an+electrophysiological+study+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of Cx36 and Cx43 in 4-aminopyridine-induced rhythmic activity in the spinal nociceptive dorsal horn: an electrophysiological study in vitro.</a> Physiological Reports. 4 (14), 12852(2016).</li>
<li>Jankowska, E., Lundberg, A., Rudomin, P., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+4-aminopyridine+on+synaptic+transmission+in+the+cat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of 4-aminopyridine on synaptic transmission in the cat spinal cord.</a> Brain Research. 240 (1), 117-129 (1982).</li>
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<li>Mendis, G. D. C., Morrisroe, E., Reid, C. A., Halgamuge, S. K., Petrou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+local+field+potentials+of+dissociated+cultures+grown+on+multi-electrode+arrays+for+pharmacological+assays%5BTitle%5D)+AND+%2238th+Annual+International+Conference+of+the+IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">Use of local field potentials of dissociated cultures grown on multi-electrode arrays for pharmacological assays.</a> 38th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 952-956 (2016).</li>
<li>Hughes, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological%2C+neurochemical+and+electrophysiological+features+of+parvalbumin-expressing+cells%3A+a+likely+source+of+axo-axonic+inputs+in+the+mouse+spinal+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Morphological, neurochemical and electrophysiological features of parvalbumin-expressing cells: a likely source of axo-axonic inputs in the mouse spinal dorsal horn.</a> The Journal of Physiology. 590 (16), 3927-3951 (2012).</li>
<li>Peirs, C., Seal, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+for+pain%3A+recent+advances+and+current+views%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural circuits for pain: recent advances and current views.</a> Science. 354 (6312), 578-584 (2016).</li>
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<li>Li, J., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaker+neurons+within+newborn+spinal+pain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pacemaker neurons within newborn spinal pain circuits.</a> Journal of Neuroscience. 31 (24), 9010-9022 (2011).</li>
<li>Sandkühler, J., Eblen-Zajjur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+rhythmic+nociceptive+and+non-nociceptive+spinal+dorsal+horn+neurons+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of rhythmic nociceptive and non-nociceptive spinal dorsal horn neurons in the rat.</a> Neuroscience. 61 (4), 991-1006 (1994).</li>
<li>Lucas-Romero, J., Rivera-Arconada, I., Roza, C., Lopez-Garcia, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+classification+of+spontaneous+discharges+in+mouse+superficial+dorsal+horn+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Origin and classification of spontaneous discharges in mouse superficial dorsal horn neurons.</a> Scientific Reports. 8 (1), 9735-9735 (2018).</li>
<li>Antonio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L.+al.+In+vitro+seizure+like+events+and+changes+in+ionic+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">L. al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 260, 33-44 (2016).</li>
<li>Avoli, M., Jefferys, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+drug-induced+epileptiform+synchronization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro.</a> Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).</li>
<li>Taccola, G., Nistri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+micromolar+concentrations+of+4-aminopyridine+facilitate+fictive+locomotion+expressed+by+the+rat+spinal+cord+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Low micromolar concentrations of 4-aminopyridine facilitate fictive locomotion expressed by the rat spinal cord in vitro.</a> Neuroscience. 126 (2), 511-520 (2004).</li>
<li>Mitra, P., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+spinal+cord+slice+preparation+for+recording+from+lumbar+motoneurons+of+the+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse.</a> Journal of Neurophysiology. 107 (2), 728-741 (2012).</li>
<li>Egert, U., Heck, D., Aertsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+monitoring+of+spiking+networks+in+acute+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional monitoring of spiking networks in acute brain slices.</a> Experimental Brain Research. 142 (2), 268-274 (2002).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Trotz der Bedeutung der spinalen DH für die nozizeptive Signalgebung, Verarbeitung und die daraus resultierenden Verhaltens- und emotionalen Reaktionen, die den Schmerz charakterisieren, bleiben die Schaltkreise in dieser Region schlecht verstanden. Eine zentrale Herausforderung bei der Untersuchung dieses Problems war die Vielfalt der Neuronenpopulationen, aus denen diese Schaltkreisebestehen 6,31,32. Jüngste Fortschritte in tr...

Die Rolle bestimmter Arten von inhibitorischen und exzitatorischen Interneuronen innerhalb des Rückenmarks DH wird mit einer schnellen Rate aufgedeckt 1,2,3,4. Zusammen machen Interneuronen über 95% der Neuronen im DH aus und sind an der sensorischen Verarbeitung, einschließlich der Nozizeption, beteiligt. Darüber hinaus sind diese Interneuronenschaltkreise wichtig, um festzustellen, ob periphere Signale die Neuroachse hinaufsteigen, um das Gehirn zu erreichen und zur Schmerzwahrnehmung beizutragen 5,6,7. Bisher haben die meisten Studien die Rolle von DH-Neuronen auf Einzelzell- oder Ganzorganismenebene untersucht, indem sie Kombinationen von intrazellulärer In-vitro-Elektrophysiologie, neuroanatomischer Markierung und In-vivo-Verhaltensanalyse verwendet haben 1,3,8,9,10,11,12,13,14 . Diese Ansätze haben das Verständnis der Rolle bestimmter Neuronenpopulationen bei der Schmerzverarbeitung erheblich verbessert. Es bleibt jedoch eine Lücke im Verständnis, wie bestimmte Zelltypen und kleine Makroschaltkreise große Populationen von Neuronen auf Mikroschaltkreisebene beeinflussen, um anschließend die Ausgabe der DH, Verhaltensreaktionen und die Schmerzerfahrung zu beeinflussen.
Eine Technologie, die die Funktion von Makroschaltungen oder Mehrzellen untersuchen kann, ist das Mikroelektrodenarray (MEA) 15,16. MEAs werden seit mehreren Jahrzehnten verwendet, um die Funktion des Nervensystems zu untersuchen17,18. Im Gehirn haben sie das Studium der neuronalen Entwicklung, der synaptischen Plastizität, des pharmakologischen Screenings und der Toxizitätstests erleichtert17,18. Sie können je nach Art der MEA sowohl für In-vitro- als auch für In-vivo-Anwendungen eingesetzt werden. Darüber hinaus hat sich die Entwicklung von MEAs rasant weiterentwickelt, wobei verschiedene Elektrodennummern und -konfigurationen jetzt verfügbarsind 19. Ein wesentlicher Vorteil von MEAs ist ihre Fähigkeit, die elektrische Aktivität in vielen Neuronen gleichzeitig mit hoher räumlicher und zeitlicher Genauigkeit über mehrere Elektroden zu bewerten15,16. Dies bietet eine breitere Ablesung dessen, wie Neuronen in Schaltkreisen und Netzwerken, unter Kontrollbedingungen und in Gegenwart von lokal applizierten Verbindungen interagieren.
Eine Herausforderung bei In-vitro-DH-Präparaten besteht darin, dass die laufende Aktivität in der Regel niedrig ist. Hier wird diese Herausforderung in Rückenmark-DH-Schaltungen mit dem spannungsgesteuerten K+-Kanalblocker 4-Aminopryidin (4-AP) angegangen, um DH-Schaltkreise chemisch zu stimulieren. Dieses Medikament wurde zuvor verwendet, um rhythmische synchrone elektrische Aktivität im DH von akuten Rückenmarksschnitten und unter akuten In-vivo-Bedingungen 20,21,22,23,24 zu etablieren. Diese Experimente haben Einzelzellpflaster und extrazelluläre Aufzeichnung oder Kalziumbildgebung verwendet, um die 4-AP-induzierte Aktivität20,21,22,23,24,25 zu charakterisieren. Zusammen hat diese Arbeit die Notwendigkeit einer exzitatorischen und inhibitorischen synaptischen Übertragung und elektrischer Synapsen für rhythmische 4-AP-induzierte Aktivität gezeigt. Daher wurde die 4-AP-Antwort als ein Ansatz angesehen, der native polysynaptische DH-Schaltkreise mit biologischer Relevanz und nicht als medikamenteninduziertes Epiphänomen entlarvt. Darüber hinaus zeigt die 4-AP-induzierte Aktivität ein ähnliches Ansprechprofil auf Analgetika und Antiepileptika wie neuropathische Schmerzzustände und wurde verwendet, um neuartige spinalbasierte Analgetika-Ziele wie die Connexine20,21,22 vorzuschlagen.
Hier wird ein Präparat beschrieben, das MEAs und chemische Aktivierung des spinalen DH mit 4-AP kombiniert, um diese nozizeptive Schaltung auf der Makroschaltungs- oder Netzwerkebene der Analyse zu untersuchen. Dieser Ansatz bietet eine stabile und reproduzierbare Plattform für die Untersuchung nozizeptiver Schaltkreise unter naiven und neuropathischen "schmerzähnlichen" Bedingungen. Dieses Präparat ist auch leicht anwendbar, um die Wirkung bekannter Analgetika auf Schaltkreisebene zu testen und neuartige Analgetika im hyperaktiven Rückenmark zu screenen.

<table><tbody><tr><td>4-Aminopyridin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>275875-5G</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA214-2.5LPL</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 1M</td><td>Banksia Scientific</td><td>0430/1L</td><td></td></tr><tr><td>Carbonox (Carbogen - 95% O2, 5% CO2)</td><td>Coregas</td><td>219122</td><td></td></tr><tr><td>Gebogene Federschere mit langem Griff</td><td>Fine Science Tools</td><td>15015-11</td><td></td></tr><tr><td>Maßgeschneiderte Luftschnittstelle Inkubationskammer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Thermo Fisher</td><td>10091130</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA783-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>Thermo Fisher</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA383-500G</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Ceva</td><td>KETALAB04</td><td></td></tr><tr><td>Große chirurgische Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14007-14</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 454 Sofortklebebolzen</td><td>und Industriebedarf</td><td>L4543G</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td>R2018b</td></tr><tr><td>MEAs, 3-dimensionale</td><td>Mehrkanalsysteme</td><td>60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti</td><td>60 Titannitrid (TiN)-Elektroden mit 1 internen Referenzelektrode, angeordnet in einem quadratischen Raster von 8x8. Elektroden sind 12 & Mikro; m im Durchmesser, 40 & Mikro; m (100/12/40) oder 50 &micro; m (200/12/50) hoch und gleich weit voneinander entfernt 100 & Mikro; m (100/12/40) oder 200 &micro; m (200/12/50) auseinander.</td></tr><tr><td>MEA Headstage</td><td>Multichannel Systems</td><td>MEA2100-HS60</td><td></td></tr><tr><td>MEA Interface Board</td><td>Multichannel Systems</td><td>MCS-IFB 3.0 Multiboot</td><td></td></tr><tr><td>MEA net</td><td>Multichannel Systems</td><td>ALA HSG-MEA-5BD</td><td></td></tr><tr><td>MEA Perfusionssystem</td><td>Multichannel Systems</td><td>PPS2</td><td></td></tr><tr><td>MEAs, Planar</td><td>Multichannel Systems</td><td>60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti</td><td>60 Titannitrid (TiN)-Elektroden mit 1 internen Referenzelektrode, die entweder in einem quadratischen Raster von 8x8 (200/30) oder einem rechteckigen Raster von 6x10 (500/30) angeordnet sind. Elektroden sind 30 & Mikro; m im Durchmesser und in gleichem Abstand von 200 &; Mikro; m (200/30) oder 500 &micro; m (500/30) auseinander.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA296-500G</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopkamera</td><td>Motic</td><td>Moticam X Wi-Fi</td> Multi Channel <td></td></tr><tr><td>Analyser Software</td><td>Multichannel Systems</td><td></td><td>V 2.17.4</td></tr><tr><td>Multi Channel Experimenter Software</td><td>Multichannel Systems</td><td></td><td>V 2.17.4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA465-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA475-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Thermo Fisher</td><td>ACR207805000</td><td></td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>Kleine Federschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Kleine chirurgische Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Thermo Fisher</td><td>AJA530-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sekundenkleber</td><td></td><td></td><td>Cyanacrylat-Klebstoff</td></tr><tr><td>Tetrodotoxin</td><td>Abcam</td><td>AB120055</td><td></td></tr><tr><td>Schwingungsisolationstisch</td><td>Newport</td><td>VH3048W-OPT</td><td></td></tr><tr><td>Vibrierendes Mikrotom</td><td>Leica</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr></tbody></table>

aufzeichnung der netzwerkaktivität in spinalen nozizeptiven schaltkreisen unter verwendung von mikroelektrodenarrays

Recording Network Activity in Spinal Nociceptive Circuits Using Microelectrode Arrays

Die Rollen und die Konnektivität bestimmter Arten von Neuronen innerhalb des Rückenmarkshorns (DH) werden mit hoher Geschwindigkeit abgegrenzt, um einen immer detaillierteren Überblick über die Schaltkreise zu erhalten, die der Verarbeitung von Wirbelsäulenschmerzen zugrunde liegen. Die Auswirkungen dieser Verbindungen auf eine breitere Netzwerkaktivität in der DH bleiben jedoch weniger gut verstanden, da sich die meisten Studien auf die Aktivität einzelner Neuronen und kleiner Mikroschaltkreise konzentrieren. Alternativ bietet die Verwendung von Mikroelektrodenarrays (MEAs), die die elektrische Aktivität in vielen Zellen überwachen können, eine hohe räumliche und zeitliche Auflösung der neuronalen Aktivität. Hier wird die Verwendung von MEAs mit Rückenmarksschnitten der Maus beschrieben, um die DH-Aktivität zu untersuchen, die durch chemisch stimulierende DH-Schaltkreise mit 4-Aminopyridin (4-AP) induziert wird. Die resultierende rhythmische Aktivität ist auf das oberflächliche DH beschränkt, über die Zeit stabil, durch Tetrodotoxin blockiert und kann in verschiedenen Scheibenorientierungen untersucht werden. Zusammen bietet dieses Präparat eine Plattform, um die DH-Schaltkreisaktivität im Gewebe von naiven Tieren, Tiermodellen chronischer Schmerzen und Mäusen mit genetisch veränderter nozizeptiver Funktion zu untersuchen. Darüber hinaus können MEA-Aufnahmen in 4-AP-stimulierten Rückenmarksschnitten als Schnellscreening-Werkzeug verwendet werden, um die Fähigkeit neuartiger antinozizeptiver Verbindungen zur Störung der Aktivität im Rückenmark DH zu beurteilen.

Modell der Netzwerkaktivität im Rückenmark Rückenhorn Die Anwendung von 4-AP induziert zuverlässig eine synchrone rhythmische Aktivität im Rückenmark DH. Solche Aktivitäten stellen sich als verstärkte EAPs und LFPs dar. Das spätere Signal ist eine niederfrequente Wellenform, die zuvor in MEA-Aufnahmen30 beschrieben wurde. Veränderungen der EAP- und/oder LFP-Aktivität nach der Arzneimittelanwendung spiegeln eine veränderte neuronale Aktivität wider. Beispiele für UAP und LFPs si...

Die kombinierte Verwendung von Mikroelektroden-Array-Technologie und 4-Aminopyridin-induzierter chemischer Stimulation zur Untersuchung der nozizeptiven Aktivität auf Netzwerkebene im Rückenmarksdorsalhorn wird skizziert.

Aufzeichnung der Netzwerkaktivität in spinalen nozizeptiven Schaltkreisen unter Verwendung von Mikroelektrodenarrays

The roles and connectivity of specific types of neurons within the spinal cord dorsal horn (DH) are being delineated at a rapid rate to provide an ...

Die Ihnen beschriebene MEA 4-AP Spinal Slice Preparation bietet eine Plattform, um die Konnektivität von dorsalen Hornschaltkreisen zu untersuchen und wie diese Netzwerke während der sensorischen Verarbeitung der Wirbelsäule interagieren. Die vorgestellte Methodik ermöglicht es, die Aktivität des dorsalen Hornkreislaufs auf einer makroskopischen regionalen Auflösungsebene zu untersuchen. Dieses Präparat kann als schnelles Screening-Tool verwendet werden, um die Fähigkeit von Verbindungen zu beurteilen, die Signalübertragung in spinalen sensorischen Schaltkreisen zu stören.Diese Methode hilft, die Lücke in unserem Verständnis zu schließen, wie die Aktivität bestimmter Zelltypen und kleiner Mikroschaltkreise große Populationen von Neuronen beeinflusst, um anschließend die Ausgabe der dorsalen Hornverhaltensreaktionen und letztendlich die Schmerzerfahrung zu beeinflussen. Um zu beginnen, füllen Sie das MEA gut mit Pferdeserum für 30 Minuten. Nachdem Sie das Serum entfernt haben, spülen Sie das MEA fünfmal gründlich mit destilliertem Wasser ab, bis das destillierte Wasser nicht schaumig wird.Dann füllen Sie den Brunnen mit künstlichem CSF. Nachdem Sie die betäubte Maus enthauptet haben, entfernen Sie die Haut über der Bauchregion, indem Sie einen kleinen Schnitt in der Haut auf Höhe der Hüften machen. Ziehen Sie dann die Haut auf beiden Seiten des Schnitts rostral, bis die gesamte Haut von der Oberseite des Brustkorbs bis zur Oberseite des Beckens entfernt ist, sowohl ventral als auch dorsal.Nachdem Sie den Körper auf Eis gelegt haben, verwenden Sie einen ventralen Ansatz, um die Wirbelsäule freizulegen, indem Sie die Eingeweide entfernen und die Rippen seitlich zum Brustbein durchschneiden. Entfernen Sie den ventralen Brustkorb, beide Schulterblätter sowie die unteren Gliedmaßen und das Becken. Übertragen Sie die Wirbelsäulen- und Rippenvorbereitung in ein Sezierbad, das eiskaltes Saccharose-Kunstleim enthält.Stecken Sie alle vier Ecken des Präparats, indem Sie Stifte durch die unteren Rückenmuskeln und die befestigten oberen Rippen legen. Entfernen Sie das gesamte Muskel- und Bindegewebe, das die ventrale Oberfläche der Wirbel mit den Rongeurs überlagert, und identifizieren Sie die Wirbelregion über der lumbo-sakralen Vergrößerung, die ungefähr unter den T12-L2-Wirbelkörpern liegt. Entfernen Sie einen Wirbelkörperkaudal zur lumbo-sakralen Vergrößerungsregion, um auf das Rückenmark zuzugreifen, das auf dem Wirbelkanal sitzt.Schneiden Sie mit einer gekrümmten Federschere die Wirbelstiele bilateral durch, während Sie den Wirbelkörper rostral anheben und ziehen, um die ventralen und dorsalen Aspekte der Wirbel zu trennen und das Rückenmark freizulegen. Sobald die Wirbelkörper entfernt wurden, um die lumbo-sakrale Vergrößerung zu enthüllen, reinigen Sie vorsichtig die verbleibenden Wurzeln, die das Rückenmark verankern, mit einer Federschere, bis das Nabel frei schwebt. Isolieren Sie das Rückenmark mit rostralen und kaudalen Schnitten oberhalb und unterhalb der lumbo-sakralen Vergrößerung, um die Zielregion des Nabels frei schweben zu lassen.Für Querschnitte heben und platzieren Sie das lumbo-sakrale Segment auf einer befestigten Route auf einem vorgeschnittenen Polystyrolblock mit einem flachen Kanalschnitt in der Mitte. Verwenden Sie dann Cyanacrylat-Klebstoff, um den Block und die Schnur an der Trennplattform zu befestigen und in das Schneidbad zu legen, das eiskalte Saccharose-Kunst-CSF-Aufschlämmung enthält. Sobald die 300 Mikrometer dicken Scheiben erhalten sind, geben Sie die Scheiben in eine Inkubationskammer mit Luftschnittstelle, die sauerstoffreiches künstliches CSF enthält, und lassen Sie die Scheiben bei Raumtemperatur eine Stunde lang ausgleichen.Um mit der Aufzeichnung der dorsalen Hornaktivität zu beginnen, übertragen Sie die Scheibe aus dem Inkubator in den MEA-Brunnen mit einer großen Pasteurpipette, die mit künstlichem CSF gefüllt ist, und fügen Sie zusätzliches künstliches CSF hinzu. Verwenden Sie einen feinen Kurzhaarpinsel, um die Scheibe über dem 60-Elektroden-Aufnahme-Array zu positionieren. Legen Sie dann einen gewichteten Hals über das Gewebe, um es an Ort und Stelle zu halten und einen guten Kontakt mit MEA-Elektroden zu fördern.Platzieren Sie die MEA in der Aufnahmekopfbühne. Überprüfen Sie die Position des Gewebes über den Elektroden mit einem inversen Mikroskop, um zu bestätigen, dass sich so viele Elektroden wie möglich unter dem oberflächlichen DH befinden. Stellen Sie sicher, dass mindestens zwei bis sechs Elektroden die Scheibe nicht berühren. Nachdem Sie die Kamera an das Gerät angeschlossen haben, nehmen Sie ein Referenzbild des Schnitts relativ zum MEA auf, das während der Analyse verwendet werden kann.Drücken Sie dann in der Aufzeichnungssoftware auf Datenerfassung starten und vergewissern Sie sich, dass alle Elektroden ein klares Signal empfangen. Als nächstes befestigen Sie die Perfusionseinlass- und Auslassleitungen an der MEA, die mit künstlichem CSF gefüllt ist, und schalten Sie das Perfusionssystem ein. Überprüfen Sie die Durchflussrate und stellen Sie sicher, dass der Abfluss ausreicht, um einen Überlauf des Superfusats zu verhindern.Nachdem Sie das Gewebe fünf Minuten lang ausgeglichen haben, zeichnen Sie die Rohbasisdaten fünf Minuten lang auf. Bewegen Sie die Perfusionseinlassleitung von künstlichem CSF zu einer 4-Aminopyridin-Lösung und warten Sie 12 Minuten, bis die 4-Aminopyridin-induzierte rhythmische Aktivität einen stabilen Zustand erreicht hat. Zeichnen Sie dann fünf Minuten 4-Aminopyridin-induzierter Aktivität auf und bereiten Sie sich auf die nachfolgenden Aufzeichnungen vor, um die Medikamente zu testen oder die Stabilität von 4-Aminopyridin zu überprüfen.Nach jeder Aufnahmesitzung spülen Sie die Leitungen mit künstlichem CSF. Nachdem Sie das MEA aus dem Kopfstadium entfernt und das Netz und das Gewebe aus dem MEA-Brunnen entfernt haben, spülen Sie das MEA und das Netz mit künstlichem Liquor aus und wiederholen Sie den gesamten Vorgang mit einer neuen Scheibe. Öffnen Sie die Analysesoftware und laden Sie das vorgefertigte Analyselayout.Öffnen Sie die Datei von Interesse und deaktivieren Sie die Referenzelektrode und alle Elektroden, die als übermäßig laut erachtet werden. Legen Sie das Zeitfenster für die Analyse fest. Wechseln Sie dann zur Registerkarte Cross-Channel-Filter.Wählen Sie die komplexen Referenz- und Referenzelektroden basierend auf dem aufgenommenen Bild und den während des Experiments gemachten Notizen aus und drücken Sie Erkunden, bevor Sie fortfahren. Wechseln Sie zur Registerkarte EAP-Filter und wenden Sie einen Butterworth-Hochpassfilter zweiter Ordnung an, um LFP-Aktivitäten zu entfernen. Wechseln Sie zur Registerkarte LFP-Filter, und wenden Sie einen Butterworth-Filter zweiter Ordnung an, um EAP-Aktivitäten zu entfernen.Stellen Sie auf der Registerkarte EAP-Detektor sicher, dass Sie den automatischen Schwellenwert auswählen, die Kontrollkästchen für steigende und fallende Kanten aktivieren und die Totzeit auf drei Millisekunden festlegen. Um positive und negative Schwellenwerte festzulegen, überprüfen Sie die Daten, indem Sie zum Bildschirm des Rohdatenanalysators zurückkehren, die Zeitmarkierung verschieben, zur Registerkarte EAP-Detektor zurückkehren und auf Durchsuchen klicken. Wiederholen Sie den Vorgang, bis der festgelegte Erkennungsschwellenwert EAPs erfasst, ohne Rauschen oder nicht-physiologische Aktivitäten zu erfassen.Stellen Sie auf der Registerkarte LFP-Detektor sicher, dass Sie den manuellen Schwellenwert auswählen, die Kontrollkästchen für steigende und fallende Kanten aktivieren und die Totzeit auf drei Millisekunden einstellen. Legen Sie den Schwellenwert für eine Elektrode fest und wählen Sie nach Zufriedenheit auf alle anwenden aus, und drücken Sie dann Analyse starten. Die Badanwendung des spannungsgesteuerten Natriumkanalantagonisten Tetrodotoxin beseitigte sowohl die EAP- als auch die LFP-Aktivität und bestätigte die Spike-Abhängigkeit dieser Signale.Die Stabilität von 4-Aminopyridin-induzierten Aktivitätsparametern wurde für EAP oder LFP charakterisiert. Alle Aktivitätsmerkmale plus die Koinzidenz der Aktivität für LFPs waren stabil, basierend auf der Ähnlichkeit der 4-Aminopyridin-induzierten Aktivität 12 Minuten nach der 4-Aminopyridin-Anwendung und 15 Minuten später. Die EAPs oder LFPs des Features waren durch eine Zunahme der Anzahl der gleichzeitig auftretenden Ereignisse gekennzeichnet, die über mehrere Elektroden hinweg erkannt wurden.Die Anzahl der verknüpften benachbarten Elektroden und die Stärke der Verbindungen zwischen benachbarten Elektroden und LFPs nach 4-Aminopyridin-Stimulation und dann relative Stabilität. Die Slice-Orientierung ist ein wichtiger Aspekt für In-vitro-Präparate. Die 4-Aminopyridin-Stimulation induzierte eine ähnliche rhythmische Aktivität im SDH, unabhängig von der Schichtorientierung.Um die Relevanz der 4-Aminopyridin-Aktivierung der DH-Netzwerke weiter zu beleuchten, wurde schließlich eine künstliche CSF-Lösung mit erhöhtem Kalium aufgetragen und gezeigt, dass sie eine ähnliche DH-Reaktion auf die 4-Aminopyridin-Stimulation hervorruft. Schlüsselschritte im Protokoll sind die Gewebevorbereitung und Platzierung von Abschnitten, die sicherstellen, dass das Gewebe durch sorgfältige, aber rechtzeitige Dissektion gesund ist, sowie eine empfindliche optimale Positionierung des Gewebes auf der MEA helfen, qualitativ hochwertige Ergebnisse zu erzielen.

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Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Das Video zeigt, wie man ein Mikroelektrodenarray (MEA) verwendet, um die elektrophysiologische Aktivität von Neuronen aufzuzeichnen, die aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) stammen. Die elektrophysiologische Aktivität eines Multiwell-MEA, das eine Neuron-Astrozyten-Co-Kultur enthält, wird aufgezeichnet, um Aktionspotentiale von mehreren Neuronen im Netzwerk zu detektieren und die erfolgreiche Differenzierung von hiPSCs in Neuronen zu bestätigen.

Messung der elektrophysiologischen Aktivität neuronaler Netzwerke mit Hilfe von Mikroelektrodenarrays

Dieses Video zeigt die Aufzeichnung spontaner und stimulationsabhängiger neuronaler Aktivität von primären murinen Spiralganglion Neuron (SGN)-Kulturen auf einem Multielektrodenarray (MEA). Es beinhaltet das Waschen und Vorbereiten des MEA, das Aufzeichnen spontaner neuronaler Aktivität und das Anwenden kontrollierter elektrischer Stimuli, um stimulationsabhängige neuronale Aktivität zu identifizieren.

Analyse der neuronalen Aktivität in primären Maus-Spiralganglien-Neuronen mit Hilfe von Multielektroden-Arrays

Dieses Video beschreibt die in vivo intrazelluläre Aufzeichnung von Rattenmotoneuronen unter transspinaler Gleichstromstimulation. Das Protokoll beschreibt, wie Membraneigenschaften gemessen und das rhythmische Feuern von Motoneuronen vor, während und nach der anodalen oder kathodalen Polarisation des Rückenmarks aufgezeichnet werden.

Transspinale Gleichstromstimulation des spinalen Motoneurons einer Ratte

Dieses Video zeigt einen Mikroelektrodenarray-basierten Assay zur Untersuchung der Aktivität neuronaler Netzwerke in Rückenmarksschnitten von Mäusen. Zunächst wird die elektrophysiologische Aktivität des oberflächlichen Hinterhorns (SDH) der Scheibe erfasst. Dann wird ein Kaliumkanal-Inhibitor eingeführt, um die Depolarisation zu verlängern, was zu einer synchronen rhythmischen Aktivität im gesamten neuronalen Netzwerk führt.

Mikroelektrodenarray-basierte Bewertung neuronaler Netzwerke in Rückenmarksschnitten von Mäusen

Dieses Video zeigt eine Einzelfaseraufzeichnung der C-Faser-Nervenleitung bei Ratten. Eine anästhesierte Ratte wird eingeschnitten, um den Ischiasnerv freizulegen, der die unteren Gliedmaßen sensorisch und motorisch versorgt. Anschließend werden die einzelnen C-Fasern freigelegt. Die elektrische Stimulation erfolgt mit Hilfe von Stimuluselektroden, die in den Fuß implantiert werden, und eine Reaktion wird von einer einzelnen Nervenfaser aufgezeichnet.

In vivo Einzelfaseraufzeichnung von C-Fasern des Ischiasnervs bei Ratten

Wir veranschaulichen, Aufzeichnungs- und elektrische Modulation von 4-Aminopyridine-induzierte epileptiformen Aktivität in Nagetier Gehirnscheiben mit Mikroelektrode Arrays durchzuführen. Eine benutzerdefinierte Aufnahme Kammer unterhält Gewebe Lebensfähigkeit während längerer experimentelle Sessions. Elektrode Zuordnung zu leben und Auswahl an anregenden Paare von eine benutzerdefinierte Benutzeroberfläche durchgeführt werden.

Aufnahme und Modulation der Epileptiformen Aktivität in Nagetier Gehirnscheiben gekoppelt mit Mikroelektrode Arrays

Wir entwickelten eine Technik, die gleichzeitig Electrocorticography und lokales Feld Potentiale in Reaktion auf Reize der nozizeptiven Laser von frei beweglichen Ratten aufzeichnet. Diese Technik hilft, eine direkte Verbindung von Electrocortical Signalen auf mesoskopischen und makroskopischen Ebene aufzubauen, die erleichtert die Untersuchung der nozizeptiven Informationsverarbeitung im Gehirn.

Gleichzeitige Aufnahmen von kortikalen lokales Feld Potentialen und Electrocorticograms in Reaktion auf Reize der nozizeptiven Laser von frei beweglichen Ratten

Die Singlefaseraufzeichnung ist eine effektive elektrophysiologische Technik, die auf das zentrale und periphere Nervensystem anwendbar ist. Zusammen mit der Vorbereitung der intakten DRG mit dem angeschlossenen Ischiasnerv wird der Mechanismus des Leitungsversagens untersucht. Beide Protokolle verbessern das Verständnis der Beziehung des peripheren Nervensystems mit Schmerzen.

Verwendung von In Vivo Single-Faser-Aufnahme und intakten DorsalWurzel Ganglion mit angeschlossenem Ischiasnerv, um den Mechanismus des Leitungsversagens zu untersuchen

Dieses Protokoll beschreibt die intrazelluläre In-vivo-Aufzeichnung von Rattenlenden-Motoneuronen mit gleichzeitiger transspinaler Gleichstromstimulation. Die Methode ermöglicht es uns, Membraneigenschaften zu messen und rhythmisches Abfeuern von Motoneuronen vor, während und nach der anodalen oder kathhodalen Polarisation des Rückenmarks aufzuzeichnen.

In Vivo intrazelluläre Aufzeichnung von typidentifizierten Ratten-Spinal-Motoneuronen während der Trans-Spinal-Gleichstromstimulation

APTrack ist ein Software-Plugin, das für die Open Ephys-Plattform entwickelt wurde und die Echtzeit-Datenvisualisierung und das Closed-Loop-Tracking neuronaler Aktionspotentiale ermöglicht. Wir haben dies erfolgreich in der Mikroneurographie für menschliche C-Faser-Nozizeptoren und C-Faser- und Aδ-Faser-Nozizeptoren der Maus eingesetzt.

Open-Source-Echtzeit-Closed-Loop-Tracking des elektrischen Schwellenwerts für die translationale Schmerzforschung

Hier präsentieren wir eine Methode zur Bewertung der Aktivierung und Blockade sensorischer Axone in peripheren Nerven in akuten, anästhesisierten, in vivo Rattenexperimenten mit zwei Arten von spinalen elektrophysiologischen Messungen, die die Aktivität von Nervenfasersubtypen unterscheiden können: lokale Feldpotenziale und Wide Dynamic Range Einzelneuronenaufnahmen.

Elektrophysiologische Methoden zur Beurteilung der peripheren Schmerzblockade bei einer anästhesierten Ratte

Erfahren Sie die Aufzeichnung von Netzwerkaktivität in spinalen nozizeptiven Schaltkreisen mit Mikroelektrodenarrays. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Schmerzverarbeitung und das Screening potenzieller antinozizeptiver Verbindungen.

Aufzeichnung der Netzwerkaktivität in spinalen nozizeptiven Schaltkreisen unter Verwendung von Mikroelektrodenarrays

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