Name: Aufnahme und Modulation der Epileptiformen Aktivität in Nagetier Gehirnscheiben gekoppelt mit Mikroelektrode Arrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Lernen Sie die Aufnahme und elektrische Modulation epileptiformer Aktivität in Nagetier-Hirnschnitten mit Mikroelektrodenarrays. Diese Methode unterstützt die Entwicklung neuer Therapien für Epilepsie.

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G.P ist Marie Skłodowska-Curie Fellow finanzierten Projekts Europäische Union MSCA-IF-2014 Re.B.Us, G.A n.660689, unter dem Rahmenprogramm H2020. Die GUI-MapMEA ist frei verfügbar auf Anfrage, ilaria.colombi@iit.it zu erstellen.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

MEAs sind ein unverzichtbares Werkzeug für Neurophysiologie Untersuchungen und Reife erreicht haben, in den letzten Jahren dank jahrzehntelanger Forschung und Entwicklung. Im Vergleich zu konventionellen Bereich mögliche Aufnahme bieten MEAs den großen Vorteil eine höhere Anzahl von Beobachtungspunkten und bekannten Inter Elektrodenabstand für neuronale Netzwerk Interaktionen genau zu lokalisieren.
Die MEA-Aufnahmetechnik kann auch andere Elektrophysiologie Ansätze, wie z.B. Patch-Clamp Aufnahme15, zu untersuchen, die Beziehung zwischen einzelnen Nervenzelle und neuronalen Netzwerk-Aktivität gekoppelt werden. Darüber hinaus bieten die Möglichkeit der Visualisierung Feld Potenziale und mehrgliedrige Aktivität gleichzeitig wertvolle Einblicke in den Zusammenhang zwischen der Aktivität der kleinen neuronaler Ensembles und kollektive neuronale Netze. Die Kombination mit Spannung-empfindlichen Farbstoffen, Kalzium-Bildgebung und optogenetik29 ermöglicht Neurophysiologie Phänomene mit polyedrischen Ansätzen ableiten. Neben der pharmakologischen Studien, die Möglichkeit der Durchführung, Aufzeichnung und Stimulation mit dem gleichen System macht die MEA-Aufnahmetechnik sehr leistungsstark und vielseitig: zum Beispiel ist es möglich, die Synaptische Plastizität Phänomene zu studieren die Kern des Speicher Bildung30, über das hier vorgestellte Neuromodulation-Protokolle, DBS, Epilepsie und eine Vielzahl von Erkrankungen des Gehirns zu behandeln sind. Der jüngste Beweis dafür, dass die MEA-Aufnahmetechnik auf epileptischen Gehirn Gewebe16 erfolgreich angewendet werden kann zeigt seine unschätzbare Nützlichkeit in der Epilepsie-Forschung, beide, die grundlegenden Mechanismen dieser verheerenden Krankheit zu verstehen und zur Feinabstimmung der DBS-Algorithmen, um es zu verbessern.
MEAs zwingt jedoch die Ausübung der Elektrophysiologie Experimente unter "begrenzen" Bedingungen für Gehirnscheiben durch das Erfordernis einer versunkenen Aufnahme Kammer und die Notwendigkeit der lassen des Gehirns Rest in Scheiben schneiden, auf dem festen Untergrund wo die Mikro-Elektroden integriert sind. So erhalten Hirngewebe nicht ausreichende Sauerstoffversorgung, die wiederum die Qualität der Aufnahmen beeinträchtigen können.
Die hier beschriebenen Protokoll ermöglicht zuverlässig erfassen und studieren Ictogenesis in Nagetier limbischer Netze gekoppelt mit MEAs mit dem akuten 4AP in-vitro-Modell und längere Epochen der elektrischen Stimulation zu verfolgen, die relevanten für die Bewertung Informationen der DBS-Politik.
Frühere Studien über elektrische Neuromodulation epileptischen limbischer Netze basiert auf der Verwendung von konventionellen Bereich mögliche Aufnahme habe entweder mit Maus oder Ratte Gehirnscheiben mit ähnlichen Ergebnissen24,25; aber die Verwendung des Gehirngewebes Ratte erwies sich als schwieriger, einigermaßen aufgrund der schwächeren Konnektivität im Vergleich zu Hirngewebe von Mäusen7erhalten. Im Hinblick auf die MEA-Technik eignen sich Maus Gehirnscheiben aufgrund ihrer geringeren Größe. Darüber hinaus ist die höhere Rate des Auftretens von iktalen wie Einleitungen in Maus versus Ratte Hirngewebe gegeben, es möglich, deutlich mehr Gehirnscheiben ganztägig eine experimentelle, die wiederum die Datensammlung schneller und effizienter macht, zu testen und können reduzieren Sie die Anzahl der verwendeten Tiere.
Bedeutung im Hinblick auf bestehende Methoden:
Iktale Entladungen erfasst mithilfe der benutzerdefinierten Kammer beschrieben hier scheinen ähnlich in Dauer und Rate des Auftretens, die mit der herkömmlichen MEA Ring Kammer und dem gleichen MEA-Typ (planare Mikro-Elektroden, vgl. 17) beobachtet. Es muss jedoch betont werden, dass Gehirn Scheibendicke deutlich reduziert werden, muss bei Verwendung der herkömmlichen Runde Aufnahme zusammen mit einer geringer Perfusion-Rate (1 mL/min), die die erfolgreiche Ausübung der Neuromodulation behindern kann durch Experimente schlechte Konnektivität.
In diesem Protokoll bietet eine Kleinserie benutzerdefinierte Aufnahme Kammer inspiriert vom Patch-Clamp Aufnahme Kammer Design stabile und zuverlässige Laminar-Flow, die entscheidend für die erfolgreiche Ausübung der MEA-Aufnahmen; Es erlaubt auch das Gehirn Schnittstärke bis 400 µm zu erhöhen, um einen fairen Kompromiss zwischen Gewebe Lebensfähigkeit und intrinsische Konnektivität zu erreichen. Es ist in der Tat erkannt, dass Laminar-Flow der Aufnahme-Lösung innerhalb der Kammer ist sehr wünschenswert für Gehirn Slice Elektrophysiologie, da es nicht durch Temperatur, Sauerstoff beeinflusst ist und pH-Gradienten, die im Rundschreiben-Flow zu beobachten sind Aufnahme Runde Kammern19,20,31 (wie die, die mit im Handel erhältlichen MEA zur Verfügung gestellt). Solche Steigungen führen experimentelle Voreingenommenheit und sind auch schädlich für das Gehirn-Scheibe. Aufnahme und Handelskammern ein relativ kleines Volumen (~1.5 mL) zusammen mit einer hohen Durchblutung Rate (5-6 mL/min)16,31 ermöglichen ausreichende Austausch des Mediums Perfusion (≥3 Mal / min). Die benutzerdefinierte Kammer lässt sich leicht aus kommerziellen Quellen zu einem erschwinglichen Preis gewonnen oder hergestellt im eigenen Haus 3D-Drucktechnologie. Andere Studien haben MEA Aufnahmen von 400 µm dicken menschliche Gehirn Scheiben16 mit der konventionellen MEA Ring Kammer, unter Beibehaltung der ACFS Volumen bis 1 mL und Durchsetzung einer hohen Durchblutung Rate (5-6 mL/min) mit Hilfe einer geräuscharmen Peristaltische Pumpe berichtet. Jedoch haben die Autoren verwendet ein anderes Modell der Ictogenesis, d. h., die niedrigen Mg2 +, das ist wahrscheinlich weniger als das Modell 4AP Ephaptic Mechanismen, bei denen erhebliche Zunahme extrazellulärer K+ Konzentration beeinflusst 11 , 22. Wir haben festgestellt, dass eine hohe Perfusion Rate nicht wünschenswert im 4AP Modell, möglicherweise aufgrund der schnellen Auswaschen von angesammelten extrazelluläre K+, die möglicherweise in der Aufnahme ACFS16deutlich erhöht werden. In der Tat erschien iktale Veranstaltungen "chunked" Wenn ASCF Perfusion Geschwindigkeit auf 2-3 mL/min erhöht wurde und die Gehirn-Scheibe wurde durch eine dicke Schicht der ACFS überflutet während ausgewachsene Entladungen präsentiert robuste Tonikum-klonischen Komponenten nach der Rückkehr nach wiederhergestellt werden konnte eine niedrigere Rate der Perfusion (1 mL/min) und ein dünner ACFS Schicht direkt an dem Gewebe Oberflächenniveau (Daten nicht gezeigt). Die individuelle Aufnahme Kammer beschrieben in diesem Protokoll ermöglicht den Austausch der Perfusion Medium 3-bis 5-Mal / min bei einer Durchflussmenge von 1 mL/min. So wird die gesamte Sauerstoffversorgung der Gehirnscheiben stark auch bei relativ geringer Perfusion verbessert, noch garantieren eine stabile Aufzeichnung von Temperatur und hohen Signal-Rausch-Verhältnis. Am wichtigsten ist, ist es möglich, die extrazelluläre K+ -Konzentration auf einen physiologischen Wert zu halten.
Das 4AP Modell des Ictogenesis ist nicht erforderlich, jede wesentliche Änderung der ACFS Ionische Zusammensetzung, wie Senkung Mg2 + oder zunehmende K+, und bietet den einzigartigen Vorteil des exzitatorischen und inhibitorischen Getriebe intakt zu halten 12, ein Aspekt, der in der Epilepsie-Forschung im Hinblick auf die entscheidende Rolle der glutamatergen und Gabaergen Netzwerke in epileptiformen Synchronisation (vgl. 7) von hoher Relevanz ist. Die in diesem Protokoll verwendeten 4AP-ACFS enthält eine physiologische Konzentration K+ (3,25 mM) und eine etwas geringere Mg2 + Konzentration als die Abhaltung ACFS (1 mM im Vergleich zu 1,3 mM). Diese Konzentration fällt noch unter den physiologischen Werten der Mg2 + -Konzentration in der Nager CSF und dient in vielen Laboratorien (siehe zum Beispiel17,18). Mit dem Zweck des Protokolls beschrieben haben wir festgestellt, dass diese leichte Abnahme bevorzugt wird, um die Wirkung der 4AP zu unterstützen.
In früheren Arbeiten wurde 4AP Gehirn Slice angewandt, wenn es bereits innerhalb der Aufnahme Kammer17,18positioniert wurde. Es sei denn, der Experimentator die Wartezeit zwischen der 4AP Anwendung und das Auftreten von epileptiformen Mustern zu beobachten muss, finden wir, dass dieser Ansatz ziemlich zeitaufwändig ist und eignet sich nicht für die längere Aufnahme und Stimulationssitzungen verfolgen in diesem Protokoll beschrieben. Vorinkubation von Gehirnscheiben in 4AP bei 32 ° C ermöglicht viel experimentelle Zeit zu schonen, da Gehirnscheiben Serie vorbehandelt werden können, während der Verfolgung des Experiments mit anderen Gewebeschnitten.
Die verlängerte Lebensfähigkeit der Gehirnscheiben nützlich Netzwerkfunktionen auf lange Sicht analysieren. Darüber hinaus ist ihre Verbesserte Widerstandsfähigkeit gegen repetitive Elektrostimulation von großem Vorteil, wenn der Experimentator will mehrere Stimulation Protokolle zu vergleichen, die in der gleichen Gehirn-Scheibe für statistische Robustheit ausgeführt werden müssen. In unseren Händen beim Testen von 3 Stimulation Protokolle jeweils eine Kontrolle Phase vorangestellt und gefolgt von einer Phase der Erholung, das Experiment dauert 3-5 h. Live MEA-Zuordnung ist in diesem Zusammenhang entscheidend, um den richtigen Weg zu aktivieren und zu unterdrücken, anstatt Ictogenesis über elektrische Stimulation zu begünstigen. Unsere benutzerfreundliche GUI stellt eine schnelle, einfache und flexible Tool die Elektroden der verschiedenen Gehirnstrukturen zugeordnet. Im Gegensatz zu kommerzieller Software ist es möglich, benutzerdefinierte MEA Layouts auch mit grundlegende Programmierkenntnisse hinzufügen. Bilder können im Hellfeld erworben werden; Damit eignet sich jede Allzweck-Kamera, die guten Auflösung und am Mikroskop passt. Einem inversen Mikroskop ist unerlässlich zur Visualisierung der Mikroelektroden-Position relativ zu der Gehirn-Scheibe, da diese unter das Gewebe verdeckt werden würde, wenn eine aufrechte Mikroskop verwenden. Jedoch ist ein Stereo-Mikroskop neben dem invertierten Typ empfohlen, der Experimentator Messer-Kürzungen um bestimmte neuronale Bahnen stören durchführen muss.
Schließlich ist ein weiterer Vorteil der vorgeschlagene Ansatz relativ einfach und billig Montage für den Großteil der benötigten Werkzeuge, wie benutzerdefinierte Aufnahme Kammer und die Holding-Kammern, das warme Bad sowie der Slice-Anker und die unnötige Verwendung von eine kostspielige Geräuscharme Peristaltische Pumpe.
Grenzen der Technik:
MEA-Aufnahme nicht erlaubt Visualisierung von sehr langsamen Wellen, d. h., DC verschiebt sich in das Signal. Diese Grundlinie Umlenkungen können helfen, asymptotische Messung des iktalen Entlastung Dauer und am wichtigsten ist, sie sind von grundlegender Bedeutung, kortikale ausbreitende Depression (ein Phänomen, das bezieht sich auf plötzliche unerwartete Todesfälle bei Epilepsie32 und teilen zu studieren zwischen Epilepsie und Migräne33).
In Bezug auf elektrische Neuromodulation erlaubt das hier beschriebene Protokoll mehrere Stimulationssitzungen ohne Gehirn Slice Lebensfähigkeit. Wir konnten erfolgreich führen bis zu 3 Stimulationssitzungen von 20-45 min, ähnlich, was in der früheren Arbeit25berichtet. Obwohl Gehirnscheiben wahrscheinlich eine höhere Anzahl von Stimulationssitzungen oder längere Stimulation Protokolle standhalten können, haben wir nicht in dieser Hinsicht Gehirnscheiben getestet. Wir empfehlen, Begrenzung der Anzahl der Stimulation Protokolle auf 3 und die Vermeidung von Stimulationssitzungen (≥60 min), verlängert die deutlich Hirngewebe unter diese Grenzbedingungen aufrechterhalten, bis der Mangel an Erholung nach Reiz Zurücknahme betonen kann.
Wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls:
Mehrere kritische Faktoren behindern das erfolgreiche Streben nach der Aufnahme und Modulation der epileptiformen Aktivität in Hirnschnitten an MEA gekoppelt. Neben der Nagetierarten verwendet und die Qualität der den Gehirnscheiben, die Perfusion Rate während der Aufnahme und die Dynamik der ACFS Strömung (i.e., laminar versus Rundschreiben) innerhalb der Aufnahme Kammer, haben wir festgestellt, dass die Bedingungen für Erholung und langfristige Erhaltung der Gehirnscheiben sowie die Art der 4AP Anwendung sind die wichtigsten Schritte.
Bei Verwendung einer versunkenen aufnahmekammer ist es wichtig, die Gehirnscheiben bei Raumtemperatur zu erhalten Gehirn Gewebe Netzwerkaktivität und begünstigen die Induktion von iktalen wie Einleitungen von 4AP Anwendung zu speichern. In unseren Händen verschlechtert Wiederherstellung und Wartung bei 32 ° C das Hirngewebe innerhalb von 3-4 h des Schneidens.
Inkubation des Gehirns Scheiben in 4AP ACFS bei Raumtemperatur und Aufnahme bei 32 ° C ist jedoch nicht wünschenswert. Wir haben viele Schwierigkeiten bei der Beobachtung robuste wiederkehrende iktalen Entladungen in diesem Zustand gefunden. In der Tat haben niedrige Temperaturen im Bereich von 20 – 24 ° C gemeldet, Dämpfen oder sogar verhindern 4AP-induzierte Ictogenesis sowohl in Vitro34 und in-Vivo-35. Damit die 4AP Inkubation und Aufnahme Temperaturen müssen innerhalb der 30-34 ° C fallen und müssen aufeinander abgestimmt sein. Um zu vermeiden, das Hirngewebe unter zu viel Stress wegen der gleichzeitigen Induktion der Übererregbarkeit 4AP und die plötzliche Exposition von Hirnschnitten von Raumtemperatur zu Warm (32 ° C) 4AP-ACFS setzen, ist es unerlässlich, eine fortgeschrittene Vorwärmen durchführen Schritt und lassen Sie die Gehirnscheiben in der Holding ACFS bei 32 ° C für 20-30 min., überspringen diesen Schritt gewöhnen können Ictogenesis Induktion durch 4AP auswirken.
Ein weiterer Aspekt erwähnt werden muss ist die Bedeutung der D-Glucose-Konzentration in der ACFS nach schneiden. Eine 25 mM-Konzentration bewahrt die Gehirnscheiben besser als die 10 mM-Konzentration in vielen Laboren verwendet und es verbessert auch die Rate des Auftretens von iktale Aktivität, die 2-fold schneller ist (, wodurch es leichter zu einer langen Reihe von experimentellen verfolgen Protokolle in mehreren Gehirnscheiben jeden Tag).
Zu guter Letzt einige wichtigeren Feinheiten während das slicing Verfahren erwähnt werden müssen. Erstens lassen Sie nicht die intakten Gehirn und Hirnschnitten zu frieren in der Kälte ACFS schneiden. Kühlung des Gehirns für < 2 min reicht angesichts der geringen Größe des Mäusegehirns. Gewebeschnitte sollte sofort aus dem Puffer-Fach auf die Spülung Becher bei Raumtemperatur übertragen werden. Spülen das Schneiden ist ACFS sehr wichtig, sonst die hohen Saccharose-Konzentration im Gehirn machen wird, die Scheiben auf das Nylon-Netz von der aufnahmekammer stick. Um das Gewebe effektiv zu spülen, ist es wichtig, die schneiden ACFS Inhalte innerhalb der transferpipette um die Abhaltung ACFS nicht übermäßig zu verunreinigen zu minimieren. Die 2-stufige Spülung hilft bei der Minimierung der Verschmutzung. Nach Abschluss des Verfahrens slicing sollte Gewebeschnitte von der Spülung Becher sofort übertragen werden, um die aufnahmekammer, wo die weichen Nylon mesh abgehängte halb in der Holding ACFS ermöglicht Gewebe-Oxigenierung auf beiden Seiten. Das gleiche Prinzip auf allen Stufen nach dem Aufschneiden Verfahren angewandt werden: Gehirnscheiben sollte niemals auf den Boden des Bechers sitzen, sie sollte nicht in Kontakt mit den Seiten der Kammern halten und sie sollten nie miteinander in Kontakt sein, noch überschneiden sich.
Modifikationen und Fehlerbehebung:
ACFS Zusammensetzung kann der Experimentator Bedürfnissen geändert werden. Beispielsweise können Medikamente hinzukommen, die Einbringung von bestimmten Neurotransmittern oder Ionenkanäle, die Wirksamkeit von elektrische Neuromodulation sezieren. Darüber hinaus können Brenztraubensäure und Ascorbinsäure (vgl. Tabelle 2) weggelassen werden, obwohl wir feststellen, dass sie eine starke neuroprotektive Rolle ausüben. Wir berichten in Tabelle 3 die häufigsten Probleme, die in diesem Protokoll und wie man damit umgeht angetroffen werden können.
Schlussfolgerungen:
MEA-Aufnahme ist zweifellos eine wertvolle Technik um die Wechselwirkungen von neuronalen Netzwerken in Gesundheit und Krankheit anzugehen. Neben pharmakologischen Studien ist es auch möglich, elektrische Neuromodulation Protokolle zu bewerten, die für DBS angewendet, Epilepsie und anderen neurologischen Erkrankungen sind. In diesem Protokoll haben wir gezeigt, dass es möglich, typische periodische Anregung Experimente mit ähnlichen Ergebnissen zu denen, die mit konventionellen extrazellulären Bereich mögliche Aufnahme zu reproduzieren und externe Elektroden stimulieren. Die zunehmende Verfügbarkeit von benutzerfreundlichen Handelsausrüstung und erweiterte Software-Tools machen die MEA-Aufnahmetechnik auch geeignet für geschlossene Stimulation Experimente, um ad-hoc- Stimulation um das Hirngewebe und bieten den Beitrag der Feedback-Mechanismen zu neuronalen Netzes Antworten zu untersuchen.

Epilepsie ist eine lebensbedrohliche progressive Erkrankung verursacht unkontrollierte Aktivität des Gehirns1; Es trägt unter der höchsten Belastung durch Krankheit und erhebliche soziale Stigmatisierung2,3. TLE ist das häufigste Syndrom (40 %) und die meisten häufig (~ 30 %) resistent gegen Antiepileptika Medikamente4. Während chirurgische Ablation des epileptogenen Gewebes den Zustand des Patienten zu verbessern kann, es ist nicht bei allen Patienten möglich und kann keine Garantie für eine völlig anfallsfrei Leben5. Modulation der epileptischen limbischer Netzwerke durch elektrische DBS ist ein vielversprechender Ansatz, wenn pharmakologische Behandlung oder Neurochirurgie sind nicht geeignet.
Nagetier Gehirnscheiben sind ein wertvolles Werkzeug, wie neuronale Netzwerke funktionieren in Gesundheit und Krankheit6 mittels in-vitro- Elektrophysiologie-Techniken zu studieren, wie sie, mindestens im Teil, die ursprüngliche Architektur und Vernetzung des Gehirns erhalten Region(en) Interest (ROI). Insbesondere horizontale kombinierte Hippocampus-entorhinalen Kortex (Hippocampus-EG) Scheiben umfassen die wesentlichen neuronalen Netzwerke TLE beteiligt und sind daher routinemäßig in in-vitro- TLE Forschung7beschäftigt.
Beschlagnahme-ähnliche Aktivität kann akut in Hirnschnitten verursacht werden, durch eine Änderung der Ionischen Zusammensetzung der künstlichen Liquor cerebrospinalis (ACFS), z. B. abnehmende Magnesium und Kalium8,9,10, erhöht oder durch pharmakologische Manipulationen, wie inhibitorischen Gabaergen Aktivität zu blockieren (siehe11 für eine umfassende Überprüfung). Diese Modelle basieren jedoch auf die einseitige Veränderung der Hemmung und Erregung; So ist es nicht möglich, die Untersuchung der Interaktion und konzertierte Beitrag von erregenden und hemmenden Netzwerken zum Ictogenesis. Kontinuierliche Perfusion der Gehirnscheiben mit convulsant Medikament 4AP verbessert exzitatorischen und inhibitorischen Neurotransmission, wodurch akute Ictogenesis zu studieren, während intakt zu halten synaptische Aktivität insgesamt12.
MEAs ermöglichen Aufzeichnung der elektrischen Aktivität erzeugt durch neuronale Netze aus einer größeren Anzahl von Beobachtungspunkten im Vergleich zu konventionellen extrazellulären Bereich mögliche Aufnahme, wo räumliche Beschränkungen begrenzen die Anzahl der Elektroden, die sein können auf der Gehirn-Scheibe-Oberfläche untergebracht. Darüber hinaus MEA Chips bieten den zusätzlichen Vorteil des bekannten Inter Elektrodenabstand, ist sehr nützlich, um Spur Ausbreitung und die Reisende Geschwindigkeit der aufgezeichneten Signale zu beurteilen. Obwohl ursprünglich konzipiert für die Aufnahme von kultivierten Neuronen13,14, MEAs jetzt dienen auch die elektrophysiologischen Eigenschaften von akuten Hirnschnitten von Nagetieren Menschen15 und16erhalten zu charakterisieren. So, im Rahmen der Epilepsie-Forschung, MEAs stellen ein wertvolles Werkzeug, neuronale Netze Interaktionen im Mittelpunkt des Ictogenesis16,17,18genau zu bestimmen.
MEA-Aufnahme trägt jedoch von Natur aus technischen Herausforderungen bei der Erlangung oder Aufrechterhaltung einer stabilen epileptiformen Musters in experimentelle Protokolle lange (mehrere Stunden). Erstens Sauerstoffversorgung der Gewebe nicht ausreichend in den großen und runden getaucht-Typ Aufnahme Kammer19,20 typisch für handelsübliche MEAs, während schlechten Signal-Rausch-Verhältnis und temperaturinstabilität auswirken könnte die Qualität der Aufnahme, wenn eine hohe Perfusion Rate (6-10 mL/min) wird verwendet, um die Sauerstoffzufuhr zum Gehirn-Scheibe zu verbessern (siehe zum Beispiel die technischen Hinweise auf Heizung und Perfusion Ausrüstung-21). Zweite, wiederkehrende Entladungen mit Hochfrequenz-Komponenten, wie z. B. epileptiformen Entladungen, eingehalten werden kaum Verwendung unter Wasser-Typ Aufnahme Kammern19; Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn das akute epileptiformen Muster chemisch induzierte ist und Ephaptic Mechanismen beinhaltet, wie es der Fall für die 4AP Modell22 ist (siehe11 für eine umfassende Darstellung). Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden mehrere Strategien von Forschern vorgeschlagen. Zum Beispiel sind erhöht die Perfusion Preis19,20 und gleichzeitig Gehirn Scheibendicke (≤300 µM) und Bereich17,18 entscheidende Faktoren zur Erreichung ausreichende Sauerstoffversorgung des Gewebes. Darüber hinaus kann verbesserte Gehirn Slice Lebensfähigkeit auch mithilfe von perforierten MEAs (pMEAs), wodurch das Hirngewebe von beiden Seiten18Vorrichtung erreicht werden.
Während die beschriebenen Ansätze die Machbarkeit der MEA-Aufnahme von Gehirnscheiben erheblich verbessert haben, sie wurden nicht getestet gegen verlängert (mehrere Stunden) Aufnahme- und elektrische Stimulationssitzungen, die letzteren repräsentiert einen bedeutenden Stress für das Hirngewebe. Längere Aufnahmen müssen gegebenenfalls die Entwicklung in der Zeit der Besonderheiten von epileptiformen Mustern zu untersuchen, das wäre nicht möglich, zu entlarven von kurzzeitmessungen. Im Rahmen des DBS Forschung möglicherweise längere experimentelle Protokolle müssen bewerten und vergleichen die Auswirkungen von mehreren Stimulation Paradigmen in der gleichen Gehirn-Scheibe.
Wenn nur spontane elektrischer Aktivität werden, Zuordnung der Elektroden in Bezug auf den ROI aufgezeichnet muss erfolgt in der Regel a Posteriori, d. h.während der Datenanalyse; Stattdessen erfordert die Untersuchung der evozierten Antworten oder elektrische Neuromodulation Paradigmen, dass Stimulation diktiert die Notwendigkeit des schnellen und einfachen live Elektrode Mapping während des Experiments zu bestimmten ROI(s) geliefert werden.
Hier zeigen wir ein einfaches experimentelle Protokoll, das der Induktion und Aufrechterhaltung eines stabilen 4AP-induzierte epileptiformen Musters in Erwachsenen Nagetier Gehirnscheiben ermöglicht. Die beobachteten Aktivität reproduziert treu die elektrophysiologischen Eigenschaften dieses Modells wie mit herkömmlichen extrazelluläre Elektrophysiologie Techniken charakterisiert. Es bleibt für mehrere Stunden und nachhaltige elektrischen Stimulation für wiederholte längere Epochen überdauert. Die Kammern verwendet, um beizubehalten und die Gehirnscheiben inkubieren können leicht montiert werden mit standard Laborbedarf (Abbildung 1A), während eine benutzerdefinierten Aufnahme Kammer ermöglicht optimale Lösung Wechselkurs und Laminar-Flow (Abbildung 1 b) können aus kommerziellen Quellen bezogen werden oder mit Hilfe von 3D Drucktechnologie zu einem erschwinglichen Preis. Schnelle Zuordnung des ROI(s) zur Echtzeit-Überwachung und für die Auswahl der stimulierenden Elektroden erfolgt durch eine benutzerdefinierte Benutzerfreundliches GUI namens MapMEA, frei verfügbar auf Anfrage möglich.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57548/57548fig1.jpg"> Abbildung 1: Custom-Ausrüstung für dieses Protokoll verwendet. (A) im Betrieb, die Kammern für Erholung, Vorwärmen und Vorinkubation im 4AP montiert werden mit einem Becher und einer Petrischale. Die Petrischale sollte im Durchmesser kleiner als der Breaker und ist mittels einer Spritzenkolben in Position gehalten. Der Boden der Petrischale wird ersetzt durch eine Nylon-Mesh (aus weichen Strümpfe) mit Cyanacrylat auf die Felge der Petrischale geklebt. Sauerstoff wird über eine verbogene Wirbelsäule Nadel (22 G), eingefügt zwischen den Wänden der Petrischale und den Becher geliefert. Bläschen sollte von der Seite des Bechers und nie erreichen die Nylon-Netzgewebe, Gehirn Slice Vertreibung zu vermeiden abzuzeichnen. Oben auf einer Petrischale kann als Deckel verwendet werden, zu vermeiden ACFS Verdunstung und Sauerstoffsättigung zu erhalten. (B) Custom Aufnahme Kammer. in: Einlass Behälter zur Aufnahme der Heizung-Kanüle und die Referenzelektrode. aus: Outlet-Reservoir, die Absaugung Nadel unterzubringen. REC: Aufnahme Kammer. (C) Glas Pasteurpipette, gelockt durch Feuer-Polieren, verwendet, um das Gewebe zu behandeln und ihre Position innerhalb der Aufnahme-Kammer. (D) Custom Scheibe Niederhalter Anker. (E) Endmontage der Aufnahme Kammer auf der MEA-Chip montiert. Ein Stück Gehirn ruht auf den Boden durch den Anker gehalten. Der rote Pfeil zeigt die PTFE-Schläuche für die Heizung-Kanüle, während der rote Kreis die Bezugselektrode eine gesättigte KCl-Pellet durch ACFS im Zulauf Behälter getaucht zeigt. Der blaue Pfeil zeigt die Saug Nadel in den Outlet-Stausee. <a href="/files/ftp_upload/57548/57548fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<table><tbody><tr><td>Poly-D-Lysin&nbsp;</td><td>Sigma-Adrich</td><td>P7886</td><td>Benötigt für MEA-Beschichtung</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Adrich</td><td>S9888</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Adrich</td><td>P9541</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Adrich</td><td>795488</td><td>Chemikalie</td></tr><tr><td>CaCl2*2 H2O</td><td>Sigma-Adrich</td><td>C3306</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Adrich</td><td>RDD016</td><td>Chemisches</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Adrich</td><td>S5761</td><td>Chemisches</td></tr><tr><td>MgCl2*6 H2</td><td>O Sigma-Adrich</td><td>M2670</td><td>Chemisches</td></tr><tr><td>MgSO4*6 H2O</td><td>Sigma-Adrich</td><td>M5921</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Adrich</td><td>RDD023</td><td>Chemische</td></tr><tr><td>Brenztraubensäure, 98%&nbsp;</td><td>Sigma-Adrich</td><td>107360</td><td>Chemisches</td></tr><tr><td>4-Aminopyridin</td><td>Sigma-Adrich</td><td>A78403</td><td>Krampfmittel</td></tr><tr><td>STG-2004</td><td>Mehrkanalsystem</td><td>STG4004-1,6mA</td><td>4-Kanal-Stimulusgenerator mit Spannung (&plusmn; 8 V) und Stromausgang (&plusmn; 1,6 mA)</td></tr><tr><td>MEA1060</td><td>Mehrkanalsystem</td><td>N/A</td><td>MEA Verstärker</td></tr><tr><td>planar MEA</td><td>Mehrkanalsystem</td><td>60MEA500/30iR-Ti ohne Ring</td><td>Muss ohne Ring sein, um die Verwendung der benutzerdefinierten Aufnahmekammer</td></tr><tr><td>zu ermöglichen McRack</td><td>Mehrkanalsystem</td><td></td><td>Aufnahmesoftware</td></tr><tr><td>McStimulus II</td><td>Mehrkanalsystem</td><td></td><td>STG4004 Steuerungssoftware</td></tr><tr><td>TC02</td><td>Mehrkanal-System</td><td>TC02</td><td>2-Kanal-Thermostat</td></tr><tr><td>PH01</td><td>Mehrkanal-System</td><td>PH01</td><td>Heizungs-Perfusionskanüle</td></tr><tr><td>MPH&nbsp;</td><td>Mehrkanal-System</td><td>MPH&nbsp;</td><td>Magnethalterung für PH01 und Saugnadel</td></tr><tr><td>Elastostil E43</td><td>Wacker</td><td>E43</td><td>Elastomer-Dichtstoff zur Montage der Custom Recording Kammer auf dem MEA</td></tr><tr><td>MEA Custom Chamber</td><td>Crisel Instrument</td><td>SKE-Kammer MEA</td><td>Custom Recording Chamber</td></tr><tr><td>Ag/AgCl Elektrode, Pellet, 1,0 mm&nbsp;</td><td>Crisel Instrument</td><td>64-1309</td><td>Referenzelektrode für die kundenspezifische Aufnahmekammer</td></tr><tr><td>Tergazyme</td><td>Sigma-Adrich</td><td>Z273287-1EA</td><td>Enzymatischer Reiniger</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The Mathworks</td><td></td><td>Programmierumgebung für Elektrodemapping</td></tr><tr><td>VT1000S</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1000S</td><td>Vibratome</td></tr><tr><td></td><td>Warner Instruments</td><td>64-1309</td><td>Ag-AgCl Elektroden-Pellet 1,0 mm (E205). Referenzelektrode.</td></tr></tbody></table>

aufnahme und modulation der epileptiformen aktivität in nagetier gehirnscheiben gekoppelt mit mikroelektrode arrays

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Temporallappen-Epilepsie (TLE) ist die am häufigsten teilweise komplexe epileptische Syndrome und am wenigsten reagiert auf Medikamente. Tiefe Hirnstimulation (DBS) ist ein vielversprechender Ansatz, wenn pharmakologische Behandlung fehlschlägt oder Neurochirurgie wird nicht empfohlen. Akute Gehirnscheiben gekoppelt mit Mikroelektrode Arrays (MEAs) stellen ein wertvolles Instrument zur neuronalen Netzes Interaktionen und deren Modulation durch elektrische Stimulation zu studieren. Im Vergleich zu herkömmlichen extrazelluläre Aufnahmetechniken geben sie die zusätzlichen Vorteile einer größeren Anzahl von Beobachtungspunkten und einem bekannten Inter Elektrodenabstand wodurch Studium der Ausbreitungsweg und Geschwindigkeit der elektrophysiologischen Signale. Gewebe-Oxigenierung kann jedoch stark beeinträchtigt bei MEA Aufnahme, erfordern eine hohe Perfusion Rate, die auf Kosten der geringeren Signal-Rausch-Verhältnis und höheren Schwingungen in die experimentelle Temperatur kommt. Elektrischer Stimulation weiter betont, dass das Hirngewebe, macht es schwierig, längere Aufnahme/Stimulation Epochen zu verfolgen. Darüber hinaus muss die elektrische Modulation der Aktivität des Gehirns Slice gezielt bestimmte Strukturen/wegen innerhalb der Gehirn-Scheibe, wonach Elektrode Zuordnung schnell und einfach live während des Experiments aufgeführt werden. Hier veranschaulichen wir die Aufnahme und elektrische Modulation von 4-Aminopyridine (4AP) durchführen-induzierte epileptiformen Aktivität in Nagetier Gehirnscheiben mit planaren MEAs. Wir zeigen, dass das Hirngewebe aus Mäusen gewonnen Ratte Hirngewebe übertrifft und sich somit besser für MEA Experimente eignet. Dieses Protokoll gewährleistet, dass die Erzeugung und Aufrechterhaltung eines stabilen epileptiformen Musters, die originalgetreu reproduziert die elektrophysiologischen Eigenschaften mit konventionellen Bereich mögliche Aufnahme beobachtet, für mehrere Stunden anhält und überdauert aufrecht erhalten elektrische Stimulation für längere Epochen. Lebensfähigkeit der Gewebe im gesamten das Experiment wird durch den Einsatz einer kleinvolumigen benutzerdefinierte Aufnahme Kammer ermöglicht Perfusion Preise für laminare Strömung und schnelle Lösung Austausch auch bei niedrigen (1 mL/min) erreicht. Schnelles MEA-Mapping für Echtzeit-Überwachung und Auswahl der stimulierenden Elektroden erfolgt durch eine benutzerdefinierte grafische Benutzeroberfläche (GUI).

Wir veranschaulichen, Aufzeichnungs- und elektrische Modulation von 4-Aminopyridine-induzierte epileptiformen Aktivität in Nagetier Gehirnscheiben mit Mikroelektrode Arrays durchzuführen. Eine benutzerdefinierte Aufnahme Kammer unterhält Gewebe Lebensfähigkeit während längerer experimentelle Sessions. Elektrode Zuordnung zu leben und Auswahl an anregenden Paare von eine benutzerdefinierte Benutzeroberfläche durchgeführt werden.

Aufnahme und Modulation der Epileptiformen Aktivität in Nagetier Gehirnscheiben gekoppelt mit Mikroelektrode Arrays

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Neuromodulation für die Epilepsiebehandlung zu beantworten, z. B. welcher Hirnbereich und welches Stimulationsprotokoll am besten geeignet sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Nagetier-Hirnschnitte ein vereinfachtes, realistisches Modell von Gehirnschaltkreisen darstellen, während Mikroelektrodenarrays mehrere Beobachtungspunkte in bekanntem Abstand zwischen den Elektroden ermöglichen. Um die MEA vorzubereiten, verteilen Sie den elastomeren Dichtstoff gleichmäßig auf der Unterseite der Aufnahmekammer und stellen Sie sicher, dass keine Blasen vorhanden sind.Montieren Sie anschließend die Aufnahmekammer mit Hilfe einer Pinzette auf den MEA und üben Sie leichten Druck aus. Verteilen Sie eine Dichtschicht um den äußeren Rand der Aufnahmekammer. Stellen Sie dann die MEA/Kammer-Baugruppe in eine geschlossene, feuchte Umgebung und lassen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur aushärten.Um das Aufnahmepult vorzubereiten, stellen Sie das warme Bad auf 32 Grad Celsius ein. Gießen Sie anschließend das Halte-ACSF in die Halte- und Vorwärmkammer. Blasen Sie die Lösungen mit einem Gemisch aus 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid und entfernen Sie alle eingeschlossenen Blasen mit einer umgekehrten Pasteurpipette.Halten Sie die Warmhaltekammer bei Raumtemperatur und stellen Sie die Vorwärmkammer in das warme Bad. Bereiten Sie horizontale Hippocampus-Cortex-Hirnschnitte nach Standardverfahren vor und lassen Sie sie mindestens 60 Minuten lang in der Haltekammer bei Raumtemperatur erholen. Gießen Sie 4AP ACSF in eine Inkubationskammer.Blasen Sie es dann mit einem Gemisch aus 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid und entfernen Sie alle eingeschlossenen Blasen mit einer umgekehrten Pasteurpipette. Decken Sie anschließend die Kammer ab und stellen Sie sie in das warme Bad. Stellen Sie sicher, dass die ACSF- und 4AP-ACSF-Temperaturen 30 bis 32 Grad Celsius betragen.Verwenden Sie eine Pasteurpipette aus umgekehrtem Glas, um eine Gehirnscheibe in die Vorwärmkammer zu übertragen, und lassen Sie das Gewebe 25 bis 30 Minuten ruhen. Übertragen Sie dann die Gehirnscheibe in die 4AP ACSF-Inkubationskammer und lassen Sie sie 60 Minuten ruhen. Lassen Sie das 4AP ACSF durch den Perfusionsschlauch in ein Becherglas fließen, bis sich keine Luft mehr im Inneren befindet.Stoppen Sie dann den Lösungsfluss. Setzen Sie den trockenen MEA-Chip in den MEA-Verstärker ein, und befestigen Sie den Verstärkerkopf. Verwenden Sie anschließend eine Pasteurpipette aus Kunststoff, um 4AP ACSF in das Einlass- und Auslassreservoir der Aufnahmekammer zu übertragen.Befestigen Sie die Heizkanüle an einer Magnethalterung und platzieren Sie die Spitze in der Einlassöffnung der Aufnahmekammer. Befestigen Sie dann die Magnethalterung an einem Magnetstreifen am MEA-Verstärkerkopf. Verbinden Sie den Perfusionsschlauch mit der Kanüle und die Kanüle mit dem Thermostat.Setzen Sie anschließend die Saugnadel in den Auslaufbehälter ein. Stellen Sie sicher, dass ein Unterdruck vorhanden ist, indem Sie die Saugnadel in das ACSF eintauchen, und prüfen Sie, ob ein konstantes niederfrequentes Sauggeräusch vorhanden ist. Stellen Sie als Nächstes den Durchflussregler so ein, dass er eine Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute zulässt, und beginnen Sie mit dem Perfusieren.Sobald der 4AP ACSF durch die Kanüle fließt, schalten Sie den Thermostat ein. Stellen Sie die Heizkanüle auf 37 Grad Celsius und die MEA-Basis auf 32 Grad Celsius ein, um eine Temperatur von 32 bis 34 Grad Celsius in der Aufnahmekammer zu erreichen. Platzieren Sie dann die externe Referenzelektrode in dem Einlassbehälter der Aufnahmekammer.Sobald der 4AP ACSF-Pegel und die Aufnahmetemperatur wie gewünscht stabilisiert sind, drehen Sie die Perfusion und die Saughähne in die Aus-Position, um sie vorübergehend zu stoppen. Übertragen Sie schnell ein Hirnschnitt mit einer Pasteur-Pipette aus umgekehrtem Glas in die MEA-Aufnahmekammer. Passen Sie die Position auf dem MEA-Aufnahmebereich nach Bedarf mit einer feuerpolierten, gewellten Pasteur-Pipette oder einer weichen, kompakten, kleinen Bürste an.Platzieren Sie den Niederhalteanker auf der Hirnscheibe. Starten Sie die Perfusion und die Absaugung, indem Sie die Absperrhähne wieder in die Ein-Position drehen. Machen Sie ein Foto des Gehirnschnitts mit einer Kamera, die auf einem inversen Mikroskoptisch montiert ist.Führen Sie dann das Skript mapMEA auf der Computersoftware aus, um die GUI zum Zuordnen der Elektroden zu starten. Klicken Sie auf die Schaltfläche Durchsuchen, um das Bild des Gehirnschnitts zu laden. Stellen Sie sicher, dass die Referenzelektrode in der oberen Spalte der linken Hälfte der MEA angezeigt wird.Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Zeiger aktivieren. Wählen Sie die obere und untere Elektrode in der Spalte ganz links des Arrays aus, um die XY-Koordinaten für die Bildbegradigung und das Elektrodenmapping zu markieren. Wählen Sie im Dropdown-Menü "Slice-Typ" die Option "Horizontal" aus.Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Standardstrukturen. Wählen Sie mit den nummerierten Schaltflächen unterhalb des Gehirnschnittbildes die Elektroden aus, die dem ROI entsprechen, und klicken Sie auf die entsprechenden Drucktasten im Strukturpanel, um sie zuzuweisen. Wiederholen Sie diesen Schritt für jeden ROI.Drücken Sie anschließend die Schaltfläche Speichern. Die Software generiert einen Ergebnisordner mit einer Tabelle, in der die ausgewählten Elektroden und ROIs aufgeführt sind. Schalten Sie für elektrophysiologische Untersuchungen die Stimuluseinheit mindestens 10 Minuten vor dem Stimulationsprotokoll ein, um eine Selbstkalibrierung und Stabilisierung zu ermöglichen.Starten Sie dann die Stimulussteuerungssoftware und überprüfen Sie, ob der Stimulator und der MEA-Verstärker korrekt angeschlossen sind, was durch eine grüne LED auf dem Hauptfeld der Stimulussteuerungssoftware angezeigt wird. Richten Sie die Stimulation in bipolarer Konfiguration ein. Verbinden Sie die Stimuluseinheit mit dem Boden.Verbinden Sie dann die Elektrodenpaare, die mit der pyramidalen Zellschicht des CA1/proximalen Subiculums in Kontakt stehen, mit denen, die mit dem Skript mapMEA abgebildet wurden. Um Daten zu erfassen, drücken Sie die Wiedergabetaste im Hauptfenster der Aufnahmesoftware. Mindestens vier iktale Entladungen sind zu protokollieren.Führen Sie als Nächstes einen schnellen Eingabe-/Ausgabetest durch, um die beste Reizintensität zu ermitteln. Verwenden Sie dazu das Hauptpanel, um einen quadratischen biphasischen positiv-negativen Stromimpuls mit einer Dauer von 100 Mikrosekunden pro Phase zu entwerfen. Geben Sie auf der Registerkarte Impulsamplitude eine anfängliche Impulsamplitude von 100 Mikroampere pro Phase ein.Stellen Sie den Stimulationsimpuls auf 0,2 Hertz oder niedriger ein, indem Sie ein Interpulsintervall von fünf Sekunden oder länger hinzufügen. Erhöhen Sie die Stimulusamplitude bei jedem Versuch um 50 bis 100 Mikroampereschritte, bis die Stimulation zuverlässig interiktale Ereignisse in den parahippocampalen Kortexen hervorrufen kann. Für die elektrische Modulation der limbischen Iktogenese programmieren Sie die Stimuluseinheit so, dass sie das interessierende Stimulationsprotokoll liefert, und verwenden Sie die während des Eingangs-/Ausgangstests identifizierte Stimulusamplitude.Nachdem die Stimulation gestoppt ist, überprüfen Sie die Wiederherstellung des Netzwerks in den Zustand vor dem Stimulus, indem Sie mindestens vier iktale Entladungen aufzeichnen. Diese Abbildung zeigt die Aufzeichnungen der 4AP-induzierten iktalen Aktivität im entorhinalen Kortex und im perirhinalen Kortex während der Kontrollbedingung, der periodischen Stimulation bei einem Hertz und während der Erholung nach dem Stimulusentzug. Diese Grafik zeigt die Quantifizierung des Effekts einer periodischen Stimulation bei einem Hertz, was auf eine signifikante Verkürzung der Gesamtzeit während der Stimulation hinweist.Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei bis vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, den Hirnschnitt schnell und korrekt auf dem MEA zu platzieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie pharmakologische Manipulation durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über den Beitrag von Neurotransmittern oder Ionenkanälen zur epileptiformen Aktivität und zur Wirkung der Neuromodulation zu beantworten.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Neurowissenschaften, die Interaktion neuronaler Netzwerke bei Gesundheit und Krankheit in kultivierten Neuronen sowie in Gehirnschnitten zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die epileptiforme Aktivität, die durch Vier-Aminopyridin in Nagetier-Hirnschnitten, die an MEAs gekoppelt sind, aufzeichnen und elektrisch modulieren können.

recording-modulation-epileptiform-activity-rodent-brain-slices

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

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Elektroenzephalographie-basierte Aufzeichnungstechnik zur Aufzeichnung der epileptiformen Aktivität

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