Chemilumineszenz-basierte Assays zum Nachweis von Stickstoffmonoxid und seinen Derivaten aus Autoxidation und nitrosierten Verbindungen

Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, einen Chemilumineszenzdetektor für die Messung von Stickstoffmonoxidmetaboliten kompetent zu verwenden, ohne die Anleitung oder die Kosten für die Beschäftigung von engagiertem Personal vor Ort. Der Chemilumineszenz-basierte Assay ist die empfindlichste Methode, um minimale Veränderungen der Stickoxidspiegel und seiner Metaboliten in einer bestimmten biologischen Probe nachzuweisen. Inhaliertes Stickstoffmonoxid ist ein therapeutisches Gas, das für eine Vielzahl von Krankheiten verwendet wird.

Es ist von entscheidender Bedeutung, dass das Fortschreiten und die Genesung der Krankheit genau mit den Stickoxid-Metabolitenspiegeln korreliert werden. Inhalatives Stickstoffmonoxid, ein antimikrobielles Mittel, ist vielversprechend bei der Behandlung von Patienten mit Atemwegsinfektionserkrankungen. Die Chemilumineszenzmethode liefert Einblicke in die Korrelation der Stickstoffmonoxiddosis und ihrer Metaboliten mit mikrobiologischen und pathophysiologischen Veränderungen.

Um die DETA-NONOat-Lösung herzustellen, fügen Sie 10 Milligramm DETA-NONOat zu 610 Mikrolitern 10-Millimolar Natriumhydroxid in PBS mit einem pH-Wert von 7,4 hinzu, um 100 Millimolar DETA-NONOate zu erzeugen und es auf Eis zu halten. Um fortzufahren, schließen Sie die Sauerstoffleitung an den Chemilumineszenzdetektor an und öffnen Sie den Sauerstofftank mit einem Druck gemäß den Anweisungen des Herstellers im Text. Schließen Sie dann die dielektrische Intensivfeldfilterleitung an den Chemilumineszenzdetektor an.

Starten Sie an der Schnittstelle des Chemilumineszenzdetektors das Detektionsprogramm für Flüssigphasenassays, um sicherzustellen, dass die Sauerstoffversorgung ausreichend ist, und der Detektor beginnt mit der Probenahme, was die Erkennung durch Signal in Millivolt anzeigt und andernfalls ein negatives Diagnosesignal auslöst. Um das Spülschiff vorzubereiten, schließen Sie das Spülgefäß an allen drei Anschlüssen, indem Sie das Nadelventil vollständig nach rechts schrauben und die Einlass- und Auslassbremshähne schließen. Entfernen Sie die Kappe vom Spülgefäß.

Fügen Sie der Reaktionskammer eine ausreichende Menge des für den geplanten Assay spezifischen Reagenzes hinzu, damit die zur Injektion der Proben verwendete Spritzennadel die Flüssigkeitssäule erreichen kann, während das Vorhandensein einer stabilen, gewünschten Baseline überprüft wird. Um den Spülgasfluss zu starten, stellen Sie sicher, dass der Inertgastank mit einem zweistufigen Regler ausgestattet ist, und verbinden Sie den Inertgastank mit dem Gaseinlass des Schiffes. Öffnen Sie dann den Auslass des Spülbehälters und öffnen Sie das Gas mit einem Ausgangsdruck am Regler von ein bis fünf Pfund pro Quadratzoll.

Öffnen Sie dann den Einlass des Spülbehälters und öffnen Sie langsam das Nadelventil des Spülbehälters, um den Zufluss von Gas zu ermöglichen und das Blubbern im Spülbehälter zu überprüfen. Um den Gasfluss einzustellen, zeichnen Sie den vom Chemilumineszenzdetektor gemessenen Zelldruck mit der dielektrischen Intensivfeldfilterleitung auf, die Umgebungsluft abtastet. Positionieren Sie die Kappe auf dem Spülbehälter neu und schließen Sie die dielektrische Intensivfeldfilterleitung an das Spülgefäß an.

Verwenden Sie das Nadelventil, um den gleichen Zelldruck auf der Ebene des Chemilumineszenzdetektors zu erreichen, der in der Umgebungsluft aufgezeichnet wird. Um das Chemilumineszenz-Signalerfassungsprogramm zu starten, schließen Sie die serielle Schnittstelle des Chemilumineszenzdetektors an die serielle Schnittstelle des Computers an, in der das Erfassungsprogramm installiert wurde. Führen Sie dann das Analyseprogramm aus.

Klicken Sie auf Erwerben, wählen Sie dann den Ordner aus, in dem die Datendatei gespeichert werden soll, geben Sie den Dateinamen ein und klicken Sie auf Speichern. Passen Sie während der Vorbereitung der Probeninjektion die Spannungsskala auf dem Bildschirm so an, dass sie die Kontrolle über die angestrebte Baseline hat, indem Sie auf die Schaltflächen Minimum und / oder Maximum klicken und dann den gewünschten Wert eingeben. Um die Probeninjektion durchzuführen, spülen Sie die Spritze mindestens zweimal oder länger mit entionisiertem und destilliertem Wasser ab, bevor Sie jede Probe entnehmen, und stellen Sie einen ungehinderten Wasserauswurf auf einem Aufgabentuch sicher.

Setzen Sie dann die Spritze in das Probenröhrchen ein, während Sie sowohl die Spritze als auch das Röhrchen in einem engen Abstand halten, und ziehen Sie den Kolben auf das gewünschte Volumen hoch, während Sie sicherstellen, dass keine Luftblase oder nicht homogenisierte feste Teile eingeschlossen werden. Reinigen Sie die Spitze der Spritze mit einem Aufgabenwischer und setzen Sie die Spritze am Einspritzanschluss in die Setterkappe ein. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass sich die Spitze der Spritze in der flüssigen Phase befindet, injizieren Sie die Probe in die Reaktionskammer.

Um die Injektion im Softwareprogramm zu markieren, geben Sie den Probennamen ein, indem Sie auf das graue Feld unter Probennamen klicken, klicken Sie dann auf Injektion markieren, während Sie überprüfen, ob die Injektion eine Veränderung des Signals nach oben oder nach unten im Stickoxidverbrauch durch zellfreien Hämoglobin-Assay verursacht. Die Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen zellfreiem Hämoglobin und Stickstoffmonoxidverbrauch wurde durch Chemilumineszenz nach kardiopulmonalem Bypass gemessen. Es ist davon auszugehen, dass es im oxidierten Status eine hohe Konzentration von Hämgruppen gibt, die Stickstoffmonoxid abfangen.

Bei Patienten, die während des kardiopulmonalen Bypasses Stickoxid erhalten, ist die Mehrheit der Hämgruppen reduziert und verbraucht kein Stickstoffmonoxid. Messungen der zellfreien Hämoglobinkonzentration zeigten eine langsame Elimination aus dem Plasma innerhalb von 12 Stunden nach dem kardiopulmonalen Bypass. Der Stickoxidverbrauch erreichte jedoch mit 15 Minuten seinen Höhepunkt und spiegelte nicht die Eliminierung von zellfreiem Hämoglobin wider.

Die linearen Regressionskurven des Stickstoffmonoxidverbrauchs durch zellfreies Hämoglobin zeigten eine Prävalenz von oxidiertem und stickoxidverbrauchendem Hämoglobin nach 15 Minuten, im Gegensatz zu einem stärker reduzierten Hämoglobin zu Studienbeginn von 4 Stunden und 12 Stunden nach dem kardiopulmonalen Bypass. Die Auswirkungen der Verabreichung von Stickoxidgas auf den Stickoxidverbrauch wurden überwacht. Wenn Patienten intra- und postoperativ mit Stickstoffmonoxidgas behandelt wurden, war der beobachtete Anstieg des freien Hämoglobins nach dem kardiopulmonalen Bypass nicht mit einem Anstieg des Stickoxidverbrauchs verbunden.

Die Ergebnisse zeigten, dass exogen verabreichtes Stickstoffmonoxid den größten Teil des freien Hämoglobins reduzierte und das Abfangen von Stickoxid verhinderte. Das Experiment ist nur gültig, wenn alle Bedingungen gleich bleiben. Wenn die Höhe des Flüssigkeitsstandes die Reaktionssäule überschreitet, müssen wir anhalten und eine neue Kalibrierung durchführen.