Aufnahme und Modulation der Epileptiformen Aktivität in Nagetier Gehirnscheiben gekoppelt mit Mikroelektrode Arrays

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Neuromodulation für die Epilepsiebehandlung zu beantworten, z. B. welcher Hirnbereich und welches Stimulationsprotokoll am besten geeignet sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Nagetier-Hirnschnitte ein vereinfachtes, realistisches Modell von Gehirnschaltkreisen darstellen, während Mikroelektrodenarrays mehrere Beobachtungspunkte in bekanntem Abstand zwischen den Elektroden ermöglichen. Um die MEA vorzubereiten, verteilen Sie den elastomeren Dichtstoff gleichmäßig auf der Unterseite der Aufnahmekammer und stellen Sie sicher, dass keine Blasen vorhanden sind.

Montieren Sie anschließend die Aufnahmekammer mit Hilfe einer Pinzette auf den MEA und üben Sie leichten Druck aus. Verteilen Sie eine Dichtschicht um den äußeren Rand der Aufnahmekammer. Stellen Sie dann die MEA/Kammer-Baugruppe in eine geschlossene, feuchte Umgebung und lassen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur aushärten.

Um das Aufnahmepult vorzubereiten, stellen Sie das warme Bad auf 32 Grad Celsius ein. Gießen Sie anschließend das Halte-ACSF in die Halte- und Vorwärmkammer. Blasen Sie die Lösungen mit einem Gemisch aus 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid und entfernen Sie alle eingeschlossenen Blasen mit einer umgekehrten Pasteurpipette.

Halten Sie die Warmhaltekammer bei Raumtemperatur und stellen Sie die Vorwärmkammer in das warme Bad. Bereiten Sie horizontale Hippocampus-Cortex-Hirnschnitte nach Standardverfahren vor und lassen Sie sie mindestens 60 Minuten lang in der Haltekammer bei Raumtemperatur erholen. Gießen Sie 4AP ACSF in eine Inkubationskammer.

Blasen Sie es dann mit einem Gemisch aus 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid und entfernen Sie alle eingeschlossenen Blasen mit einer umgekehrten Pasteurpipette. Decken Sie anschließend die Kammer ab und stellen Sie sie in das warme Bad. Stellen Sie sicher, dass die ACSF- und 4AP-ACSF-Temperaturen 30 bis 32 Grad Celsius betragen.

Verwenden Sie eine Pasteurpipette aus umgekehrtem Glas, um eine Gehirnscheibe in die Vorwärmkammer zu übertragen, und lassen Sie das Gewebe 25 bis 30 Minuten ruhen. Übertragen Sie dann die Gehirnscheibe in die 4AP ACSF-Inkubationskammer und lassen Sie sie 60 Minuten ruhen. Lassen Sie das 4AP ACSF durch den Perfusionsschlauch in ein Becherglas fließen, bis sich keine Luft mehr im Inneren befindet.

Stoppen Sie dann den Lösungsfluss. Setzen Sie den trockenen MEA-Chip in den MEA-Verstärker ein, und befestigen Sie den Verstärkerkopf. Verwenden Sie anschließend eine Pasteurpipette aus Kunststoff, um 4AP ACSF in das Einlass- und Auslassreservoir der Aufnahmekammer zu übertragen.

Befestigen Sie die Heizkanüle an einer Magnethalterung und platzieren Sie die Spitze in der Einlassöffnung der Aufnahmekammer. Befestigen Sie dann die Magnethalterung an einem Magnetstreifen am MEA-Verstärkerkopf. Verbinden Sie den Perfusionsschlauch mit der Kanüle und die Kanüle mit dem Thermostat

Setzen Sie anschließend die Saugnadel in den Auslaufbehälter ein. Stellen Sie sicher, dass ein Unterdruck vorhanden ist, indem Sie die Saugnadel in das ACSF eintauchen, und prüfen Sie, ob ein konstantes niederfrequentes Sauggeräusch vorhanden ist. Stellen Sie als Nächstes den Durchflussregler so ein, dass er eine Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute zulässt, und beginnen Sie mit dem Perfusieren.

Sobald der 4AP ACSF durch die Kanüle fließt, schalten Sie den Thermostat ein. Stellen Sie die Heizkanüle auf 37 Grad Celsius und die MEA-Basis auf 32 Grad Celsius ein, um eine Temperatur von 32 bis 34 Grad Celsius in der Aufnahmekammer zu erreichen. Platzieren Sie dann die externe Referenzelektrode in dem Einlassbehälter der Aufnahmekammer.

Sobald der 4AP ACSF-Pegel und die Aufnahmetemperatur wie gewünscht stabilisiert sind, drehen Sie die Perfusion und die Saughähne in die Aus-Position, um sie vorübergehend zu stoppen. Übertragen Sie schnell ein Hirnschnitt mit einer Pasteur-Pipette aus umgekehrtem Glas in die MEA-Aufnahmekammer. Passen Sie die Position auf dem MEA-Aufnahmebereich nach Bedarf mit einer feuerpolierten, gewellten Pasteur-Pipette oder einer weichen, kompakten, kleinen Bürste an.

Platzieren Sie den Niederhalteanker auf der Hirnscheibe. Starten Sie die Perfusion und die Absaugung, indem Sie die Absperrhähne wieder in die Ein-Position drehen. Machen Sie ein Foto des Gehirnschnitts mit einer Kamera, die auf einem inversen Mikroskoptisch montiert ist.

Führen Sie dann das Skript mapMEA auf der Computersoftware aus, um die GUI zum Zuordnen der Elektroden zu starten. Klicken Sie auf die Schaltfläche Durchsuchen, um das Bild des Gehirnschnitts zu laden. Stellen Sie sicher, dass die Referenzelektrode in der oberen Spalte der linken Hälfte der MEA angezeigt wird.

Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Zeiger aktivieren. Wählen Sie die obere und untere Elektrode in der Spalte ganz links des Arrays aus, um die XY-Koordinaten für die Bildbegradigung und das Elektrodenmapping zu markieren. Wählen Sie im Dropdown-Menü "Slice-Typ" die Option "Horizontal" aus.

Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Standardstrukturen. Wählen Sie mit den nummerierten Schaltflächen unterhalb des Gehirnschnittbildes die Elektroden aus, die dem ROI entsprechen, und klicken Sie auf die entsprechenden Drucktasten im Strukturpanel, um sie zuzuweisen. Wiederholen Sie diesen Schritt für jeden ROI.

Drücken Sie anschließend die Schaltfläche Speichern. Die Software generiert einen Ergebnisordner mit einer Tabelle, in der die ausgewählten Elektroden und ROIs aufgeführt sind. Schalten Sie für elektrophysiologische Untersuchungen die Stimuluseinheit mindestens 10 Minuten vor dem Stimulationsprotokoll ein, um eine Selbstkalibrierung und Stabilisierung zu ermöglichen.

Starten Sie dann die Stimulussteuerungssoftware und überprüfen Sie, ob der Stimulator und der MEA-Verstärker korrekt angeschlossen sind, was durch eine grüne LED auf dem Hauptfeld der Stimulussteuerungssoftware angezeigt wird. Richten Sie die Stimulation in bipolarer Konfiguration ein. Verbinden Sie die Stimuluseinheit mit dem Boden.

Verbinden Sie dann die Elektrodenpaare, die mit der pyramidalen Zellschicht des CA1/proximalen Subiculums in Kontakt stehen, mit denen, die mit dem Skript mapMEA abgebildet wurden. Um Daten zu erfassen, drücken Sie die Wiedergabetaste im Hauptfenster der Aufnahmesoftware. Mindestens vier iktale Entladungen sind zu protokollieren.

Führen Sie als Nächstes einen schnellen Eingabe-/Ausgabetest durch, um die beste Reizintensität zu ermitteln. Verwenden Sie dazu das Hauptpanel, um einen quadratischen biphasischen positiv-negativen Stromimpuls mit einer Dauer von 100 Mikrosekunden pro Phase zu entwerfen. Geben Sie auf der Registerkarte Impulsamplitude eine anfängliche Impulsamplitude von 100 Mikroampere pro Phase ein.

Stellen Sie den Stimulationsimpuls auf 0,2 Hertz oder niedriger ein, indem Sie ein Interpulsintervall von fünf Sekunden oder länger hinzufügen. Erhöhen Sie die Stimulusamplitude bei jedem Versuch um 50 bis 100 Mikroampereschritte, bis die Stimulation zuverlässig interiktale Ereignisse in den parahippocampalen Kortexen hervorrufen kann. Für die elektrische Modulation der limbischen Iktogenese programmieren Sie die Stimuluseinheit so, dass sie das interessierende Stimulationsprotokoll liefert, und verwenden Sie die während des Eingangs-/Ausgangstests identifizierte Stimulusamplitude.

Nachdem die Stimulation gestoppt ist, überprüfen Sie die Wiederherstellung des Netzwerks in den Zustand vor dem Stimulus, indem Sie mindestens vier iktale Entladungen aufzeichnen. Diese Abbildung zeigt die Aufzeichnungen der 4AP-induzierten iktalen Aktivität im entorhinalen Kortex und im perirhinalen Kortex während der Kontrollbedingung, der periodischen Stimulation bei einem Hertz und während der Erholung nach dem Stimulusentzug. Diese Grafik zeigt die Quantifizierung des Effekts einer periodischen Stimulation bei einem Hertz, was auf eine signifikante Verkürzung der Gesamtzeit während der Stimulation hinweist.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei bis vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, den Hirnschnitt schnell und korrekt auf dem MEA zu platzieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie pharmakologische Manipulation durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über den Beitrag von Neurotransmittern oder Ionenkanälen zur epileptiformen Aktivität und zur Wirkung der Neuromodulation zu beantworten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Neurowissenschaften, die Interaktion neuronaler Netzwerke bei Gesundheit und Krankheit in kultivierten Neuronen sowie in Gehirnschnitten zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die epileptiforme Aktivität, die durch Vier-Aminopyridin in Nagetier-Hirnschnitten, die an MEAs gekoppelt sind, aufzeichnen und elektrisch modulieren können.