Name: Zellfreie skalierte Produktion und adjuvante Zugabe zu einem rekombinanten Haupt-Außenmembranprotein aus Chlamydia muridarum für die Impfstoffentwicklung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 53 s
Description: Erfahren Sie die zellfreie Produktion von Membranproteinen in Nanodiscs für die Impfstoffentwicklung. Diese skalierbare Methode ermöglicht die Herstellung nativer Antigene mit Adjuvantien für Infektionskrankheiten und Krebs.

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Diese Arbeit wurde durch den Zuschuss des Public Health Service R21 AI20925 und U19 AI144184 des National Institute of Allergy and Infectious Diseases unterstützt. Diese Arbeit wurde unter der Schirmherrschaft des U.S. Department of Energy vom Lawrence Livermore National Laboratory unter dem Vertrag DE-AC52-07NA27344 [LLNL-JRNL-822525, LLNL-VIDEO-832788] durchgeführt.

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</ol>

Die Autoren erklären, dass ihnen keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen bekannt sind, die den Anschein erwecken könnten, dass sie die in diesem Artikel berichtete Arbeit beeinflusst haben.

Chlamydien sind die häufigste sexuell übertragbare Infektion, die sowohl Männer als auch Frauen betrifft. Obwohl sich die Impfstoffforschung zu Chlamydien über Jahrzehnte erstreckt, ist ein sicherer und wirksamer Impfstoff, der auf die Massenproduktion skaliert werden kann, nach wie vor schwer zu finden13. Das Chlamydien-MOMP gilt als Hauptkandidat als schützendes Impfantigen; MOMP ist jedoch stark hydrophob und anfällig für falsche Faltungen14,15. Weitere Studien haben gezeigt, dass MOMP in oligomeren Zuständen existiert, die für seine Immunogenität unerlässlich sind11. Hier wird eine validierte, zellfreie Co-Expressionsmethode beschrieben, die oligomeres MOMP produziert, das in tNLP-Nanopartikeln als Impfstoff gebildet wird, mit Ausbeuten von ca. 1,5 mg gereinigtem MOMP pro 3 ml Lysat. Dieses vollständig zusammengetragene Verfahren kann für die industrielle Produktion weiter skaliert werden, was seine Aussichten als nützlicher Ansatz für die Herstellung von Impfstoffen erhöht.
Wir haben bereits über die Verwendung der zellfreien Expression zur Herstellung von Membranproteinen, die in NLPseingebettet sind, 3,16 sowie über die Expression in Telodendrimer-stabilisierten Scheiben veröffentlicht. Diese letztere Technik erzeugte jedoch Membranproteinpartikel mit größerer Heterogenität und geringerer Löslichkeit. 4 Darüber hinaus ist die Immunogenität von MOMP-Telodendrimer-Partikeln im Vergleich zu MOMP-tNLP-Partikeln unklar6.
Dieses Verfahren kann angepasst werden, um die Expression von bakteriellen Membranproteinen zu erhöhen, die vielversprechende Kandidaten als Antigene für den Einsatz in Subunit-Impfstoffen sind. Dieses Verfahren erzeugt nicht nur ein gelöstes bakterielles Membranprotein, sondern die gesamte Nanopartikelstruktur ist auch für eine weitere Modifikation mit einer Vielzahl von lipophilen Impfstoffadjuvantien zugänglich, einschließlich, aber nicht beschränkt auf CpG, das an einen Cholesterinanteil oder FSL-1 konjugiert ist. Die Expression anderer Antigenkandidaten aus Bakterien ist möglich, obwohl Parameter wie Expressionstemperatur, Lipidwahl und Art des Expressionssystems möglicherweise untersucht werden müssen, um optimale Ausbeuten zu erzielen.
Darüber hinaus sind die Wahl und das Verhältnis der Plasmide in diesem Prozess entscheidend. Beide verwendeten Plasmide sollten aus dem gleichen Rückgrat aufgebaut sein. Wenn die Inserts annähernd gleich lang sind, können die Verhältnisse auf der Masse des zugegebenen Plasmids basieren, wie hier beschrieben. Die Verhältnisierung auf der Grundlage von Molen führt jedoch zu reproduzierbareren Ergebnissen, insbesondere bei der Skalierung der Reaktionen. Verhältnisse, die bei Reaktionen im Bildschirmmaßstab gut funktionieren (< 0,5 ml), sind möglicherweise nicht auf größere Reaktionen anwendbar und erfordern möglicherweise zusätzliche Optimierungen. Nicht-Membranproteine können weiterhin mit zellfreien Kits exprimiert werden, benötigen jedoch möglicherweise nicht das Lipid-Nanopartikel (Co-Expression), um ein lösliches Produkt zu produzieren. Während dieses Protokoll die Adjuvantierung mit CpG und FSL-1 beschreibt, ist dieses System für die Formulierung mit anderen lipophilen Adjuvantien oder das Mischen mit löslichen Adjuvantien nach Wunsch zugänglich.
Es ist wichtig, bei der Einrichtung der zellfreien Expressionsreaktion eine Kontamination zu vermeiden, da dies die Ausbeute beeinträchtigen kann. Alle Zusätze zur Reaktion, einschließlich der Plasmide selbst, sollten hochrein sein. Darüber hinaus sollten die exprimierten Proteine nur mit Materialien und Lösungen in Kontakt kommen, die frei von Endotoxin-Kontamination sind. Eine Endotoxin-Kontamination in Formulierungskandidaten kann zu inkonsistenten und falschen Ergebnissen immunologischer Assays führen und in ausreichenden Mengen schädlich sein. Obwohl hier nicht beschrieben, kann eine zusätzliche Reinigung nach der Nickelaffinitätschromatographie erforderlich sein, wenn viele Verunreinigungen in nachfolgenden Analyseschritten wie z. B. DURCH SDS-PAGE beobachtet werden. Dies könnte mit SEC erreicht werden, obwohl die Bedingungen möglicherweise von Formulierung zu Formulierung optimiert werden müssen.

Prokaryotische oder eukaryotische Lysate für die zellfreie Expression von Proteinen sind als kommerzielle Produkte für die Synthese von Proteinen von Interesse leicht erhältlich (für eine vollständige Übersicht siehe 1). Diese Expressionssysteme sind in verschiedenen Größenordnungen verfügbar und verwenden Lysate aus verschiedenen Organismen, darunter E. coli, Tabakpflanzen und Säugetierkulturen. Zellfreie Lysate bieten mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen rekombinanten Proteinproduktionsansätzen, darunter Benutzerfreundlichkeit und robuste, schnelle Proteinproduktion. Während diese Ansätze in erster Linie zur Herstellung löslicher Proteine verwendet werden, hat diese Gruppe einen Ansatz für ihre Verwendung zur Expression von Membranproteinen entwickelt.
Dieser neuartige Ansatz nimmt geringfügige Modifikationen an bestehenden zellfreien Expressionssystemen vor, indem er DNA einbezieht, die für zwei Proteinprodukte für die Expression kodiert, ein Apolipoprotein und das Membranprotein von Interesse. Das exprimierte Apolipoprotein (Derivate von ApoA1 oder ApoE4) interagiert mit Lipiden, die dem zellfreien Lysat zugesetzt werden, um spontan (~20 nm) NLPs zusammenzusetzen. Bei Co-Translation mit einem interessierenden Membranprotein bilden das NLP und das Membranprotein einen löslichen Nanopartikelkomplex, wobei das Membranprotein in die NLP-Lipiddoppelschicht eingebettet ist. Somit ist das Membranprotein für nachgelagerte Anwendungen leichter zugänglich, da es in löslichen, diskreten Partikeln enthalten ist. Dieser Ansatz kann funktionelle oligomere Proteinkomplexe innerhalb der NLP-Doppelschicht2 erzeugen und die Antigenkomponente eines Untereinheitsimpfstoffs herstellen, der anschließend mit lipophilen Adjuvantien gemischt wird, um einen Nanopartikel-Impfstoff mit kolokalisiertem Antigen und Adjuvans zu bilden, der für die In-vivo-Bewertung geeignet ist.
Dieses aktuelle Verfahren ist eine Modifikation eines zuvor veröffentlichten Protokolls3. Wesentliche Modifikationen konzentrieren sich auf das Scale-up der zellfreien Reaktion und die anschließende Aufreinigung des Protein-NLP-Komplexes. Eine weitere Modifikation beinhaltet die Zugabe eines amphiphilen Polymers, das als Telodendrimer bekannt ist, das zunächst mit den Lipiden vermischt wird, bevor es zur zellfreien Reaktion hinzugefügt wird. Die Co-Translation der Plasmide in Gegenwart des Telodendrimers und der Lipide erzeugt ein Telodendrimer NLP (tNLP). Die Zugabe des Telodendrimers trägt auch dazu bei, die Größe und Monodispersität der resultierenden tNLP-Nanopartikel zu modulieren4. Dieses Protokoll ist speziell für groß angelegte Impfstoffstudien optimiert, um ein membrangebundenes Untereinheits-Antigenprotein, Chlamydien MOMP5,6, herzustellen. Die Methode erzeugt rekombinantes MOMP, das mit tNLP assoziiert ist, um einen hochlöslichen MOMP-tNLP-Komplex zu bilden, der die MOMP-Oligomerisierung beibehält. Eine typische 3-ml-Scale-up-Produktion ergibt >1,5 mg gereinigtes MOMP. Das zellfrei hergestellte MOMP-tNLP ist für eine schnelle adjuvante Zugabe für In-vivo-Immunogenitätstests geeignet.

<table><tbody><tr><td>1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC) als Pulver</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>850345</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL endotoxinfreie Zentrifugenröhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>2600028</td><td></td></tr><tr><td>1 M Trizma-Hydrochloridlösung</td><td>Millipore Sigma</td><td>T2194</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure, Eissäure, ACS-Reagenz &ge; 99,7%</td><td>Millipore Sigma</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Dot Gerät</td><td>Bio-Rad</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>Pufferdam für XCell SureLock</td><td>Life Technologies</td><td>EI0012</td><td></td></tr><tr><td>C24 Inkubator Schüttler</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellfreies Expressionssystem: RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit</td><td>BiotechRabbit</td><td>BR1400201</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete His-Tag-Aufreinigungsharz</td><td>Roche Molecular Diagnostics</td><td>5893682001</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA-freier Protease-Inhibitor-Cocktail</td><td>Roche Molecular Diagnostics</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>CpG-ODN1826</td><td>Biosearch Technologies</td><td>T9449</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Trehalose-Dihydrat</td><td>Millipore Sigma</td><td>71509</td><td></td></tr><tr><td>Dialysekanülen D-Rohr-Dialysator Maxi</td><td>Millipore Sigma</td><td>71508-3</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Säulen aus Polypropylen mit Fritten 10 ml Fassungsvermögen</td><td>Bio-Rad</td><td>7311550EDU</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Millipore Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Elektrophorese-Netzteil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Endosafe PTS-Kartusche</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9594798</td><td></td></tr><tr><td>Endosafe-PTS Testsystem</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel Waschlösung: 10% Methanol, 7% Essigsäure</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl und NaOH Lösungen für HPLC zur pH-Korrektur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mit UV-vis-Diodenarray-Detektor</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyClone HyPure Wasser in Kulturqualität</td><td>VWR</td><td>82007-328</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 Dry Blotting System</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 Transfer Stacks, PVDF</td><td>Life Technologies</td><td>IB24001</td><td></td></tr><tr><td>Image Studio V2.0 Software</td><td>Li-COR Biiosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Millipore Sigma</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Immun-Blot PVDF Membran</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey Fc Imager</td><td>Li-COR Biiosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td>Labconco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol (&ge; 99,9%)</td><td>Millipore Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrowellenherd</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One/OneC Mikrovolumen UV-Vis Spektralphotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4 bis 12%, Bis-Tris, 1,0 mm</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS-Probenpuffer (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Laufpuffer (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP000202</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Probenreduktionsmittel (10x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Blockierungspuffer bei TBS mit 0,2 % Tween 20</td><td>Li-COR Biosciences</td><td>927-50000</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS-T (1x PBS, 0,2 % Tween 20, pH 7,4)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEG5K-CA8 Telodendrimer (kundenspezifisches Syntheseprodukt)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pIVEX2.4d Vektor</td><td>Roche Molecular Diagnostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Primärer Antikörper: MAb40 (monoklonaler Antikörper gegen die variable Domäne 1 (VD1) von C. muridarum MOMP, de la Maza Labor)4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primärer Antikörper: MAbHIS, Penta-His-Antikörper</td><td>Qiagen</td><td>34660</td><td></td></tr><tr><td>Sondensonicator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>Life Technologies</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Protein Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q33212</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Pipettenspitzen: LTS 1000 & micro; L</td><td>Rainin</td><td>17002428</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Pipettenspitzen: LTS 20 &micro; L</td><td>Rainin</td><td>17002429</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Pipettenspitzen: LTS 200 &micro; L</td><td>Rainin</td><td>17002426</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Pipetten</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sekundärer Antikörper: IRDye 800CW Ziege (polyklonal) Anti-Maus IgG (schwer und leicht)</td><td>Li-COR Biosciences</td><td>926-32210</td><td></td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 Vorgefärbtes Protein</td><td>Standard Life Technologies</td><td>LC5925</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid NaCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Monobasisches Natriumphosphat NaH2PO4</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp; S0751</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200, 5/150 GL Säule</td><td>Cytiva</td><td>GE28-9909-45</td><td></td></tr><tr><td>Synthetisches diacyliertes Lipoprotein-TLR2/6 FSL-1</td><td>Invivogen</td><td>&nbsp; tlrl-fsl</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Ruby Protein Gel Stain</td><td></td><td>Life Technologies S12001</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>UV-Lichtquelle</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Bench Top Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VWR 15 mL konische Zentrifuge (89039-666)</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VWR 50 mL konische Gläser (89039-656)</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Zelle (Life Technologies )</td><td>Life Technologies</td><td>EI0001</td><td></td></tr></tbody></table>

zellfreie skalierte produktion und adjuvante zugabe zu einem rekombinanten haupt-außenmembranprotein aus chlamydia muridarum für die impfstoffentwicklung

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

Subunit-Impfstoffe bieten Vorteile gegenüber herkömmlichen inaktivierten oder abgeschwächten Ganzzell-Impfstoffen in Bezug auf Sicherheit, Stabilität und Standardherstellung. Um einen wirksamen proteinbasierten Subunit-Impfstoff zu erhalten, muss das Proteinantigen oft eine native Konformation annehmen. Dies ist besonders wichtig für Pathogen-Oberflächenantigene, bei denen es sich um membrangebundene Proteine handelt. Zellfreie Methoden wurden erfolgreich eingesetzt, um korrekt gefaltetes funktionelles Membranprotein durch die Co-Translation von Nanolipoproteinpartikeln (NLPs), allgemein bekannt als Nanodiscs, herzustellen. 
Mit dieser Strategie können Untereinheiten-Impfstoffe hergestellt werden, die aus Membranproteinen in einer lipidgebundenen Umgebung bestehen. Die zellfreie Proteinproduktion ist jedoch oft auf den kleinen Maßstab (<1 ml) beschränkt. Die Menge an Protein, die in kleinen Produktionsläufen produziert wird, reicht in der Regel für biochemische und biophysikalische Studien aus. Der zellfreie Prozess muss jedoch skaliert, optimiert und sorgfältig getestet werden, um genügend Protein für Impfstoffstudien in Tiermodellen zu erhalten. Andere Prozesse, die an der Impfstoffherstellung beteiligt sind, wie z. B. die Reinigung, die Adjuvans-Zugabe und die Gefriertrocknung, müssen parallel optimiert werden. In diesem Artikel wird über die Entwicklung eines skalierten Protokolls zur Expression, Reinigung und Formulierung eines membrangebundenen Proteinuntereinheitsimpfstoffs berichtet. 
Skalierte zellfreie Reaktionen erfordern eine Optimierung der Plasmidkonzentrationen und -verhältnisse bei der Verwendung mehrerer Plasmidexpressionsvektoren, der Lipidauswahl und der Adjuvansaddition für die Herstellung von formulierten Nanolipoproteinpartikeln auf hohem Niveau. Die Methode wird hier mit der Expression eines Chlamydien-Hauptmembranproteins (MOMP) demonstriert, kann aber auch auf andere Membranproteinantigene angewendet werden. Die Wirksamkeit von Antigenen kann in vivo durch Immunisierungsstudien zur Messung der Antikörperproduktion bewertet werden, wie hier gezeigt.

Das SDS-PAGE-Profil der Ni-Affinitätsreinigung von MOMP-tNLP aus einer zellfreien 1-ml-Reaktion ist in Abbildung 1B dargestellt. Die Reaktion führte zu einer hohen Expression sowohl des MOMP- als auch des Δ49ApoA1-Proteins. Frühere Ergebnisse zeigten, dass die zellfreie Expression von Δ49ApoA1 in Gegenwart von DMPC und Telodendrimer zur Bildung von Telodendrimer-Nanolipoproteinpartikeln (tNLPs) führte4. Die Ko-Elution von MOMP mit Δ49ApoA1 deutete darauf hin, dass MOMP mit tNLPs assoziiert ist, da der His-Tag nur auf dem tNLP-Gerüst Δ49ApoA1 und nicht auf MOMP vorhanden ist. MOMP ist ein hochgradig unlösliches Protein, das nur durch Komplexierung mit tNLPs eluiert werden kann, die nachweislich die Solubilisierung von Membranproteinen erleichtern.
Die Elutionsfraktionen, die MOMP-tNLPs enthielten, wurden gepoolt und die Gesamtproteinkonzentration mit einem fluoreszenzbasierten Quantifizierungsgerät oder einem Gerät, das die Konzentration durch Absorption bei 280 nm misst, gemäß den Anweisungen des Herstellers für die Proteinquantifizierung bestimmt. Um eine präzise Dosierung des MOMP-Impfstoffs zu ermöglichen, ist es auch wichtig, die Konzentration von MOMP in den gereinigten Komplexen zu bestimmen. Wir entwickelten eine Methode zur Quantifizierung von MOMP auf der Grundlage der Geldensitometrie (Abbildung 2), bei der ein gereinigtes rekombinantes MOMP mit bekannter Konzentration als Standard verwendet wurde. Durch die Erstellung der Standardkurve und den Vergleich mit der MOMP-tNLP-Probe kann die MOMP-Konzentration genau quantifiziert werden. Die Bestimmung der MOMP-Konzentration in der gereinigten Probe ermöglichte die Abschätzung der Ausbeute von MOMP in zellfreien Reaktionen auf verschiedenen Skalen, was für die Planung des Reaktionsaufbaus für nachgelagerte Studien wichtig ist (Tabelle 3).
MOMP muss Oligomere bilden, um eine robuste Immunantwort hervorzurufen11. Um den oligomeren Zustand von MOMP zu testen, wurde MOMP-tNLP in Gegenwart und Abwesenheit von Wärme und dem Reduktionsmittel Dithiothreitol (DTT, 50 mM, Abbildung 3A) analysiert. Oligomere höherer Ordnung von MOMP wurden mittels SDS-PAGE identifiziert, wenn die Proben nicht mit Hitze und DTT behandelt wurden. Im Vergleich dazu zeigten Proben, die mit Hitze in Gegenwart von DTT behandelt wurden, hauptsächlich zwei unterschiedliche Banden auf dem Gel, die MOMP und Δ49ApoA1 (ca. 40 kDa bzw. 22 kDa) entsprechen. Diese Ergebnisse ähneln stark dem Gelbandenmuster, das der Oligomerbildung von MOMP zugeschrieben wird, was für seine Wirksamkeit entscheidend ist.
Eine weitere Western-Blot-Analyse mit MAb40, einem Antikörper gegen das lineare Epitop auf der variablen Domäne des MOMP-Proteins, zeigte ein ähnliches Bandenmuster, das die Oligomerbildung durch das MOMP-Protein in seinem nicht denaturierten Zustand bestätigte (Abbildung 3B). Ein wichtiger Faktor, der die Bildung von MOMP-Oligomeren beeinflusst, ist das Verhältnis zwischen dem MOMP-Plasmid und dem Δ49ApoA1-Plasmid während des zellfreien Reaktionsaufbaus. Tabelle 4 listet das Verhältnis der Plasmide und die resultierende Insertionsrate von MOMP in tNLPs auf. Frühere Studien deuteten darauf hin, dass Chlamydien-MOMP und andere Proteine der äußeren Membran hauptsächlich als Trimere vorliegenkönnten 12. Um die Trimerbildung in der zellfreien Reaktion zu maximieren, ist es wünschenswert, die Insertionsrate nahe bei drei MOMP-Proteinen pro NLP zu haben, was einem Plasmidverhältnis von ~25:1 MOMP zu Δ49ApoA1 entspricht.
Ein Dot-Blot-Assay wurde als optimierte Methode verwendet, um das Vorhandensein von MOMP und tNLP nachzuweisen. Der MAb40-Antikörper wurde zum Nachweis der Gesamt-MOMP verwendet. Der MAbHIS-Antikörper, der auf den His-Tag auf dem Δ49ApoA1-Gerüst des tNLP gerichtet war, wurde verwendet, um das Vorhandensein von tNLP zu bestimmen. Die Co-Signaltransduktion von MAb40- und MAbHIS-Antikörpern deutete auf die Bildung von MOMP-tNLP hin. Die Kontrollreaktion produzierte leeres tNLP, das nur ein positives Signal von MAbHIS zeigte (Abbildung 3C). Um die Immunogenität von MOMP-tNLPs, die in der zellfreien Reaktion produziert werden, zu testen, haben wir MOMP-tNLP mit CpG + FSL-1 adjuvantiert und Mäusen in einem Prime-Boost-Regime, wie oben beschrieben, intramuskulär (i.m.) injiziert. Den immunisierten Mäusen wurden Seren entnommen und der MOMP-spezifische IgG-Antikörper wurde mit einem Western-Blot-Assay gemessen (Abbildung 4). Die Seren von Mäusen, denen adjuvantiertes MOMP-tNLP injiziert wurde, zeigten eine starke MOMP-Bindung, was darauf hindeutet, dass MOMP-tNLP in vivo eine Immunantwort hervorrufen könnte.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig01.jpg"> Abbildung 1: Expression und Aufreinigung von MOMP-tNLP. (A) Bild von Röhrchen, die kleine Aliquots einer zellfreien Reaktion enthalten, die erfolgreich exprimiert, GFP kontrolliert die Luminanz unter UV-Lichtquelle (rechts) im Vergleich zu Lysaten ohne GFP-Plasmid (links). (B) Das mit SYPRO Ruby gefärbte Proteingel nach SDS-PAGE zeigt das Aufreinigungsprofil von MOMP-tNLP. MOMP migriert mit 40 kDa und der 49ApoA1 mit 22 kDa. Abkürzungen: MOMP = chlamydiales major outer membrane protein; tNLP = Telodendrimer-Nanolipoproteinpartikel; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP-Komplex; GFP = grün fluoreszierendes Protein-kodierendes Plasmid; MW = Molekulargewichtsmarker; T = zellfreies Lysat insgesamt; FT = Durchfluss; R1-R3 = zellfreie Reaktionsaliquote; W1, W6 = Waschgänge 1 und 6; E1-E7 = Elutionen 1 bis 7; Δ49ApoA1 = ApoA1-Derivat der His-markierten Maus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig02.jpg"> Abbildung 2: Quantifizierung von MOMP in MOMP-tNLP-Proben . (A) SDS-PAGE-Gel, gefärbt mit SYPRO Ruby zur Quantifizierung von MOMP. Rekombinantes MOMP mit bekannter Konzentration wurde auf das Gel geladen, um die Standardkurve zu erhalten. Jede Spur enthielt 0,1 μg, 0,5 μg, 1,0 μg, 2,0 μg und 4,0 μg MOMP. MOMP-tNLP-Proben, die quantifiziert wurden, wurden auf dasselbe Gel geladen. (B) Die MOMP-Konzentrationsstandardkurve wurde mittels Densitometrie erstellt. Es wurde eine Gleichung aufgestellt, die die normalisierte Banddichte und die Menge an MOMP in Beziehung setzt. Die Gleichung wurde verwendet, um den MOMP-Gehalt in den unbekannten Proben zu berechnen. Abkürzungen: MOMP = chlamydiales major outer membrane protein; tNLP = Telodendrimer-Nanolipoproteinpartikel; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP-Komplex; SDS-PAGE = Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig03.jpg"> Abbildung 3: Zellfrei produziertes MOMP-tNLP ermöglicht es MOMP, Strukturen höherer Ordnung zu bilden. (A) SDS-PAGE-Gel aus MOMP-tNLP mit und ohne Behandlung von Hitze und Reduktionsmittel DTT, gefärbt mit SYPRO Ruby. Mit Hitze und DTT trat MOMP in erster Linie als Monomerbande bei ~40 kDa auf, da Wärme und das Reduktionsmittel den Großteil der MOMP-Struktur höherer Ordnung abbauten. In Abwesenheit von Wärme und DTT waren die Banden höherer Ordnung vorhanden, was auf eine MOMP-Oligomerkonformation hindeutet. (B) Western Blot von MOMP-tNLP und MOMP allein, unbehandelt und mit Hitze und DTT behandelt. Nach dem Transfer wurde die Membran mit MAb40 (1:1.000 Verdünnung) untersucht. Es wurde ein Bandenmuster beobachtet, das dem SYPRO-Rubin-gefärbten Gel ähnelte, was bestätigte, dass es sich bei den Banden mit höherem Molekulargewicht tatsächlich um MOMP-Oligomere handelte. (C) Punktfleck von MOMP-tNLP und leeren tNLP-Proben (in doppelter Ausführung), die mit MAb40 und MAbHIS untersucht wurden. Abkürzungen: MOMP = chlamydiales major outer membrane protein; tNLP = Telodendrimer-Nanolipoproteinpartikel; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP-Komplex; SDS-PAGE = Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese; DTT = Dithiothreitol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig04.jpg"> Abbildung 4: Zellfrei produziertes MOMP-tNLP ist hochgradig immunogen. Das Serum von immunisierten Mäusen zeigte ein starkes Anti-MOMP-IgG-Signal. MOMP-tNLP adjuvantiert mit CpG + FSL-1 wurde zur Immunisierung von Mäusen verwendet. Seren von sechs immunisierten Mäusen wurden gesammelt, gepoolt und zur Untersuchung von MOMP-tNLP verwendet. Das Serum konnte in einem Western-Blotting-Assay an MOMP binden und zeigte ein starkes IgG-Signal (links). Der Western Blot mit MAb40 als primärem Antikörper (rechts) zeigte ähnliche Banden, was darauf hindeutet, dass das Serum MOMP-spezifisches IgG enthielt. Abkürzungen: MOMP = chlamydiales major outer membrane protein; tNLP = Telodendrimer-Nanolipoproteinpartikel; MOMP-tNLP = MOMP-tNLP-Komplex; CpG = cholesterinmodifiziertes CpG-Adjuvans; FSL-1 = lipophiles Adjuvans. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Name des Puffers</td>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>NaCl</td>
			<td>Imidazol</td>
			<td>Ph</td>
		</tr><tr><td>Bindungspuffer</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>300 mM</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>8.0</td>
		</tr><tr><td>Wasch-Puffer</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>300 mM</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>8.0</td>
		</tr><tr><td>Elutions-Puffer 1</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>300 mM</td>
			<td>250 mM</td>
			<td>8.0</td>
		</tr><tr><td>Elutions-Puffer 2</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>300 mM</td>
			<td>500 mM</td>
			<td>8.0</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Liste der Puffer, die für die Reinigung der Nickelaffinität benötigt werden, mit Angabe der Konzentrationen der einzelnen Komponenten und des pH-Werts.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Laufzeit</td>
			<td>50 Minuten</td>
		</tr><tr><td>Durchflussmenge</td>
			<td>6,0 ml/min</td>
		</tr><tr><td>Verlaufstyp</td>
			<td>Binär</td>
		</tr><tr><td>Puffer A</td>
			<td>10 mM TEAA in H20</td>
		</tr><tr><td>Puffer B</td>
			<td>MeCN</td>
		</tr><tr><td>Steigung</td>
			<td>% Puffer B</td>
		</tr><tr><td>0 min</td>
			<td>25%</td>
		</tr><tr><td>30 min</td>
			<td>60%</td>
		</tr><tr><td>30,5 Minuten</td>
			<td>100%</td>
		</tr><tr><td>40 Minuten</td>
			<td>100%</td>
		</tr><tr><td>40,5 Minuten</td>
			<td>25%</td>
		</tr><tr><td>50 Minuten</td>
			<td>25%</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: Bedingungen für die Umkehrphasen-HPLC-Aufreinigung von cholesterinmodifiziertem CpG. Abkürzungen: TEAA = Triethylammoniumacetat; MeCN = Acetonitril.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Zellfreies Lysat (ml)</td>
			<td>DMPC-Lipid (mg)</td>
			<td>Telodendrimer (mg)</td>
			<td>MOMP-Plasmid (μg)</td>
			<td>Gereinigte MOMP-Ausbeute (mg)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>4</td>
			<td>0.4</td>
			<td>15</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>8</td>
			<td>0.8</td>
			<td>30</td>
			<td>1.1</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>12</td>
			<td>1.2</td>
			<td>45</td>
			<td>1.6</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>75</td>
			<td>2.7</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 3: Die Menge an Lipiden, Telodendrimeren und Plasmiden, die für unterschiedlich skalierte zellfreie Reaktionen verwendet werden, und die entsprechenden Ausbeuten. Abkürzungen: MOMP = chlamydiales major outer membrane protein; DMPC = 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Verhältnisse des Plasmideingangs, MOMP : Δ49ApoA1</td>
			<td>1:1</td>
			<td>5:1</td>
			<td>10:1</td>
			<td>25:1</td>
			<td>50:1</td>
			<td>100:1</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Verhältnis der produzierten Proteinmenge, MOMP : Δ49ApoA1</td>
			<td>0.02</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.64</td>
			<td>3.46</td>
			<td>6.55</td>
			<td>20.04</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Geschätzte Anzahl der MOMP-Insertionen pro tNLP</td>
			<td>0.03</td>
			<td>0.37</td>
			<td>0.75</td>
			<td>4.04</td>
			<td>7.65</td>
			<td>23.39</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 4: Die Plasmidverhältnisse in einer zellfreien Reaktion und die resultierenden MOMP-Insertionsraten. Abkürzungen: MOMP = chlamydiales major outer membrane protein; tNLP = Telodendrimer-Nanolipoproteinpartikel; Δ49ApoA1 = ApoA1-Derivat der His-markierten Maus.

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung kommerzieller, zellfreier Proteinexpressionskits zur Herstellung von Membranproteinen, die in Nanodisc unterstützt werden und als Antigene in Subunit-Impfstoffen verwendet werden können.

Zellfreie skalierte Produktion und adjuvante Zugabe zu einem rekombinanten Haupt-Außenmembranprotein aus Chlamydia muridarum für die Impfstoffentwicklung

Subunit vaccines offer advantages over more traditional inactivated or attenuated whole-cell-derived vaccines in safety, stability, and standard ...

Viele mögliche Impfstoffantigene für Untereinheiten sind Membranproteine. In der Vergangenheit war es schwierig, diese in ausreichender Menge herzustellen und zu reinigen. Mit dieser Technik sind wir in der Lage, interessante Antigene zu erzeugen, die in eine Lipidmembran eingebettet sind, um eine native Bestätigung zu gewährleisten.Dieses Verfahren erleichtert auch die Formulierung mit interessanten Adjuvantien. Die zellfreie Expression ermöglicht die schnelle Produktion von Proteinen von Interesse in ihrer nativen taglosen Struktur. Diese Technik ist auch skalierbar und wir arbeiten bereits mit kommerziellen Unternehmen zusammen, um Impfstoffformulierungen mit diesem Verfahren zu entwickeln.Wir demonstrieren den Prozess hier für ein Chlamydien-Antigen, aber der Prozess könnte leicht angepasst werden, um Antigene von Interesse zu produzieren, unabhängig davon, ob es sich um Membranproteine handelt oder nicht. Dieser Prozess könnte sowohl auf die Entwicklung von Krankheitserregern als auch auf die Entwicklung von Krebsimpfstoffen anwendbar sein. Bereiten Sie zunächst MOMP-tNLPs mit einer zellfreien Methode vor.Tauen Sie den Rekonstitutionspuffer aus dem zellfreien Proteinexpressionskit zwei Stunden vor dem Einstellen der Reaktion auf und fügen Sie dem Puffer EDTA-freien Proteaseinhibitor hinzu. Verwenden Sie ein Kit, das für fünf Ein-Milliliter-Reaktionen ausgelegt ist. Für jede Ein-Milliliter-Reaktion werden 525 Mikroliter Rekonstitutionspuffer in die E.coli-Lysatflasche gegeben und gerollt, um sie aufzulösen.250 Mikroliter des Rekonstitutionspuffers in die Reaktionsflasche mit dem Additiv geben und durch Rollen auflösen. Als nächstes werden 8,1 Milliliter Rekonstitutionspuffer in die Reaktionsflasche gegeben und zum Auflösen gerollt. Fügen Sie einer Flasche mit einer Aminosäuremischung drei Milliliter Rekonstitutionspuffer hinzu, um sie aufzulösen.Zu einer weiteren Flasche Methionin geben Sie 1,8 Milliliter Rekonstitutionspuffer, lösen Sie ihn auf und lagern Sie ihn auf Eis. 225 Mikroliter der rekonstituierten Mischung, 270 Mikroliter der rekonstituierten Aminosäuremischung ohne Methionin und 30 Mikroliter rekonstituiertes Methionin in die E.coli-Lysatflasche geben. Des Weiteren werden 400 Mikroliter der DMPC/Telodendrimer-Mischung, 15 Mikrogramm MOMP-Plasmid und 0,6 Mikrogramm Delta-49ApoA1 zu der Mischung gegeben und gemischt.Aliquot 20 Mikroliter der Gesamtlösung in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen Für eine GFP-exprimierende Kontrollreaktion. Bereiten Sie eine Futterlösung vor, indem Sie 2,65 Milliliter der rekonstituierten Aminosäuremischung ohne Methionin und 300 Mikroliter rekonstituiertes Methionin hinzufügen. Einen Milliliter der Reaktionslösung in die innere Reaktionskammer des zellfreien Reaktionskits überführen und verschließen.Füllen Sie die äußere Kammer des Reaktionsgefäßes mit 10 Millilitern der Zufuhrlösung und verschließen Sie sie. Zu den 20-Mikroliter-Aliquoten des Reaktionsgemisches werden 0,5 Mikroliter des GFP-Kontrollplasmids gegeben. Die Reaktion wird 18 Stunden lang bei 30 Grad Celsius mit 300 Umdrehungen pro Minute in einen Shaker gegeben.Überwachen Sie die Reaktion unter UV-Licht nach 15 Minuten auf Fluoreszenz aufgrund der GFP-Synthese. Reinigen Sie den MOMP-tNLP-Nanopartikelkomplex aus dem zellfreien Reaktionsgemisch durch immobilisierte Nickelaffinitätschromatographie unter Verwendung des HIS-Tags auf dem Delta-49ApoA1-Protein. Geben Sie einen Milliliter der 50%igen Aufschlämmung des HIS-Tag-Reinigungsharzes in eine 10-Milliliter-Einweg-Chromatographiesäule und fügen Sie drei Milliliter Bindungspuffer hinzu, um das Gleichgewicht herzustellen.Danach den Puffer abtropfen lassen und dem Harz 250 Mikroliter Bindepuffer hinzufügen. Extrahieren Sie 20 Mikroliter der zellfreien Reaktionsmischung für die SDS-PAGE-Analyse. Die restliche zellfreie Reaktionsmischung mit dem äquilibrierten Harz zugeben und eine Stunde auf einer Laborwippe bei vier Grad Celsius inkubieren.Entfernen Sie die Säulenkappe und waschen Sie sie mit 500 Mikrolitern Bindepuffer. Geben Sie die Waschflüssigkeit in die Säule und sammeln Sie den Durchfluss für die SDS-PAGE-Analyse. Waschen Sie die Säule sechsmal mit einem Milliliter Waschpuffer mit 20-Millimolar-Imidazol und sammeln Sie die Fraktionen.Verwenden Sie beim zweiten Waschen eine Ein-Milliliter-Pipette, um das Harz zu rühren. Die MOMP-tNLPs werden in sechs 300-Mikroliter-Fraktionen des Elutionspuffers I mit 250-Millimolar-Imidazol und einer endgültigen Elution mit 300 Mikrolitern Elutionspuffer II mit 500-Millimolar-Imidazol eluiert. Bei der zweiten Elution wird das Harz kräftig gerührt, indem Sie es mit einer Ein-Milliliter-Pipette auf und ab pipettieren.Verwenden Sie einen Gel-Imager, um die Bilder bei 600 Nanometern aufzunehmen. Quantifizieren Sie dann die Menge der verschiedenen Proteine in den Nanopartikeln durch SDS-PAGE-Analyse unter Verwendung eines Proteinstandards. Zeichnen Sie eine Standardkurve mit den Dichten der MOMP-Bänder.Bestimmen Sie dann die MOMP-Komponente der Nanopartikel mit dem Standard. Lösen Sie die Proben mit SDS-PAGE auf und übertragen Sie die Gelstapel mit einem handelsüblichen Trockenblotting-System für die Western-Blot-Analyse. Entfernen Sie die Blots aus dem Stapel und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius in einem Blockierungspuffer, der 0,2 % TWEEN 20 und 0,5 Mikrogramm pro Milliliter MAb40 oder 0,2 Mikrogramm pro Milliliter MAbHIS-AntiHIS-Tag-Antikörper enthält, der gegen den HIS-Tag des Delta-49ApoA1-Proteins gerichtet ist.Waschen Sie jeden Klecks dreimal für fünf Minuten pro Waschgang mit PBST. Inkubieren Sie die Blots für eine Stunde in einem Blockierungspuffer, der sekundäre Antikörper enthält, die mit einem Fluorophor in einer Verdünnung von 1:10.000 konjugiert sind. Wiederholen Sie die Wäschen mit PBST und nehmen Sie das Bild nach der letzten Wäsche mit einem Fluoreszenz-Imager auf.Tupfen Sie mit einem Dot-Blot-Gerät drei Mikrogramm MOMP-tNLP und entleeren Sie tNLP. Entwickeln und blockieren Sie die Blots mit der gleichen Methode wie beim Western Blotting. Die gemischte Lösung auf Trockeneis einfrieren und über Nacht mit einem Gefriertrockner gefrieren.Lagern Sie die getrockneten Rezepturen bei minus 20 Grad Celsius. Rekonstituieren Sie bei Bedarf die gefriergetrockneten tNLPs mit endotoxinfreiem Wasser und rollen Sie es, um es aufzulösen und zu rehydrieren. Dialysieren Sie die Lösung mit PBS und entfernen Sie die Trehalose mit einer 3,5-Kilodalton-Cutoff-Dialysemembran.Zentrifugieren Sie die Nanopartikellösung in einem Vakuumkonzentrator, bevor Sie das Adjuvans hinzufügen. Überwachen Sie das Probenvolumen nach 20 bis 30 Minuten, um ein vollständiges Austrocknen zu verhindern. Geben Sie das Adjuvans in einer Biosicherheitswerkbank unter sterilen Bedingungen hinzu.Analysieren Sie die Formulierung mit Hilfe der analytischen Größenausschlusschromatographie für eine erfolgreiche Einarbeitung. Lagern Sie die adjuvantierten MOMP-tNLPs und entleeren Sie tNLP bei vier Grad Celsius für bis zu 14 Tage. Analysieren Sie die Stabilität der tNLP-Formulierung mit Größenausschlusschromatographie.Die SDS-PAGE-Analyse von MOMP-tNLP wurde mittels Nickel-Affinitätschromatographie durchgeführt, die zeigte, dass das zellfreie Reaktionsgemisch sowohl für das MOMP- als auch für das delta-49ApoA1-Protein eine hohe Expression aufweist. Mit Hilfe der Geldensitometrie wurde die MOMP-Konzentration unter Verwendung eines gereinigten rekombinanten MOMP mit einer bekannten Konzentration als Standard quantifiziert. Um die Oligomerbildung zu bestimmen, wurden SDS-PAGE MOMP und MOMP-tNLP mit Hitze und DTT behandelt, die unterschiedliche Banden für MOMP und delta-49ApoA1 aufwiesen.Die Western-Blot-Analyse mit dem Antikörper MAb40 wurde gegen das MOMP-Protein durchgeführt, was ein Bandenmuster zeigte, das die Oligomerbildung durch das MOMP-Protein in seinem nicht denaturierten Zustand bestätigte. In Gegenwart von MAb40- und MAbHIS-Antikörpern wurde ein Dot-Blot-Assay durchgeführt, der auf die Bildung von MOMP-tNLP hindeutete. Leeres tNLP zeigte jedoch ein positives Signal für MAbHIS.Seren von immunisierten Mäusen, denen adjuvantiertes MOMP-tNLP injiziert wurde, zeigten eine starke MOMP-Bindung und deuteten darauf hin, dass MOMP-tNLP eine Immunantwort hervorrufen könnte. Da dieses Protokoll Protein aus DNA erzeugt, ist es wichtig, eine Kontamination der Reaktion mit DNase, RNase sowie der fremden DNA und RNA zu vermeiden. Alle Materialien oder Reagenzien, die in den Reaktionen verwendet werden, sollten frei von dieser Art von Molekülen sein.Nach der Expression, Reinigung und Zugabe von Adjuvantien können diese Impfstoffkandidaten in geeigneten Tiermodellen für die interessierenden Krankheitserreger evaluiert werden, um Immunaktivierungsmarker zu bewerten oder den Schutz während einer Herausforderung zu bewerten. Für Chlamydien gilt das Hauptprotein der äußeren Membran (MOMP) seit vielen Jahren als führender Kandidat für Subunit-Impfstoffe, aber es war schwierig, es in den für die Impfstoffanwendung erforderlichen Maßstäben herzustellen. Die zellfreie Co-Expression dieses Membranproteins ist ein gangbarer Weg, um dieses Protein in Tiermodellen wie Mäusen zu evaluieren und schließlich am Menschen zu testen.

cell-free-scaled-production-adjuvant-addition-to-recombinant-major

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Gilmore, S. F., et al. Zellfrei skalierte Produktion und adjuvante Addition an ein rekombinantes Hauptprotein der äußeren Membran aus Chlamydia muridarum für die Impfstoffentwicklung. J. Vis. Exp. (2022)Dieses Video zeigt die zellfreie Synthese von Nanodisc-stabilisierten Membranprotein-Antigenen unter Verwendung eines Dual-Kompartiment-Systems. Das Gerät bietet optimale Bedingungen für eine effiziente Proteinsynthese, eine ordnungsgemäße Faltung und eine stabile Integration in...

Synthese von Nanodisc-stabilisierten Membranprotein-Antigenen mit einem zellfreien System

Quelle: Gilmore, S. F. et al. Zellfrei skalierte Produktion und adjuvante Addition an ein rekombinantes Hauptprotein der äußeren Membran aus Chlamydia muridarum für die Impfstoffentwicklung. J. Vis. Exp. (2022)Dieses Video zeigt die Verwendung von Western Blotting zur Bewertung der strukturellen Integrität des wichtigsten äußeren Membranproteins (MOMP) in Nanopartikel-basierten Impfstoffkomplexen. Es werden die wichtigsten Schritte beim Proteintransfer, der Antikörpermarkierung und der...

Western Blot zur Beurteilung der strukturellen Integrität eines bakteriellen Impfstoffantigens

Dieses Video zeigt eine effiziente Homogenisierungstechnik zur Erzeugung einer Antigen-adjuvanten Emulsion zur Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) in einem Mausmodell. Die Emulsion enthält ein Autoantigen – Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) – in der Wasserphase, umgeben von einer kontinuierlichen Ölphase, die aus einem inaktivierten pathogenen Bakterium besteht. Die Emulsion sorgt für eine anhaltende Freisetzung von Antigenen für eine verlängerte...

Herstellung einer Antigen-Adjuvans-Emulsion zur Induktion der autoimmunen Enzephalomyelitis

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Erzeugung von multivalent anzeigenden Impfstoffen mit äußerem Membranvesikel (OMV). Säugetierzellen werden transfiziert, um virale Antigene zu exprimieren und zu sezernieren, die mit einem SpyTag und einem Polyhistidin-Tag fusioniert sind. Diese Antigene werden dann mit einer Nickel-Nitriotriessigsäure (Ni-NTA)-Affinitätssäule aufgereinigt. Das gereinigte Antigen wird mit äußeren Membranvesikeln gemischt, die das oberflächengebundene SpyCatcher...

Erzeugung eines multivalent anzeigenden Impfstoffs gegen äußere Membranvesikel

Hier, um einen Proof-of-Prinzip zweiwertigen Adenovirus Typ 5 (Ad5) Vektor zu erzeugen präsentieren wir ein Protokoll Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 durch Verwendung des Antigen Capsid-Incorporation Strategie. Dieser Vektor wurde gezeigt qualitative Fitness aufweisen, um die Fähigkeit Ad5-positiven Seren in vitro und die Antigenität als auch die Immunogenität für die zugesetzten Antigene zu entkommen.

Unter Verwendung der Antigen Capsid-Incorporation Strategie für die Förderung der Adenovirus-Serotyp 5-Vectored Vaccine Approaches

Es besteht ein allgemeiner Mangel an Wissen darüber, wie Impfstoffe wirken. Hier schlagen wir die kombinierte Verwendung von reverser Genetik und chimären Knochenmarkmäusen vor, um Einblicke in die frühen Immunantworten des Wirts auf Impfstoffe zu erhalten, mit besonderem Fokus auf dendritische Zellen und T-Zell-Immunität.

Die intranasale Verabreichung von rekombinantem Influenza Vaccines in chimären Maus-Modelle zu Mucosale Immunität Studieren

Hier stellen wir ein Protokoll für die Synthese von virusähnlichen Partikeln entweder Baculovirus oder Säuger-Expressionssystemen und Ultrazentrifugation Reinigung. Dieser hochgradig anpassbare Ansatz wird verwendet, um virale Antigene als Impfstoff Ziele in eine sichere und flexible Art und Weise identifizieren.

Expression und Reinigung von virusähnlichen Partikeln zur Vakzinierung

Hier wird eine detaillierte Methode zur Beschreibung der Reinigung, Umfaltung und Charakterisierung selbstassemblierender Protein-Nanopartikel (SAPNs) für die Impfstoffentwicklung beschrieben.

Herstellung von E. coli-exprimierenden selbstmontierenden Protein-Nanopartikeln für Impfstoffe, die eine trimerische Epitop-Präsentation erfordern

Um eine experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis, ein Tiermodell für Multiple Sklerose, zu induzieren, werden Mäuse mit einer Wasser-in-Öl-Emulsion immunisiert, die ein Autoantigen und ein komplettes Freund-Adjuvans enthält. Während für die Herstellung dieser Emulsionen mehrere Protokolle existieren, wird hier ein schnelles, einfaches und standardisiertes Homogenisierungsprotokoll für die Emulsionsherstellung vorgestellt.

Eine schnelle, einfache und standardisierte Homogenisierungsmethode zur Herstellung von Antigen/Adjuvans-Emulsionen zur Induktion experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis

Dieses Protokoll beschreibt die Anreicherung nativer mykobakterieller extrazellulärer Vesikel (mEVs) aus axenischen Kulturen von Mycobacterium smegmatis (Msm) und wie mCherry (ein rot fluoreszierender Reporter) enthaltende rekombinante MsmEVs entworfen und angereichert werden können. Schließlich wird der neuartige Ansatz mit der Anreicherung von MsmEVs verifiziert, die das EsxA-Protein von Mycobacterium tuberculosis enthalten.

Anreicherung nativer und rekombinanter extrazellulärer Vesikel von Mykobakterien

Das vorliegende Protokoll bereitet die physikalischen Eigenschaften, die Immunantwort und die In-vivo-Schutzwirkung eines neuartigen Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoffs vor und bewertet sie.

Evaluierung der Immunantwort eines adjuvanten Nanoemulsionsimpfstoffs gegen Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA)-Infektion

Erfahren Sie die zellfreie Produktion von Membranproteinen in Nanodiscs für die Impfstoffentwicklung. Diese skalierbare Methode ermöglicht die Herstellung nativer Antigene mit Adjuvantien für Infektionskrankheiten und Krebs.

Zellfreie skalierte Produktion und adjuvante Zugabe zu einem rekombinanten Haupt-Außenmembranprotein aus Chlamydia muridarum für die Impfstoffentwicklung (Video) | JoVE Journal

Zellfreie skalierte Produktion und adjuvante Zugabe zu einem rekombinanten Haupt-Außenmembranprotein aus Chlamydia muridarum für die Impfstoffentwicklung

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