Name: Ein ertragreiches Streptomyces-Transkriptions-Translation-Toolkit für synthetische Biologie und Naturstoffanwendungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Erfahren Sie die zellfreie Transkriptions-Translation mit Streptomyces venezuelae für die effiziente Synthese rekombinanter Proteine. Diese Methode ermöglicht die Expression von Genen mit hohem GC-Gehalt.

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Die Autoren danken für folgende Forschungsunterstützung: EPSRC [EP/K038648/1] für SJM als PDRA mit PSF; Wellcome Trust sponserte ISSF-Stipendium für SJM mit PSF am Imperial College London; Forschungsstipendium der Royal Society [RGS\R1\191186]; Wellcome Trust SEED Award [217528/Z/19/Z] für SJM an der University of Kent; und Global Challenges Research Fund (GCRF) Ph.D. Stipendium für KC an der University of Kent.

HINWEIS: Siehe Tabelle 1 und Tabelle 2 für Rezepte für GYM Medium und Agar Plate und S30A und S30B Waschpuffer.
1. Vorbereitung von Lösungen und allgemeinen Leitlinien
<ol><li>Bewahren Sie alle Lösungen, Zellen (nach dem Wachstum) und Zellextrakte nach der Zubereitung auf Eis auf, es sei denn, es wird eine Ausnahme angegeben.</li>
	<li>Lagervorräte für 1 M Mg-Glutamat, 4 M K-Glutamat, 40% (w/v) PEG 6000, 1 g/ml Polyvinylsulfonsäure bei Raumtemperatur und alle anderen Bestände bei -80 °C. Minimieren Sie die Anzahl der Gefrier-Tau-Zyklen, um einen chemischen Abbau zu vermeiden.</li>
	<li>Für die Erstellung von Energielösungsbeständen (siehe Tabelle 3) wie 3-PGA (erfordert pH-Einstellung) befolgen Sie die Anleitung im E. coli TX-TL-Protokoll41. HINWEIS: Alle Komponenten sind in ddH2O vollständig löslich und werden als Aliquots im -80 °C Gefrierschrank gelagert.</li>
	<li>Einzelne Bestände oder Energielösungen (später beschrieben) auf Eis abtauen. Den Aminosäurevorrat bei 42 °C mit Wirbeln für ~15-30 min erhitzen, um alle Aminosäuren zu lösen.</li>
	<li>Da einige Aminosäuren (L-Cys, L-Tyr, L-Leu) auf Eis ausfallen, während die Ruhezeit minimiert wird, lassen Sie diese Lösung bei Raumtemperatur und verwenden Sie einen Wirbel, um sich aufzulösen.</li>
	<li>Addieren Sie die berechneten Volumina (Tabelle 3) von Stammlösungen und Wasser und mischen Sie gut mit einem Wirbel.</li>
	<li>Aliquotieren Sie die Energielösung als 20-100 μL Aliquot pro Röhrchen, oder nach Wunsch auf Eis und lagern Sie sie bei -80 °C bis zur weiteren Verwendung.</li>
</ol>2. Vorbereitung von S. venezuelae ATCC 10712 Zellen
<ol><li>Tag 1 -Medien-/Puffervorbereitung und Vorkultur über Nacht<ol>
<li>1 l steriles GYM-Flüssigmedium wird in einem 2-Liter-Prallenkolben gemäß Tabelle 1 hergestellt. Siehe die Tabelle der Materialien für Geräte/Chemikalien/Reagenzienquellen.</li>
		<li>1 x 50 ml steriles GYM-Flüssigmedium werden in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben gemäß Tabelle 1 hergestellt.</li>
		<li>Bereiten Sie 100 ml 1 M HEPES-KOH pH 7,5, 100 ml 1 M MgCl2 und 500 ml 4 M NH4Cl Lösungen vor, um 1 l S30A und 1 l S30B-Waschpuffer herzustellen. Siehe Tabelle 2 für die Rezepte.</li>
		<li>Bereiten Sie die Vorkultur über Nacht vor. Das sterile 50 mL GYM Flüssigmedium in einem 250 mL Erlenmeyerkolben 30 min auf 28 °C vorwärmen.</li>
		<li>Impfen Sie eine einzelne Kolonie von S. venezuelae ATCC 10712 (oder verwandten Stamm) aus einer GYM-Agarplatte in vorgewärmte 50 ml GYM-Flüssigmedium und inkubieren Sie bei 28 ° C, 200 U / min für 16 h (Vorkultur über Nacht).</li>
	</ol></li>
	<li>Tag 2 - Bereiten Sie die Tagesvorkultur und die Hauptwachstumskultur vor.<ol>
<li>50 ml steriles GYM-Flüssigmedium in einem 250 mL Erlenmeyerkolben bei 28 °C für 30 min vorerwärmen.</li>
		<li>1 ml Vorkultur über Nacht in vorgewärmte 50 ml flüssiges GYM-Medium geben und bei 28 °C, 200 U/ min für 8 h inkubieren (Tagesvorkultur).</li>
		<li>Nach dieser Wachstumsperiode überprüfen Sie das OD600 in einem Spektralphotometer mit einer 1:10-Verdünnung mit sterilem GYM-Medium in einer 1 ml (1 cm Pfadlänge) Kunststoffküvette. HINWEIS: Der OD600 sollte mindestens 3-4 erreicht haben. Bei schlechtem Wachstum ist es ratsam, die Schritte 2.2.1-2.2.2 zu wiederholen.</li>
		<li>Subkultur 0,25 ml Tagesvorkultur in 1 l flüssiges GYM-Medium in 2 L prall gefüllten Kolben.</li>
		<li>Über Nacht bei 28 °C, 200 U/min für 14 h schütteln.</li>
	</ol></li>
	<li>Tag 3-Erntezellen<ol>
<li>Nach der vorherigen Inkubationszeit (14 h) ist die OD600 der Hauptkultur aufzuzeichnen. Verdünnen Sie die Übernachtungskultur 1:10 mit frischem GYM-Medium für die OD600-Messung . HINWEIS: Der OD600 sollte zu diesem Zeitpunkt 3,0-4,0 erreicht haben.</li>
		<li>Wenn OD600<3.0, erhöhen Sie die Schüttelgeschwindigkeit auf 250-300 U / min und wachsen Sie, bis ein OD600 von 3.0 erreicht ist. Wachsen Sie nicht länger als weitere 2 h (insgesamt 16 h).</li>
		<li>Wenn OD600>3.0, die Kulturen in Zentrifugationsbehälter geben und schnell auf Nassemis für 30 min abkühlen.</li>
		<li>Während Sie darauf warten, dass die Zellkultur auf Eis abkühlt, bereiten Sie 4 ml frische 1 M Dithiothreitol (DTT), S30A und S30B Puffer vor, wie in Tabelle 1 beschrieben, und bewahren Sie sie auf Eis auf. Siehe die Tabelle der Materialien für chemikalien/reagenzienquelle.</li>
		<li>Ein leeres 50-ml-Zentrifugenröhrchen vorwiegen und bei -20 °C vorkühlen.</li>
		<li>Fügen Sie 2 ml 1 M DTT zu 1 l S30A-Puffer auf Eis hinzu und mischen Sie gut. HINWEIS: Fügen Sie DTT nur vor der Verwendung zu den Waschpuffern S30A und S30B hinzu.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 6.000 × g, 4 °C, 10 min und verwerfen Sie den Überstand vorsichtig in einer schnellen und einzigen Bewegung. HINWEIS: Wenn das Pellet gestört ist, maximieren Sie die Zellretention mit dem verbleibenden GYM-Medium und setzen Sie das Protokoll fort.</li>
		<li>Fügen Sie 500 ml S30A-Puffer hinzu und resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie die Zentrifugationsflaschen kräftig schütteln, bis die Zellklumpen homogen verteilt sind.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 6.000 × g, 4 °C, 6 min und verwerfen Sie den Überstand vorsichtig. HINWEIS: Obwohl das Zellpellet zu diesem Zeitpunkt fester ist, verbleiben einige Zellen in Suspension (siehe Abbildung 1). Behandeln Sie wie in 2.3.7 beschrieben und behalten Sie so viele Zellen wie möglich.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.3.8-2.3.9.</li>
		<li>Fügen Sie 2 ml 1 M DTT zu 1 l S30B-Puffer auf Eis hinzu und mischen Sie gut. Fügen Sie den Zellen 500 ml S30B-Puffer hinzu. Wiederholen Sie Schritt 2.3.9.</li>
		<li>Resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 mL S30B-Puffer und geben Sie es in das vorgewogene, vorgekühlte 50 mL Zentrifugenröhrchen um. Übertragen Sie bei Bedarf die Restzellen mit einem zusätzlichen 5-10 mL S30B-Puffer. Füllen Sie bis zu 50 ml mit S30B.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 6.000 × g, 4 °C, 10 min und verwerfen Sie den Überstand vorsichtig.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 2.3.13.</li>
		<li>Den restlichen S30B-Überstand vorsichtig mit einer 100-200 μL Pipette absaugen.</li>
		<li>Wiegen Sie das Nasszellpellet. HINWEIS: Typisches Nasszellpelletgewicht für 1 L GYM-Kultur über Nacht (OD600 = 3,0) beträgt ~ 4,5 g.</li>
		<li>Für jeweils 1 g Nasszellen 0,9 ml S30B-Puffer hinzufügen. Resuspendieren Sie die Zellen entweder mit einer Pasteurpipette oder einem Wirbel.</li>
		<li>Zentrifugiere kurz (~10 s) bis zu 500 × g , um die Zellen zu sedimentieren. HINWEIS: Das Protokoll kann an dieser Stelle pausiert werden, und die Zellen können entweder auf flüssigem Stickstoff oder Trockeneis eingefroren und bei -80 ° C gelagert werden.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Zelllyse durch Beschallung, um den Rohzellextrakt zu erhalten
HINWEIS: In diesem Stadium kann der Benutzer wählen, ob er die Zellen durch Beschallung entweder in 1 ml Fraktionen (Option 1) oder als größere Zellsuspension (5 ml) in einem 50 ml Röhrchen (Option 2) stören möchte. Beide Optionen wurden im Folgenden beschrieben, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, da sich das endgültige Volumen der Zellsuspension aufgrund des Zellverlusts während früherer Ernte- und Waschschritte ändern kann. Ein neuer Benutzer sollte zuerst Option 2.1 versuchen, das Protokoll einzurichten.
<ol><li>Zelllyse durch Beschallung in 1 mL Fraktionen<ol>
<li>Mit einer 1 mL Pipettenspitze (das Ende der Spitze abschneiden, um die Bohrungsgröße zu erhöhen) wird 1 mL der Zellsuspension in 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. HINWEIS: Wenn die Zellen eingefroren sind, tauen Sie das 50-ml-Röhrchen, das das Pellet enthält, vor der Zelllyse schnell in lauwarmem Wasser auf. Übertragen Sie das Rohr auf Nasseis, sobald das Pellet zu tauen begonnen hat, und kühlen Sie es für 10 min.</li>
		<li>Legen Sie jedes Mikrozentrifugenrohr in ein Becherglas mit Eiswasser, wobei Sie ein Kunststoffrohrgestell verwenden, um das Rohr zur Beschallung zu halten. HINWEIS: Aufgrund der Empfindlichkeit des Zellextrakts gegenüber Überhitzung ist es wichtig sicherzustellen, dass sich die Röhrchen nicht erwärmen, um eine Proteinfällung und eine verminderte enzymatische Aktivität zu verhindern.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Ultraschallsonde mit einer Spitze von 3 mm Durchmesser und reinigen Sie sie mit 70% (v/v) Ethanol und doppelt destilliertem Wasser (ddH2O). Senken Sie die Ultraschallspitze in die Zellsuspension, bis sie sich ~1 cm unter der Flüssigkeitsoberfläche befindet.</li>
		<li>Geben Sie die folgenden Einstellungen in den Ultraschallgerät ein: 20 kHz Frequenz, 65% Amplitude, 10 s Impuls EIN-Zeit, 10 s Impulse AUS-Zeit, 1 min Gesamtschallationszeit.</li>
		<li>Führen Sie das Beschallungsprotokoll aus. Bewegen Sie die Röhre während der ersten beiden Ruhezyklen nach oben / unten und zur Seite, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig beschallt sind. Zeichnen Sie den Energieeintrag auf. HINWEIS: Tragen Sie aus Sicherheitsgründen während der Beschallung einen geeigneten Gehörschutz. Die Viskosität nimmt ab, wenn Zellen gestört werden, und das blasse Creme-Nasszellpellet sollte sich in eine homogene braune Flüssigkeit verwandeln. Der empfohlene Energieeintrag beträgt 240 J pro ml Nasszellen. Wenn die Zellen nur teilweise lysiert sind, erscheint die Suspension immer noch cremefarben mit viskosen Zellklumpen, insbesondere an den Seiten der Tube.</li>
		<li>Drehen Sie die Röhre 2-3 Mal um und wiederholen Sie die Beschallung für weitere ein oder zwei 10-s-Zyklen, mischen Sie häufig, bis die Zellen vollständig gestört sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zelllyse durch Beschallung einer 5 ml Zellsuspension<ol>
<li>Wenn die Zellen eingefroren sind, das 50-ml-Röhrchen, das das Pellet enthält, vor der Zelllyse in lauwarmem Wasser unter Schütteln schnell auftauen. Übertragen Sie das Rohr auf Nasseis, sobald das Pellet zu tauen begonnen hat, und kühlen Sie es für 10 min.</li>
		<li>Drehen Sie die Röhre kurz bei 500 x g , um die Zellen zu sedimentieren.</li>
		<li>Legen Sie das 50-ml-Rohr zur Beschallung in ein Becherglas mit Eiswasser. HINWEIS: Aufgrund der Empfindlichkeit des Zellextrakts gegenüber Überhitzung ist es wichtig sicherzustellen, dass sich die Röhrchen nicht erwärmen, um eine Proteinfällung und eine verminderte enzymatische Aktivität zu verhindern.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Ultraschallsonde mit einer Spitze von 6 mm Durchmesser und reinigen Sie sie mit 70% (v/v) Ethanol und ddH2O (siehe visuelles Schema der 6 mm Sonde in Abbildung 1). Senken Sie die Ultraschallspitze in die Zellsuspension (~5 ml) ab, bis sie sich ~1 cm unter der Flüssigkeitsoberfläche befindet.</li>
		<li>Geben Sie die folgenden Einstellungen in den Ultraschallgerät ein: 20 kHz Frequenz, 65% Amplitude, 10 s Impuls EIN-Zeit, 10 s Impulse AUS-Zeit, 1 min Gesamtschallationszeit pro ml Nasszellen (insgesamt 5 min).</li>
		<li>Führen Sie das Beschallungsprotokoll aus. Bewegen Sie die Röhre während der ersten beiden Ruhezyklen nach oben / unten und zur Seite, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig beschallt sind. HINWEIS: Tragen Sie aus Sicherheitsgründen während der Beschallung einen geeigneten Gehörschutz. Die Viskosität nimmt ab, wenn die Zellen gestört werden, und das blasse Creme-Nasszellpellet sollte sich in eine homogene braune Flüssigkeit verwandeln. Zeichnen Sie den Energieeintrag auf. Ein optimaler Energieeintrag von 240 J pro ml Nasszellen (~1200 J insgesamt ab 5 min Beschallung) wird empfohlen.</li>
		<li>Wenn einige Zellen intakt bleiben, befolgen Sie die Anweisungen in Schritt 3.1.5.</li>
		<li>Übertragen Sie die Zellextrakte in 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Zellextraktklärung und Abflussreaktion
<ol><li>Zentrifugieren Sie die lysierten Zellen bei 16.000 × g für 10 min bei 4 °C, um die Zelltrümmer zu entfernen. Den Überstand in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen als 1 mL Aliquots überführen.</li>
	<li>Führen Sie die Ablaufreaktion für die Zellextrakte durch. Die 1,5 ml Röhrchen, die die Zellextrakte enthalten, bei 30 °C für 60 min auf einem Wärmeblock oder Inkubator ohne zu schütteln inkubieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellextrakte bei 16.000 × g für 10 min bei 4 °C. Die Überstände in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen bündeln. Mischen Sie den Überstand, indem Sie das Rohr fünfmal umkehren, bis es homogen ist, und halten Sie es dann auf Eis. Kehren Sie vorsichtig um, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.</li>
	<li>Verdünnen Sie 10 μL des Zellextrakts 100-fach mit S30B-Puffer und messen Sie die Gesamtproteinkonzentration mit einem Bradford-Assay mit drei technischen Wiederholungen (siehe Supplemental Material S2 für Bradford Assay Guidance).</li>
	<li>Wenn die Proteinkonzentration 20-25 mg/ml beträgt, die Zellextrakte als 100 μL Aliquots in neue 1,5 ml Röhrchen überführen, in flüssigem Stickstoff schockgefrieren und bei -80 °C lagern. HINWEIS: Tragen Sie aus Sicherheitsgründen geeignete PSA, wenn Sie mit flüssigem Stickstoff umgehen, einschließlich Gesichtsschilden und Handschuhen.</li>
	<li>Wenn die Proteinkonzentration <20 mg/ml beträgt, wiederholen Sie die Schritte zur Herstellung des Rohextrakts, um sicherzustellen, dass die hochwertigen Zellextrakt- und TX-TL-Ausbeuten mit den zuvor veröffentlichten Arbeiten vergleichbar sind5.</li>
</ol>5. Vorbereitung der Plasmid-DNA-Vorlage
<ol><li>Reinigen Sie das pTU1-A-SP44-mScarlet-I-Plasmid (pUC19-Ursprung) aus einem frisch transformierten E. coli-Plasmidstamm (DH10β, JM109), der in 50 ml LB-Kultur (mit 100 mg / ml Carbenicillin) gezüchtet wurde, mit einem geeigneten Plasmid-DNA-Reinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Eluieren Sie das Plasmid in 2 x 300 μL nukleasefreiem Wasser und kombinieren Sie die Fraktionen.</li>
	<li>0,1 Volumen (66 μL) 3 M Natriumacetat (pH 5,2) zugeben.</li>
	<li>Fügen Sie 0,7 Volumen (462 μL) Isopropanol hinzu.</li>
	<li>Inkubieren Sie die DNA bei -20 °C für 30 min.</li>
	<li>Zentrifugiere bei 16.000 × g für 30 min bei 4 °C und verwerfe den Überstand.</li>
	<li>2 ml 70% (v/v) Ethanol in das DNA-Pellet geben.</li>
	<li>Invertieren Sie die Röhre 3-4 Mal, um das Plasmid-DNA-Pellet zu resuspendieren.</li>
	<li>Zentrifugiere bei 16.000 × g für 5 min bei 4 °C und entsorge den Überstand.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 5.7-5.9 und entfernen Sie alle sichtbaren Flüssigkeiten.</li>
	<li>Trocknen Sie das DNA-Pellet für 10-30 min an der Luft oder trocknen Sie es für 5 min mit einer Vakuumzentrifuge.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das getrocknete Pellet mit 600 μL nukleasefreiem ddH2O.</li>
	<li>Messen Sie die DNA-Konzentration und -Reinheit mit einem Spektralphotometer.</li>
	<li>50-100 μL Aliquots zubereiten und bei -20 °C lagern. HINWEIS: Eine hohe DNA-Konzentration im Bereich von 500-1000 ng/μL wird aufgrund der engen Volumenbeschränkungen zellfreier Reaktionen empfohlen. Verdünnen Sie den Plasmid-DNA-Stamm auf 80 nM; 168 ng/μL pTU1-A-SP44-mScarlet-I Plasmid entspricht 80 nM. </li>
</ol>6. Herstellung der Streptomyces Master Mix (SMM) Lösung
<ol><li>Aminosäurelösung<ol>
<li>Verwenden Sie das Aminosäure-Sampler-Kit, um manuelle Fehler zu vermeiden und die Vorbereitungszeit zu verkürzen, indem Sie die Anweisungen des Herstellers online befolgen.</li>
		<li>Verdünnen Sie die 20-fache Aminosäurenstammlösung mit ddH2O auf eine Endkonzentration von 6 mM (5 mM L-Leu).</li>
		<li>Weitere Verdünnung auf 2,4 mM (2 mM L-Leu) innerhalb der 2,4-fachen SMM-Lösung (siehe Tabelle 3). HINWEIS: Die Endkonzentration in der TX-TL-Reaktion beträgt 1 mM 19x Aminosäuren und 0,83 mM L-Leu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Energielösung und Additive<ol>
<li>Bereiten Sie die anderen Komponenten in der 2,4-fachen SMM-Lösung nach dem in Tabelle 3 beschriebenen Rezept vor.</li>
		<li>Alternativ können Sie eine 2,4-fache Minimalenergielösung (MES) nach dem in Tabelle 3 beschriebenen Rezept zubereiten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Einrichten einer Standard-S. venezuelae TX-TL-Reaktion
<ol><li>Tauen Sie den Zellextrakt, die SMM - (oder MES-) Lösung und die Plasmid-DNA auf Eis auf. Eine 384-Well-Platte bei -20 °C vorkühlen.</li>
	<li>Richten Sie TX-TL-Reaktionen ein, bei denen 25% des Volumens Plasmid-DNA, 33,33% Zellextrakt und 41,67% SMM-Lösung sind; Halten Sie sie auf Eis, um Startzeitverzerrungen zu vermeiden. HINWEIS: Es wurde eine Standard-TX-TL-Vorlage bereitgestellt (Tabelle 4), um das Volumen der benötigten Reagenzien basierend auf der Anzahl der Reaktionen zu berechnen. Das Standardvolumen für eine 33-μL-Reaktion ist wie folgt: 11 μL Zellextrakt, 13,75 μL SMM und 8,25 μL Plasmid-DNA.</li>
	<li>Wirbeln Sie die Mischung vorsichtig für ~ 5 s bei niedriger Geschwindigkeit, um sicherzustellen, dass die Lösung homogen ist. Schaumbildung/Blasenbildung vermeiden.</li>
	<li>10 μL Aliquots in drei Vertiefungen einer 384-Well-Platte als technisches Dreifaches überführen, ohne Luftblasen einzuführen. Verschließen Sie die Platte mit einer transparenten Abdeckung und drehen Sie sie bei 400 × g für 5 s.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Reaktion bei 28 °C entweder in einem Inkubator (für Endpunktmessungen) oder einem Plattenleser ohne Schütteln. HINWEIS: Reaktionen benötigen typischerweise 3-4 h, um den Abschluss zu erreichen. Siehe Ergänzungsmaterial S2 für Anleitungen zu einem Plattenleser und mScarlet-I-Standardmessungen.</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

In diesem Manuskript wurde ein ertragreiches S. venezuelae TX-TL-Protokoll mit detaillierten Schritten beschrieben, die sowohl für erfahrene als auch für neue Benutzer von TX-TL-Systemen einfach durchzuführen sind. Mehrere Funktionen aus den bestehenden Streptomyces45- und E. coli TX-TL41-Protokollen wurden entfernt, um ein minimales, aber ertragreiches Protokoll für S. venezuelae TX-TL5,26 zu etablieren.</sup...

Zellfreie Transkriptions-Translation-Systeme (TX-TL) bieten eine ideale Prototyping-Plattform für die synthetische Biologie, um schnelle Design-Build-Test-Learn-Zyklen zu implementieren, den konzeptionellen technischen Rahmen für die synthetische Biologie1. Darüber hinaus besteht ein wachsendes Interesse an TX-TL-Systemen für die hochwertige rekombinante Proteinproduktion in einer offenen Reaktionsumgebung2, um beispielsweise nicht-standardisierte Aminosäuren in Antikörper-Wirkstoff-Konjugate aufzunehmen3. Insbesondere benötigt TX-TL einen Zellextrakt, ein Plasmid oder lineare DNA und eine Energielösung, um die Proteinsynthese in Batch- oder semikontinuierlichen Reaktionen zu katalysieren. Während Escherichia coli TX-TL das dominierende zellfreie System ist, haben eine Reihe von aufkommenden Nicht-Modell-TX-TL-Systemen Aufmerksamkeit für verschiedene Anwendungen erregt4,5,6,7,8. Zu den Hauptvorteilen von TX-TL gehören die flexible Skalierbarkeit (Nanoliter-Liter-Skala)9,10, eine starke Reproduzierbarkeit und automatisierte Workflows8,11,12. Insbesondere die Automatisierung von TX-TL ermöglicht die beschleunigte Charakterisierung genetischer Teile und regulatorischer Elemente8,12,13.
In Bezug auf den Reaktionsaufbau benötigt TX-TL sowohl primäre als auch sekundäre Energiequellen sowie Aminosäuren, Cofaktoren, Additive und eine Template-DNA-Sequenz. Nukleotidtriphosphate (NTPs) stellen die primäre Energiequelle dar, um die anfängliche mRNA (ATP, GTP, CTP und UTP) und die Proteinsynthese (nur ATP und GTP) voranzutreiben. Um die TX-TL-Ausbeute zu erhöhen, werden NTPs durch den Katabolismus einer sekundären Energiequelle wie Maltose14, Maltodextrin15, Glucose14, 3-Phosphoglycerat (3-PGA)16, Phosphoenolpyruvat17 und L-Glutamat18 regeneriert. Diese inhärente Stoffwechselaktivität ist überraschend vielseitig, aber schlecht untersucht, insbesondere in aufkommenden TX-TL-Systemen. Jede Energiequelle hat unterschiedliche Eigenschaften und Vorteile in Bezug auf ATP-Ausbeute, chemische Stabilität und Kosten, was eine wichtige Überlegung für skalierte TX-TL-Reaktionen ist. Bisher haben die aktuellen Protokolle für E. coli TX-TL bis zu 4,0 mg/ml (~157 μM) für das grün fluoreszierende Modellprotein (GFP) erreicht, wobei eine Mischung aus 3-PGA (30 mM), Maltodextrin (60 mM) und D-Ribose (30 mM) als sekundäre Energiequelle verwendet wird19.
In jüngster Zeit ist das Interesse an der Untersuchung sekundärer Metaboliten-Biosynthesewege in TX-TL-Systemen gestiegen20,21,22. Insbesondere sind Actinobakterien eine Hauptquelle für Sekundärmetaboliten, einschließlich Antibiotika und Agrarchemikalien23,24. Ihre Genome sind mit sogenannten biosynthetischen Genclustern (BGCs) angereichert, die enzymatische Wege für die Sekundärmetabolit-Biosynthese kodieren. Für die Untersuchung der genetischen Teile von Actinobakterien und der Biosynthesewege wurde kürzlich eine Reihe von Streptomyces-basierten TX-TL-Systemen entwickelt5,6,25,26. Diese spezialisierten Streptomyces TX-TL-Systeme sind aus folgenden Gründen potenziell vorteilhaft: [1] Bereitstellung einer nativen Proteinfaltumgebung für Enzyme aus Streptomyces spp.26; [2] Zugang zu einem optimalen tRNA-Pool für eine hohe G+C (%) Genexpression; [3] aktiver Primärstoffwechsel, der möglicherweise für die Versorgung mit biosynthetischen Vorläufern missbraucht werden kann; und [4] Bereitstellung von Enzymen, Vorläufern oder Cofaktoren aus dem Sekundärstoffwechsel, die im nativen Zellextrakt vorhanden sind. Daher wurde kürzlich ein ertragreiches S.venezuelae TX-TL-Toolkit eingerichtet, um diese einzigartigen Fähigkeiten zu nutzen5.
Streptomyces venezuelae ist ein aufstrebender Wirt für synthetische Biologie mit einer reichen Geschichte in der industriellen Biotechnologie5,27,28,29 und als Modellsystem zur Untersuchung der Zellteilung und genetischen Regulation in Actinobakterien30,31,32. Der Haupttypstamm, S. venezuelae ATCC 10712, hat ein relativ großes Genom von 8,22 Mb mit 72,5% G+C-Gehalt (%) (Beitrittsnummer: CP029197), das für 7377 kodierende Sequenzen, 21 rRNAs, 67 tRNAs und 30 biosynthetische Gencluster kodiert27. In der synthetischen Biologie ist S. venezuelae ATCC 10712 ein attraktives Chassis für die heterologe Expression von Biosynthesewegen. Im Gegensatz zu den meisten anderen Streptomyces-Flecken bietet es mehrere wichtige Vorteile, darunter eine schnelle Verdopplungszeit (~ 40 min), eine umfangreiche Palette genetischer und experimenteller Werkzeuge5,28, eine fehlende Myzelverklumpung und Sporulation in flüssigen Medien28,33. Mehrere Studien haben auch die Verwendung von S. venezuelae für die heterologe Produktion einer Vielzahl von Sekundärmetaboliten gezeigt, darunter Polyketide, ribosomale und nichtribosomale Peptide34,35,36,37,38. Diese kombinierten Eigenschaften machen diesen Stamm zu einem attraktiven mikrobiellen Wirt für Anwendungen der synthetischen Biologie und des Metabolic Engineering. Während S. venezuelae nicht das dominierende Streptomyces-Modell für die heterologe Genexpression ist, ist es mit weiteren Entwicklungen für eine breitere Verwendung in der Naturproduktentdeckung vorbereitet.
Dieses Manuskript präsentiert ein detailliertes Protokoll (Abbildung 1) für ein S. venezuelae TX-TL-System mit hoher Ausbeute, das gegenüber dem ursprünglichen zuvor veröffentlichten Protokoll aktualisiert wurde26. In dieser Arbeit wurden die Energielösung und die Reaktionsbedingungen optimiert, um die Proteinausbeute für das mScarlet-I-Reporterprotein in einer 4 h, 10 μL Batch-Reaktion unter Verwendung eines Standardplasmids pTU1-A-SP44-mScarlet-I um bis zu 260 μg/ml zu erhöhen. Dieses Plasmid wurde speziell entwickelt, um verschiedene Methoden zum Nachweis der Proteinexpression zu ermöglichen. Das Protokoll ist ebenfalls optimiert, während das Energiesystem optimiert wurde, um die Komplexität und die Kosten für die Einrichtung zellfreier Reaktionen zu reduzieren, ohne die Ausbeute zu beeinträchtigen. Zusammen mit dem optimierten TX-TL-System wurde eine Bibliothek genetischer Teile zur Feinabstimmung der Genexpression und als fluoreszierende Werkzeuge zur Überwachung von TX-TL in Echtzeit entwickelt, wodurch eine vielseitige Plattform für das Prototyping von Genexpressions- und Naturstoff-Biosynthesewegen aus Streptomyces spp. und verwandten Actinobakterien geschaffen wurde.
In dieser Arbeit kann das empfohlene Standardplasmid (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) verwendet werden, um den S. venezuelae TX-TL-Workflow in einem neuen Labor zu etablieren und ist auf AddGene verfügbar (siehe Ergänzende Tabelle S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I bietet dem Benutzer die Flexibilität, andere Open-Reading-Frames (ORFs) zu untersuchen. Der mScarlet-I ORF ist codon-optimiert für die S. venezuelae Genexpression. Der SP44-Promotor ist ein starker konstitutiver Promotor, der sowohl in E. coli als auch in Streptomyces spp.39 hochaktiv ist. Das Plasmid verfügt über zwei einzigartige Restriktionsenzymstellen (NdeI, BamHI), um das Subklonen neuer ORFs im Rahmen mit einem gemeinsamen C-terminalen FLAG-Tag und einem Fluorescein arsenischen Haarnadelsystem (FlAsH) zu ermöglichen. Alternativ können beide Tags mit der Aufnahme eines Stop-Codons nach dem Sub-Klonen eines neuen Gens entfernt werden. Mit diesem Basenvektor wurde die ertragreiche Expression einer Reihe von Proteinen nachgewiesen, nämlich Proteine aus dem Oxytetracyclin-Biosyntheseweg und eine uncharakterisierte nichtribosomale Peptidsynthetase (NRPS) aus Streptomyces rimosus (Abbildung 2). In Bezug auf den mRNA-Nachweis enthält das Standardplasmid pTU1-A-SP44-mScarlet-I ein dBroccoli-Aptamer (in der 3'-untranslatierten Region) zum Nachweis mit der 3,5-Difluor-4-hydroxybenzyliden-Imidazolinon (DFHBI) -Sonde. Für mehr Flexibilität wurde auch ein Toolset von EcoFlex40-kompatiblen MoClo-Teilen auf AddGene zur Verfügung gestellt, darunter ein EcoFlex-kompatibler Streptomyces-Shuttle-Vektor (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) und eine Reihe von pTU1-A-SP44-Variantenplasmiden, die Superfolder Green Fluorescence Protein (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I und β-Glucuronidase (GUS) exprimieren. Insbesondere wird das pSF1C-A-Plasmid von pAV-gapdh28 abgeleitet und von BsaI/BsmBI-Stellen für die MoClo-Assemblierung ausgehärtet. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP entspricht pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP von EcoFlex40, enthält jedoch zusätzliche Funktionen für die Konjugation und chromosomale Integration in Streptomyces spp. mit dem phiC31-Integrasesystem28.
Die erste Stufe des Protokolls umfasst das Wachstum des S. venezuelae ATCC 10712 oder eines eng verwandten Stammes, die Zellernte in der mittleren exponentiellen Phase, Zellwaschschritte und die Äquilibrierung in S30A- und S30B-Puffern. Diese Phase dauert drei Tage, und die Zeit für das Zellwachstum kann verwendet werden, um die verbleibenden Komponenten wie unten beschrieben vorzubereiten. Die geernteten Zellen werden dann durch Beschallung lysiert, geklärt und durchlaufen eine Abflussreaktion. In dieser letzten Phase der Vorbereitung können die Zellextrakte für die Langzeitlagerung bei -80 °C vorbereitet werden, um den Aktivitätsverlust zu minimieren. Für die Montage von TX-TL-Reaktionen mit diesem Protokoll wird ein Streptomyces Master Mix (SMM) vorgestellt, mit der Option eines Minimal Energy Solution-Formats (MES), das vergleichbare Ausbeuten liefert. Ferner wird empfohlen, eine frische Kultur von S. venezuelae ATCC 10712 aus einem -80 °C Glycerinvorrat auf eine GYM-Agarplatte zu streifen und bei 28 °C für mindestens 48-72 h zu inkubieren, bis einzelne Kolonien sichtbar sind. Für die folgenden Schritte sollten nur frische Kulturen verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>2,5 L UltraYield Kolben</td><td>Thomson</td><td>931136-B</td><td></td></tr><tr><td>3-PGA (>93%)</td><td>Sigma</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>384 Well Schwarz/Klarer Bodenplatte</td><td>ThermoFisher</td><td>10692202</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumchlorid (98%)</td><td>Fluorchem</td><td>44722</td><td></td></tr><tr><td>ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM Lösung, >99%)</td><td>ThermoFisher</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin (Kontaktieren Sie den Lieferanten für Reinheit)</td><td>Melford</td><td>C46000-25.0</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucose (Kontaktieren Sie den Lieferanten für Reinheit)</td><td>Melford</td><td>G32040</td><td></td></tr><tr><td>DFHBI (&ge; 98% - HPLC)</td><td>Sigma</td><td>SML1627</td><td></td></tr><tr><td>DTT (Kontaktieren Sie den Lieferanten für Reinheit)</td><td>Melford</td><td>MB1015</td><td></td></tr><tr><td>FlAsH-EDT2 (Kontaktieren Sie den Lieferanten für Reinheit)</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-363644</td><td></td></tr><tr><td>Glukose-6-phosphat (>98%)</td><td>Sigma</td><td>G7879</td><td></td></tr><tr><td>HEPES freie Säure (Kontaktieren Sie den Lieferanten für Reinheit)</td><td>Melford</td><td>B2001</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutaminsäure-Hemimagnesiumsalz-Tetrahydrat (>98%)</td><td>Sigma</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid (98%)</td><td>Fluorchem</td><td>494356</td><td></td></tr><tr><td>Malzextrakt</td><td>Sigma</td><td>70167-500G</td><td></td></tr><tr><td>PEG-6000</td><td>Sigma</td><td>807491</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 96-Well-Mikrodialyseplatte, 10K MWCO</td><td>ThermoFisher</td><td>88260</td><td></td></tr><tr><td>Poly(vinyl Sulfat) Kaliumsalz</td><td>Sigma</td><td>271969</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumglutamat (>99%)</td><td>Sigma</td><td>G1149</td><td></td></tr><tr><td>RTS Aminosäure-Probenehmer</td><td>5 Prime</td><td>2401530</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (99%)</td><td>Fluorchem</td><td>94554</td><td></td></tr><tr><td>Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE Säule (1 g)</td><td>Sigma</td><td>505471</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Melford</td><td>Y1333</td><td></td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platereader</td><td>BMG</td><td>Omega</td><td></td></tr></tbody></table>

ein ertragreiches streptomyces-transkriptions-translation-toolkit für synthetische biologie und naturstoffanwendungen

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

Streptomyces spp. sind eine Hauptquelle für klinische Antibiotika und Industriechemikalien. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 ist eine schnell wachsende Sorte und ein natürlicher Produzent von Chloramphenicol, Jadomycin und Pikromycin, was es zu einem attraktiven Kandidaten als Chassis der synthetischen Biologie der nächsten Generation macht. Daher sind genetische Werkzeuge, die die Entwicklung von S. venezuelae ATCC 10712 sowie anderen Streptomyces spp.-Modellen beschleunigen, für die Naturproduktentwicklung und -entdeckung sehr wünschenswert. Zu diesem Zweck wird in diesem Protokoll ein dediziertes S. venezuelae ATCC 10712 zellfreies System bereitgestellt, um eine hochertragreiche heterologe Expression von Genen mit hohem G+C (%) zu ermöglichen. Dieses Protokoll eignet sich für kleinskalige (10-100 μL) Chargenreaktionen im 96-Well- oder 384-Well-Plattenformat, während die Reaktionen potenziell skalierbar sind. Das zellfreie System ist robust und kann hohe Ausbeuten (~ 5-10 μ M) für eine Reihe von rekombinanten Proteinen in einem minimalen Setup erzielen. Diese Arbeit beinhaltet auch ein breites Plasmid-Toolset für die Echtzeitmessung von mRNA und Proteinsynthese sowie die In-Gel-Fluoreszenzfärbung von markierten Proteinen. Dieses Protokoll kann auch in Hochdurchsatz-Genexpressionscharakterisierungs-Workflows oder die Untersuchung von Enzymwegen aus Genen mit hohem G + C (%) in Actinomycetes-Genomen integriert werden.

Dieses detaillierte Protokoll dient als Beispiel, um dem Benutzer zu helfen, ein Streptomyces TX-TL-System basierend auf dem Modellstamm S. venezuelae ATCC 10712 einzurichten (Abbildung 1). Der Benutzer kann versuchen, andere Streptomyces-Stämme zu untersuchen; Die Wachstums-/Erntephasen anderer Sorten mit längeren Verdopplungszeiten oder ausgeprägten Wachstumspräferenzen müssen jedoch individuell optimiert werden, um Spitzenergebnisse zu erzielen. Für das repräsen...

Dieses Protokoll beschreibt eine verbesserte Methode zur Synthese hoher Ausbeuten rekombinanter Proteine aus einem zellfreien Transkriptionstranslationssystem (TX-TL) von Streptomyces venezuelae .

Ein ertragreiches Streptomyces-Transkriptions-Translation-Toolkit für synthetische Biologie und Naturstoffanwendungen

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a ...

Unser Protokoll bietet einen vereinfachten Workflow für streptomyces venezuelae zellfreie Transkriptionsübersetzung. Unser System nutzt die Stoffwechselenzyme und -wege dieses Nicht-Modellorganismus. Die Hauptvorteile sind die heterologe Expression von Genen mit hohem GC-Gehalt, die Bereitstellung einer günstigen Proteinweiterleitungsumgebung und ein offenes System zur Feinabstimmung von Biosynthesewegen.Unsere Methode wird neue Möglichkeiten zur Untersuchung von Streptomyces und verwandten Bakterien mit hohem GC eröffnen. Es ermöglicht die Untersuchung von Enzymen und Genexpression in diesen Bakterien. Diese Technik wurde entwickelt, um die Implementierung durch neue Benutzer zu erleichtern.Der einzige Schritt, der vorherige Erfahrung oder Eingewöhnung erfordert, ist die Beschallung, um hochaktive Rohextrakte herzustellen. Um am dritten Tag mit der Ernte der vorkultivierten Zellen zu beginnen, verdünnen Sie die Nachtkultur im Verhältnis eins zu 10 mit einem frischen GYN-Medium für die optische Dichte- oder OD-Messung bei 600 Nanometern. Wenn der OD der Kultur bei 600 Nanometern weniger als 0,3 beträgt, erhöhen Sie die Schüttelgeschwindigkeit auf 250 bis 300 Umdrehungen pro Minute und wachsen Sie, bis ein OD 0,3 erreicht.Wachsen Sie nicht länger als zwei Weitere Stunden. Wenn der OD größer als 0,3 ist, die Kulturen in Zentrifugationsbehälter geben und 30 Minuten lang schnell auf Nassemis abkühlen. Während Sie darauf warten, dass die Zellkultur abkühlt, bereiten Sie vier Milliliter frische einmolare Dithiothreitol-, S30A- und S30B-Puffer vor und bewahren Sie sie auf Eis auf.Nach dem Wiegen eines leeren 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchens bei minus 20 Grad Celsius vorkühlen. Fügen Sie zwei Milliliter eines molaren Dithiothreitol zu einem Liter S30A-Puffer auf Eis hinzu und mischen Sie gut. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 6.000 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.Nachdem Sie den Überstand in einer schnellen Bewegung verworfen haben, fügen Sie 250 Milliliter S30A-Puffer hinzu und resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie die Zentrifugationsflaschen kräftig schütteln, bis die Zellklumpen homogen verteilt sind. Dann zentrifugieren Sie die Zellen erneut für sechs Minuten. Verwerfen Sie nach der Zentrifugation den Überstand und wiederholen Sie die Zugabe des S30A-Puffers, gefolgt von der Zentrifugation wie gezeigt.Als nächstes fügen Sie zwei Milliliter eines molaren DTT zu einem Liter S30B-Puffer auf Eis hinzu und mischen Sie gut. Fügen Sie den Zellen 250 Milliliter S30B-Puffer hinzu und wiederholen Sie die Zentrifugation. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 Milliliter S30B-Puffer und übertragen Sie die Zellsuspension in das vorgewogene vorgekühlte 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Bei Bedarf werden die Restzellen mit weiteren fünf bis 10 Millilitern S30B-Puffer versetzt und das Röhrchen auf 50 Milliliter Volumen mit S30B gefüllt. Zentrifugieren Sie die Zellen für 10 Minuten. Verwerfen Sie den Überstand und wiederholen Sie die Zentrifugation bei den vorherigen Einstellungen wie demonstriert.Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, saugen Sie den verbleibenden S30B-Überstand mit einer 100 bis 200 Mikroliter pipette ab und wiegen Sie das Nasszellpellet. Für jedes Gramm Nasszellen werden 0,9 Milliliter S30B-Puffer hinzugefügt. Resuspendieren Sie die Zellen entweder mit einer Pasteurpipette oder einem Wirbel.Zentrifugieren Sie kurz für ca. 10 Sekunden bis zu 500 G, um die Zellen zu sedimentieren. Senken Sie die Ultraschallspitze in die Zellsuspension, bis sich die Spitze etwa einen Zentimeter unter der Flüssigkeitsoberfläche befindet. Geben Sie verschiedene Parameter in die Sonicator-Einstellungen ein.Stellen Sie die Frequenz auf 20 Kilohertz, die Amplitude auf 65% Puls-Ein- und Ausschaltzeit auf 10 Sekunden und die Gesamtschallationszeit auf eine Minute ein. Beginnen Sie mit der Beschallung und bewegen Sie die Röhre während der ersten beiden Ruhezyklen nach oben oder unten und zur Seite, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig beschallt sind. Wenn die Zellen nicht vollständig lysiert sind, kehren Sie die Röhre zwei- bis dreimal um und wiederholen Sie die Beschallung für weitere ein oder zwei 10-Sekunden-Zyklen mit häufigem Mischen, bis die Zellen vollständig gestört sind.Zentrifugieren Sie die lysierten Zellen, um die Zelltrümmer zu entfernen, und übertragen Sie den Überstand dann in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen als ein Milliliter Aliquot. Für die Abflussreaktion der Zellextrakte inkubieren Sie die Zellextrakt enthaltende Zelle bei 30 Grad Celsius für 60 Minuten auf einem Wärmeblock oder im Inkubator ohne Shaker. Für die Transkriptions-Translations-Reaktion den Zellextrakt SMM oder mes-Lösung und die Plasmid-DNA auf Eis auftauen.Kühlen Sie eine 384-Well-Platte bei minus 20 Grad Celsius vor. Richten Sie die Transkriptions-Translationsreaktion auf dem Eis ein, wobei 25% des Volumens Plasmid-DNA, 33,33% Zellextrakt und 41,67% SMM-Lösung sind. Wirbeln Sie die Mischung vorsichtig für etwa fünf Sekunden bei niedriger Geschwindigkeit, um sicherzustellen, dass die Lösung homogen ist und gleichzeitig Schaumbildung oder Blasenbildung vermieden wird.Drei Aliquots von 10 Mikrolitern in drei Vertiefungen einer 384-Well-Platte als technisches Dreifaches überführen, ohne Luftblasen einzuführen. Nachdem Sie die Platte mit einer transparenten Abdeckung versiegelt haben, drehen Sie die Platte fünf Sekunden lang bei 400 mal G und inkubieren Sie die Reaktion bei 28 Grad Celsius entweder in einem Inkubator oder einem Plattenleser ohne zu schütteln. Streptomyces venezuelae zellfreie Transkriptionstranslation wurde für die hochentwertige Expression von fluoreszierenden Proteinen aus dem Standardplasmid pTU1-A-SP44 sowie für biosynthetische Enzyme, die durch Gelelektrophorese nachgewiesen wurden, optimiert.Die Expression des Standardplasmids pTU1-A-SP44-mScarlet-I wurde mit mehreren Methoden gemessen. Die Echtzeit-Fluoreszenzmessungen von mRNA mit dem dBroccoli-RNA-Aptamer, dem unreifen mScarlet-I-Protein mit dem FlAsH-Tag-System und dem reifen mScarlet-I-Protein wurden durchgeführt. Die In-Gel-Fluoreszenzfärbung von mScarlet-I unter Verwendung des FlAsH-Tags wurde zusätzlich zur Coomassie Blue-Färbung des gesamten zellfreien Proteins durchgeführt.Nach diesem Verfahren können Aktivitätsassays durchgeführt werden, um Enzyme und Signalwege zu untersuchen, die mit Standardmethoden eine Herausforderung darstellen. Es erstreckt sich auch auf eine skalierte Biosynthese und eine Hochdurchsatz-Genexpression. Wir entwickeln diese Technik, um Stoffwechselenzyme aus Bakterien mit hohem GC-Gehalt zu untersuchen.Wir haben das Potenzial unseres Systems gezeigt, die skalierte Biosynthese in zellfreien Reaktionen zu untersuchen.

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