Name: Vorbereitung und Aufzucht axenischer Insekten mit gewebekultivierten Sämlingen für Wirt-Darm-Mikrobiota-Interaktionsstudien des Blattkäfers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Lernen Sie die Aufzucht axenischer Insekten aus oberflächensterilisierten Eiern auf gewebekultivierten Blättern für Studien zu Wirt-Darm-Mikrobiota-Interaktionen. Diese Methode ermöglicht bakterienfreie Zucht ohne Antibiotika.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (31971663) und dem Young Elite Scientists Sponsorship Program von CAST (2020QNRC001) finanziert.

1. Insektenaufzucht
<ol><li>Halten Sie die P. versicolora-Population in einer Wachstumskammer bei 27 °C und 70 ± 5% relativer Luftfeuchtigkeit mit einer Photoperiode von 16 h hell/8 h dunkel. Legen Sie sie in perforierte Kunststoffboxen mit gefliestem, nass absorbierendem Papier und füttern Sie sie mit frischen Pappelzweigen. Sprühen Sie sauberes Wasser auf das absorbierende Papier, um die Feuchtigkeit zu erhalten und die Zweige alle zwei Tage zu wechseln.</li>
	<li>Isolieren Sie Erwachsene für die Eiablage nach der Verpuppung. Füttere sie mit zarten Blättern, um mehr Eier zu erhalten.</li>
	<li>Sammeln Sie neu gelegte Eier (innerhalb von 24 Stunden). Legen Sie die Eier 60 h lang auf feuchtes, absorbierendes Papier, um axenische Larven vorzubereiten. HINWEIS: Neu gelegte Eier schlüpfen nach ~72 h. Die beste Zeit, um Eioberflächen zu sterilisieren, ist der Tag vor dem Schlüpfen; Andernfalls nimmt die Anzahl der erfolgreich geschlüpften Eier ab.</li>
</ol>2. Keimfreier Pappelanbau
<ol><li>Bereiten Sie Murashige und Skoog (MS) -Medium und 1 mg/ml α-Naphthalin-Essigsäure (NAA) Stammlösungen vor (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>In einer Biosicherheitshaube 50 μL 1 mg/ml NAA-Stammlösung zu 500 ml MS-Medium hinzufügen, gut schütteln, gut mischen, ~ 50 ml pro Gewebekulturbehälter gießen und auf die Erstarrung warten.</li>
	<li>Bereiten Sie Skalpelle, Alkohollampe und Pinzette vor; Sterilisieren Sie die Skalpelle und Pinzetten in der Alkohollampenflamme in der Biosicherheitshaube.</li>
	<li>Schneiden Sie 3-4 cm Stielsegmente mit apikalen Knospen oder lateralen Knospen aus Pappelsämlingen bei ~ 1 Wachstumsmonat (keimfreie, gewebekultivierte Sämlinge) und legen Sie sie in das Kulturmedium, ein oder zwei Stängelsegmente pro Behälter.</li>
	<li>Inkubieren Sie diese Stammsegmente in einer Wachstumskammer bei 25 °C und 50 ± 10 cd Lichtintensität mit einer Photoperiode von 16 h hell/8 h dunkel für ca. 30 Tage. Verwenden Sie die keimfreien Blätter, um die axenischen Larven zu füttern.</li>
</ol>3. Sterilisation der Eioberfläche und Aufzucht axenischer Larven
<ol><li>Autoklav Petrischale, Pinsel, Filterpapier, destilliertes Wasser und eine Petrischale mit LB (Luria-Bertani) Agarmedium.</li>
	<li>Blätter mit anhaftenden Eiern in eine Petrischale legen, die Eier vorsichtig mit einer Pinzette von den Blättern entfernen und in eine andere Petrischale geben. HINWEIS: Dieser Schritt sollte sehr sorgfältig durchgeführt werden, da die Eier an den Blättern haften.</li>
	<li>Waschen Sie diese Eier mit 75% Ethanol für 8 min und wiederholen Sie die Wäsche viermal mit sterilem Wasser.</li>
	<li>Übertragen Sie die Eier auf LB-Agarmedium, um Feuchtigkeit für das Schlüpfen zu erhalten. HINWEIS: Die Verwendung von LB-Agar-Medium kann helfen, zu überprüfen, ob das desinfizierte Ei keimfrei ist.</li>
	<li>Legen Sie die Petrischale in eine Wachstumskammer und warten Sie, bis die Eier innerhalb von 24 Stunden geschlüpft sind.</li>
	<li>In einer Biosicherheitshaube drei Stücke Nassfilterpapier in einer Petrischale kacheln, keimfreie Pappelblätter auf das Papier legen, die Larven sammeln und auf die Blätter legen, die Petrischale mit Parafilm verschließen und in einer Wachstumskammer bei 27 °C und 70 ± 5% relativer Luftfeuchtigkeit mit einer Photoperiode von 16 h hell/8 h dunkel inkubieren. HINWEIS: Die gewebekultivierten Blätter sind empfindlich und können schnell Wasser verlieren. Daher ist die Verwendung von feuchtem Filterpapier notwendig, wenn die Blätter in die Petrischale überführt werden.</li>
	<li>Wechseln Sie die Blätter alle zwei Tage.</li>
	<li>Für die konventionell aufgezogenen Gruppen die Eier von den Blättern in eine Petrischale mit feuchtem Filterpapier geben und diese Larven mit keimfreien Pappelblättern füttern.</li>
</ol>4. Nachweis axenischer Larven mit kulturabhängigen Assays
<ol><li>Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip drei Larven des 1., 2. und3. Stadiums aus den keimfreien und konventionell aufgezogenen Gruppenaus.</li>
	<li>Sezieren Sie die Larven des 3. Stadium mit steriler Schere und Pinzette unter einem Stereomikroskop und sammeln Sie ihre Eingeweide in Mikrozentrifugenröhrchen. Sammeln Sie intakte 1. und 2. Instarlarven in Röhren. HINWEIS: Sammeln Sie ganze Larven des 1. und 2. Stadiums, da sie zu klein sind, um sie zu sezieren, und halten Sie ihre Eingeweide intakt.</li>
	<li>Fügen Sie 100 μL phosphatgepufferte Kochsalzlösung und drei Stahlkugeln zu 1,5 ml-Rohren hinzu und mahlen Sie die Gewebe mit einem Perlen-schlagenden Homogenisator zu Homogenaten.</li>
	<li>100 μL des Homogenats mit einem sterilen Glasstreustab in LB-Agarmedium und -platte geben.</li>
	<li>Platzieren Sie die Platten 24 h lang bei 37 °C und beobachten Sie die Bakterienkolonien.</li>
</ol>5. Verifizierung axenischer Individuen mit kulturunabhängigen Assays
<ol><li>Extrahieren Sie die gesamte DNA des Gewebes (erhalten in Abschnitt 4) mit einem DNA-Extraktionskit.</li>
	<li>Messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer bei 260 nm.</li>
	<li>Amplifizieren Sie das bakterielle 16S rRNA-Gen mit universellen 16S rRNA-Primern mit PCR. Richten Sie das Reaktionssystem mit 18 μL 1,1-facher PCR-Mastermischung (siehe Materialtabelle), 0,5 μL 27F-Primer (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3'), 0,5 μL 1495R-Primer (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3') und 100 ng-Template-DNA ein. Stellen Sie die PCR-Bedingungen für 3 min auf 95 °C ein; 28 Zyklen von 95 °C für 30 s, 55 °C für 1 min und 72 °C für 1 min; gefolgt von 72 °C für 10 min. Lagern Sie die PCR-Produkte bis zur weiteren Analyse bei 4 °C.</li>
	<li>Mischen Sie die PCR-Produkte mit Nukleinsäurefarbstoff und analysieren Sie sie mittels Elektrophorese auf einem 1% Agarosegel in 1x TAE-Puffer. Verwenden Sie 10 μL eines DNA-Markers als Referenz.</li>
	<li>Beobachten Sie das Gel mit einem UV-Transilluminator und suchen Sie nach dem Zielfragment um 1.500 bp.</li>
</ol>

<ol><li>Moran, N. A., Ochman, H., Hammer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+and+ecological+consequences+of+gut+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Ecology%2C+Evolution%2C+and+Systematics%22%5BJournal%5D)">Evolutionary and ecological consequences of gut microbial communities.</a> Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 50 (1), 451-475 (2019).</li>
<li>Warnecke, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+and+functional+analysis+of+hindgut+microbiota+of+a+wood-feeding+higher+termite%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite.</a> Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).</li>
<li>Tokuda, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber-associated+spirochetes+are+major+agents+of+hemicellulose+degradation+in+the+hindgut+of+wood-feeding+higher+termites%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fiber-associated spirochetes are major agents of hemicellulose degradation in the hindgut of wood-feeding higher termites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 11996-12004 (2018).</li>
<li>Wang, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+microbiome+confer+multigenerational+host+resistance+after+sub-toxic+pesticide+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure.</a> Cell Host & Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).</li>
<li>Shin, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+microbiome+modulates+host+developmental+and+metabolic+homeostasis+via+insulin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling.</a> Science. 334 (6056), 670-674 (2011).</li>
<li>Storelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactobacillus+plantarum+promotes+Drosophila+systemic+growth+by+modulating+hormonal+signals+through+TOR-dependent+nutrient+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing.</a> Cell Metabolism. 14 (3), 403-414 (2011).</li>
<li>Salem, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+supplementation+by+gut+symbionts+ensures+metabolic+homeostasis+in+an+insect+host%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings.+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Vitamin supplementation by gut symbionts ensures metabolic homeostasis in an insect host.</a> Proceedings. Biological Sciences. 281 (1796), 20141838(2014).</li>
<li>Koch, H., Schmid-Hempel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Socially+transmitted+gut+microbiota+protect+bumble+bees+against+an+intestinal+parasite%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19288-19292 (2011).</li>
<li>Cirimotich, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+microbe-mediated+refractoriness+to+Plasmodium+infection+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural microbe-mediated refractoriness to Plasmodium infection in Anopheles gambiae.</a> Science. 332 (6031), 855-858 (2011).</li>
<li>Kaltenpoth, M., Gottler, W., Herzner, G., Strohm, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiotic+bacteria+protect+wasp+larvae+from+fungal+infestation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Symbiotic bacteria protect wasp larvae from fungal infestation.</a> Current Biology. 15 (5), 475-479 (2005).</li>
<li>Yuan, C., Xing, L., Wang, M., Hu, Z., Zou, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiota+modulates+gut+immunity+and+promotes+baculovirus+infection+in+Helicoverpa+armigera%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Microbiota modulates gut immunity and promotes baculovirus infection in Helicoverpa armigera.</a> Insect Science. , (2021).</li>
<li>Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromones+-+Exploitation+of+gut+bacteria+in+the+locust%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pheromones - Exploitation of gut bacteria in the locust.</a> Nature. 403 (6772), 851(2000).</li>
<li>Xu, L. T., Lou, Q. Z., Cheng, C. H., Lu, M., Sun, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-associated+bacteria+of+Dendroctonus+valens+and+their+involvement+in+verbenone+production%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Gut-associated bacteria of Dendroctonus valens and their involvement in verbenone production.</a> Microbial Ecology. 70 (4), 1012-1023 (2015).</li>
<li>Schretter, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gut+microbial+factor+modulates+locomotor+behaviour+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila.</a> Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiome+modulates+Drosophila+aggression+through+octopamine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Gut microbiome modulates Drosophila aggression through octopamine signaling.</a> Nature Communications. 12 (1), 2698(2021).</li>
<li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+and+immunological+effects+of+gut+microbiota+in+leaf+beetles+at+the+local+and+systemic+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Zoology%22%5BJournal%5D)">Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels.</a> Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+action+of+the+gut+microbiota+in+environmental+RNA+interference+in+a+leaf+beetle%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle.</a> Microbiome. 9 (1), 98(2021).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+in+an+invasive+bark+beetle+infected+by+a+pathogenic+fungus+accelerates+beetle+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pest+Science%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota in an invasive bark beetle infected by a pathogenic fungus accelerates beetle mortality.</a> Journal of Pest Science. 92, 343-351 (2019).</li>
<li>Berasategui, A., Shukla, S., Salem, H., Kaltenpoth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+applications+of+insect+symbionts+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Potential applications of insect symbionts in biotechnology.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (4), 1567-1577 (2016).</li>
<li>Tikhe, C. V., Martin, T. M., Howells, A., Delatte, J., Husseneder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+genetically+engineered+Trabulsiella+odontotermitis+as+a+%27Trojan+Horse%27+for+paratransgenesis+in+termites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Assessment of genetically engineered Trabulsiella odontotermitis as a 'Trojan Horse' for paratransgenesis in termites.</a> BMC Microbiology. 16 (1), 202(2016).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fighting+malaria+with+engineered+symbiotic+bacteria+from+vector+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fighting malaria with engineered symbiotic bacteria from vector mosquitoes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12734-12739 (2012).</li>
<li>Leonard, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+symbionts+activate+honey+bee+immunity+and+limit+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens.</a> Science. 367 (6477), 573-576 (2020).</li>
<li>Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+germ-free+Drosophila+to+study+gut-microbe+interactions%3A+protocol+to+rear+Drosophila+under+axenic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Generating germ-free Drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions.</a> Current Protocols in Toxicology. 77 (1), 52(2018).</li>
<li>Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+lifespan+enhancement+by+exogenous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).</li>
<li>Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+axenic+Aedes+aegypti+demonstrate+live+bacteria+are+not+required+for+mosquito+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development.</a> Nature Communications. 9 (1), 4464(2018).</li>
<li>Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+germ-free+mosquitoes+via+transient+colonisation+allows+stage-specific+investigation+of+host-microbiota+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions.</a> Nature Communications. 12 (1), 942(2021).</li>
<li>Berasategui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+of+the+pine+weevil+degrades+conifer+diterpenes+and+increases+insect+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota of the pine weevil degrades conifer diterpenes and increases insect fitness.</a> Molecular Ecology. 26 (15), 4099-4110 (2017).</li>
<li>Lin, X. L., Kang, Z. W., Pan, Q. J., Liu, T. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+five+antibiotics+on+larval+gut+bacterial+diversity+of+Plutella+xylostella+%28Lepidoptera%3A+Plutellidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Evaluation of five antibiotics on larval gut bacterial diversity of Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae).</a> Insect Science. 22 (5), 619-628 (2015).</li>
<li>Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y., Shi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+red+palm+weevil+Rhynchophorus+Ferrugineus+%28Olivier%29+%28Coleoptera%3A+Dryophthoridae%29+germ-free+larvae+for+host-gut+microbes+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies.</a> Bio-protocol. 9 (24), 3456(2019).</li>
<li>Gelman, D. B., Bell, R. A., Liska, L. J., Hu, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+diets+for+rearing+the+Colorado+potato+beetle%2C+Leptinotarsa+decemlineata%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Artificial diets for rearing the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata.</a> Journal of Insect Science. 1, 7(2001).</li>
<li>Bengtson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+program+for+the+evaluation+of+artificial+diets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+World+Aquaculture+Society%22%5BJournal%5D)">A comprehensive program for the evaluation of artificial diets.</a> Journal of the World Aquaculture Society. 24 (2), 285-293 (2007).</li>
<li>Utsumi, S., Ando, Y., Ohgushi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+feeding+preference+in+a+leaf+beetle%3A+the+importance+of+phenotypic+plasticity+of+a+host+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+Letters%22%5BJournal%5D)">Evolution of feeding preference in a leaf beetle: the importance of phenotypic plasticity of a host plant.</a> Ecology Letters. 12 (9), 920-929 (2009).</li>
<li>Ishihara, M., Ohgushi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+inactivity+and+prolonged+developmental+time+induced+by+seasonal+decline+in+host+plant+quality+in+the+willow+leaf+beetle+Plagiodera+versicolora+%28Coleoptera%3A+Chrysomelidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Entomology%22%5BJournal%5D)">Reproductive inactivity and prolonged developmental time induced by seasonal decline in host plant quality in the willow leaf beetle Plagiodera versicolora (Coleoptera: Chrysomelidae).</a> Environmental Entomology. 35 (2), 524-530 (2006).</li>
<li>Bright, M., Bulgheresi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+journey%3A+transmission+of+microbial+symbionts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A complex journey: transmission of microbial symbionts.</a> Nature Reviews: Microbiology. 8 (3), 218-230 (2010).</li>
<li>Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertically+transmitted+gut+bacteria+and+nutrition+influence+the+immunity+and+fitness+of+Bactrocera+dorsalis+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 596352(2020).</li>
<li>Hosokawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obligate+bacterial+mutualists+evolving+from+environmental+bacteria+in+natural+insect+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Obligate bacterial mutualists evolving from environmental bacteria in natural insect populations.</a> Nature Microbiology. 1, 15011(2016).</li>
<li>Habineza, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoting+effect+of+gut+microbiota+on+growth+and+development+of+red+palm+weevil%2C+Rhynchophorus+ferrugineus+%28Olivier%29+%28Coleoptera%3A+Dryophthoridae%29+by+modulating+its+nutritional+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The promoting effect of gut microbiota on growth and development of red palm weevil, Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) by modulating its nutritional metabolism.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1212(2019).</li>
<li>Meilan, R., Ma, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poplar+%28Populus+spp.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Poplar (Populus spp.).</a> Methods in Molecular Biology. 344, Clifton, N.J. 143-151 (2006).</li>
<li>Wani, Z. A., Ashraf, N., Mohiuddin, T., Riyaz-Ul-Hassan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-endophyte+symbiosis%2C+an+ecological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Plant-endophyte symbiosis, an ecological perspective.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (7), 2955-2965 (2015).</li>
<li>Grout, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meristem-tip+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Meristem-tip culture.</a> Methods in Molecular Biology. 6, Clifton, N.J. 81-91 (1990).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Die Herstellung keimfreier Larven und die Gewinnung von gnotobiotischen Larven durch Wiedereinführung spezifischer Bakterienstämme sind leistungsfähige Methoden, um die Mechanismen aufzuklären, die den Wirt-Mikroben-Interaktionen zugrunde liegen. Neu geschlüpfte Larven erhalten Darmmikrobiota auf zwei Arten: vertikale Übertragung von der Mutter auf die Nachkommen oder horizontale Akquisition von Geschwistern und der Umwelt34. Ersteres kann durch elterliche Übertragung auf den Nachwuchs durch Konta...

Ähnlich wie bei Säugetieren ist der Verdauungstrakt von Insekten eine Höhle für die Nahrungsverdauung und -absorption. Die meisten Insekten beherbergen verschiedene kommensale Bakterien, die in ihren Eingeweiden gedeihen und von der Ernährung leben, die von Wirten1 geliefert wird. Die kommensale Darmgemeinschaft hat einen tiefgreifenden Einfluss auf mehrere physiologische Prozesse bei Insekten, einschließlich Nahrungsverdauung und Entgiftung 2,3,4, Ernährung und Entwicklung 5,6,7, Abwehr von Krankheitserregern und Parasiten 8,9,10,11, chemische Kommunikation 12,13 und Verhalten 14 ,15. Interessanterweise können einige Darmmikrobiota fakultativ pathogen sein oder durch eindringende Krankheitserreger manipuliert werden, um die Infektion zu verschlimmern, was darauf hindeutet, dass Darmbakterien in einigen Fällen schädlich sein können16,17,18. Darmbakterien können auch als mikrobielle Ressource für biotechnische Anwendungen und die Schädlingsbekämpfung dienen. Zum Beispiel wurden lignocelluloseverdauende Bakterien aus phytophagen und xylophagen Insekten verwendet, um Pflanzenzellen für die Entwicklung von Biokraftstoffen zu verdauen19. Die Ausbreitung von technisch hergestellten Darmsymbionten, die bioaktive Moleküle exprimieren, ist eine neuartige und vielversprechende Taktik zur Bekämpfung von land- und forstwirtschaftlichen Schädlingen und Moskitos, die Infektionskrankheiten übertragen 19,20,21, die auch zur Verbesserung der Fitness von Nützlingen eingesetzt werden können 22. Die Veranschaulichung, wie sich ein Darmbakterium in vivo verhält, wird daher als Priorität angesehen, um seine Funktion voll auszuschöpfen und für verschiedene Anwendungen weiter zu nutzen.
Tiere können 1 bis >1000 symbiotische mikrobielle Arten im Darm1 beherbergen. Infolgedessen ist es schwierig, genau zu überprüfen, wie sich einzelne bakterielle Taxa oder ihre Ansammlung in einem Tier verhalten und ob der Wirt oder seine mikrobiellen Partner eine bestimmte Funktion ausüben. Daher ist die Vorbereitung axenischer Larven zur Gewinnung von gnotobiotischen Insekten durch Mono- oder Multispezies-Kolonisation notwendig, um die bakterielle Funktion und Interaktion mit Insektenzu untersuchen 23. Gegenwärtig sind die Verabreichung von Antibiotika-Cocktails und die Sterilisation der Oberfläche von Insekteneiern gängige Methoden, um Darmbakterien zu entfernen 14,24,25,26. Antibiotika-Diäten können Darmbakterien jedoch nicht vollständig eliminieren und wirken sich negativ auf die Insektenphysiologie des Wirtsaus 27,28. Folglich kann die Verwendung von mit Antibiotika behandelten Insekten die wahren Fähigkeiten einiger Darmbakterien verschleiern. Glücklicherweise kann die Oberflächensterilisation von Eiern dieses Problemaufheben 23,29, das keine oder nur zu vernachlässigende Auswirkungen auf experimentelle Insekten hat. Darüber hinaus können künstliche Diäten der natürlichen Insektennahrung nicht vollständig ähneln, und die Entwicklung einer künstlichen Ernährung ist ein kostspieliger und arbeitsintensiver Prozess30,31.
Der Weidenblattkäfer, Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera: Chrysomelidae), ist ein weit verbreiteter blattfressender Schädling, der sich hauptsächlich von salicaceous Bäumen wie Weiden (Salix) und Pappeln (Populus L.) ernährt. 32,33 Hier wurde der Weidenblattkäfer als repräsentatives blattfressendes Insekt verwendet, um ein Protokoll zur Vorbereitung und Aufzucht eines keimfreien Insekts zu entwickeln. Wir nutzten die pflanzliche Gewebekultur, um keimfreie Pappelblätter zu erhalten, um P. versicolora axenische Larven aus sterilisierten Eiern zu züchten. Der axenische Status von P. versicolora-Larven wurde durch kulturabhängige und kulturunabhängige Assays verifiziert. Dieses Protokoll kann axenische Insekten aufrechterhalten, die den Wildzustand besser nachahmen als Insektenaufzucht mit einer künstlichen Diät. Noch wichtiger ist, dass diese Methode zu sehr niedrigen Kosten geeignet ist, was die Machbarkeit der Gewinnung axenischer Insekten für zukünftige Insekten-Darm-Mikrobiota-Interaktionsstudien erhöht, insbesondere für Nicht-Modellinsekten ohne gut entwickelte künstliche Diäten.

<table><tbody><tr><td>0,22 &Mikro; m Spritzenfilter</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>1 mg/ml NAA-Stammlösung</td><td></td><td></td><td>a. 0,1 M NaOH-Lösung herstellen (0,8 g NaOH in 200 ml destilliertem Wasser lösen). b. 0,2 g NAA in ein 250-ml-Becherglas geben, etwas 0,1 M NaOH-Lösung hinzufügen, bis sich NAA aufgelöst hat, und das Endvolumen mit destilliertem Wasser auf 200 ml einstellen. c. Die Lösung zur Entfernung von Bakterien mit einem 0,22 μ μ filtrieren; m Spritzenvorsatzfilter und eine sterile 50-ml-Spritze, verpacken Sie die Lösung in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen und stellen Sie sie bei -20 °C wieder her.</td></tr><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Sangon Biotech</td><td>F600620</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS Stammlösung</td><td>Biosharp Life Sciences</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>2 M KOH Lösung</td><td></td><td></td><td>Lösen Sie 22,44 g KOH (Molekulargewicht: 56,1) in 200 mL destilliertem Wasser auf und autoklavieren Sie es für 20 min bei 121 °C.</td></tr><tr><td>250 mL und 2.000 mL Becher</td><td>Shubo</td><td>sb16455</td><td></td></tr><tr><td>50 mL sterile Spritzen</td><td>Jinta</td><td>JT0125789</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Messzylinder</td><td>Shubo</td><td>sb1601</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE Stammlösung</td><td></td><td></td><td>a.&nbsp; 242 g Tris und 18,612 g EDTA werden in 700 ml destilliertem Wasser gelöst. b. Stellen Sie den pH-Wert mit etwa 57,1 ml Essigsäure auf 7,8 ein. c. Stellen Sie das endgültige Volumen auf 1.000 mL. d ein. Die Stammlösung wurde bei Verwendung auf 1x TAE-Puffer verdünnt.</td></tr><tr><td>75% Ethanol</td><td>Xingheda trade</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-naphthalinessigsäure (NAA)</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>86-87-3</td><td></td></tr><tr><td>Absorptionspapier</td><td></td><td></td><td>22,3 cm x 15,3 cm x 9 cm</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Coolaber</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biowest</td><td>111860</td><td></td></tr><tr><td>Autoklav</td><td>Panasonic</td><td>MLS-3781L-PC</td><td></td></tr><tr><td>Bead-Beating Homogenisator</td><td>Jing Xin</td><td>XM-GTL64</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Extraktionskit</td><td>MP Biomedicals</td><td>116560200</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Saiguo Biotech</td><td>1340</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Jiaojie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelelektrophoreseeinheit</td> <td>mit 70 mm DurchmesserBio-rad</td><td>164-5052</td><td></td></tr><tr><td>Gel Signal Green Nukleinsäurefarbstoff</td><td>TsingKe</td><td>TSJ003</td><td></td></tr><tr><td>Keimfreie Pappelsämlinge Shan</td><td></td><td></td><td>Xin Pappel von der Universität Ludong in der Provinz Shandong</td></tr><tr><td>Golden Star Super PCR Master Mix (1,1&fach;)</td><td>TsingKe</td><td>TSE101</td><td></td></tr><tr><td>Wachstumskammer</td><td>Ruihua</td><td>HP400GS-C</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar Medium</td><td></td><td></td><td>a. 5 g Trypton, 5 g NaCl, 2,5 g Hefeextrakt in 300 mL destilliertem Wasser auflösen b. Das Endvolumen auf 500 mL einstellen, die Lösung in einen 1.000 mL Konuskolben überführen und 7,5 g Agar hinzufügen. c. Das Medium 20 Minuten lang bei 121 μC autoklavieren.</td></tr><tr><td>Mini-Zentrifuge</td><td>DRAGONLAB</td><td>D1008</td><td></td></tr><tr><td>MS basisch Medium</td><td>Coolaber</td><td>PM1121-50L</td><td>M0245</td></tr><tr><td>MS festes Medium für keimfreie Pappelsämlingskultur</td><td></td><td></td><td>a. 4,43 g MS basisches Medium Pulver und 30 g Saccharose in 800 mL destilliertem Wasser auflösen. b. Den pH-Wert mit 2 M KOH mit einem pH-Messgerät auf ca. 5,8 einstellen. c. Das Endvolumen auf 1.000 mL einstellen, In zwei Teile trennen, in zwei 1.000-ml-Konuskolben umfüllen und 2,6 g Agar pro 500 ml. Tag hinzufügen. Autoklav für 20 min bei 121 °C.</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spektralphotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinsel</td><td></td><td></td><td>1 cm breit, zum Sammeln der Eier</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>PCR Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>6331000076</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Supin</td><td></td> pH-Messgerät <td>90 mm Durchmesser</td></tr><tr><td></td><td>METTLER TOLEDO</td><td>FE20</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten 0,2-2 &Mikro; L</td><td>Gilson</td><td>ECS000699</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten 100-1.000 & Mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3120000267</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten 20-200 & Mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3120000259</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten 2-20 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3120000232</td><td></td></tr><tr><td>Kulturbehälter für pflanzliche Gewebe</td><td>Chembase</td><td>ZP21</td><td>240 mL</td></tr><tr><td>Kunststoffbox</td><td></td><td></td><td>2,35 l</td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid (KOH)</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer zur Amplifikation des bakteriellen 16S rRNA-Gens</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td>27-F: 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3', 1492R: 5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3'</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stahlkugeln</td><td></td><td>0,25 mm</td><td>zum Zerkleinern von Geweben</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>OLYMPUS</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trans2K plus II DNA Marker</td><td>Transgene Biotech</td><td>BM121-01</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Basis</td><td>Biosharp Life Sciences</td><td>1115</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; LP0037</td><td></td></tr><tr><td>UV-Transilluminator</td><td>Monad Biotech</td><td>QuickGel 6100</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Scilogex</td><td>MX-S</td><td></td></tr><tr><td>Weidenzweige</td><td></td><td></td><td>Sha Lake Park, Wuhan, China</td></tr><tr><td>Weidenblattkäfer</td><td></td><td></td><td>Huazhong Agricultural University, Wuhan, China</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

vorbereitung und aufzucht axenischer insekten mit gewebekultivierten sämlingen für wirt-darm-mikrobiota-interaktionsstudien des blattkäfers

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

Insektendärme werden von verschiedenen Bakterien besiedelt, die die physiologischen Merkmale des Wirts tiefgreifend beeinflussen können. Die Einführung eines bestimmten Bakterienstamms in ein axenisches Insekt ist eine leistungsstarke Methode, um die mikrobielle Funktion des Darms zu überprüfen und die Mechanismen aufzuklären, die den Interaktionen zwischen Darmmikrobe und Wirt zugrunde liegen. Die Verabreichung von Antibiotika oder die Sterilisation von Eioberflächen sind zwei häufig verwendete Methoden, um Darmbakterien von Insekten zu entfernen. Zusätzlich zu den möglichen nachteiligen Auswirkungen von Antibiotika auf Insekten zeigten frühere Studien, dass die Fütterung von Antibiotika Darmbakterien nicht eliminieren konnte. Daher werden keimfreie künstliche Diäten im Allgemeinen verwendet, um axenische Insekten zu erhalten, was ein langwieriger und arbeitsintensiver Prozess ist, der den Nährstoffkomponenten in natürlichen Lebensmitteln nicht vollständig ähneln kann. Beschrieben wird hier ein effizientes und einfaches Protokoll zur Vorbereitung und Pflege axenischer Larven eines Blattkäfers (Plagiodera versicolora). Insbesondere wurden Oberflächen der Käfereier sterilisiert, woraufhin keimfreie Pappelblätter zur Aufzucht axenischer Larven verwendet wurden. Der axenische Status der Insekten wurde durch kulturabhängige und kulturunabhängige Assays weiter bestätigt. Durch die Kombination von Eierdesinfektion und keimfreier Kultivierung wurde gemeinsam eine effiziente und bequeme Methode entwickelt, um axenische P. versicolora zu erhalten, die ein leicht übertragbares Werkzeug für andere blattfressende Insekten darstellt.

Die Lebensstadien von P. versicolora sind in Abbildung 1 dargestellt. Das erwachsene Männchen ist kleiner als das erwachsene Weibchen (Abbildung 1A). Auf dem Feld gruppiert der Käfer seine Eier auf einem Blatt; Hier wurden vier Eier von einem Blatt gelöst (Abbildung 1B). Die Pappelstängelsegmente und Sämlinge, die für die axenische Insektenzucht verwendet werden, sind in Abbildung 2 dargestellt...

Um ein axenisches Insekt zu erhalten, wird seine Eioberfläche sterilisiert, und die geschlüpfte Larve wird anschließend mit axenischen Blättern aufgezogen. Diese Methode bietet eine effiziente Möglichkeit für die axenische Insektenvorbereitung, ohne Antibiotika zu verabreichen oder eine künstliche Diät zu entwickeln, die auch auf andere blattfressende Insekten angewendet werden kann.

Vorbereitung und Aufzucht axenischer Insekten mit gewebekultivierten Sämlingen für Wirt-Darm-Mikrobiota-Interaktionsstudien des Blattkäfers

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain ...

Die Darmbakterien können mehrere physiologische Prozesse von Insektenwirten beeinflussen. Die Vorbereitung und Pflege axenischer Larven ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Darmbakterienfunktionen. Die Hauptvorteile dieses Protokolls sind, dass Pflanzengewebekultur verwendet wird, um keimfreie Blätter zu erhalten, um axenische blätterfressende Insekten zu erhalten, die aus oberflächensterilisierten Eiern stammen, und dass diese Methode nicht durch künstliche Diäten eingeschränkt ist.Diese Methode ist bequem und erhöht die Sichtbarkeit der Aufrechterhaltung axenischer Insekten für zukünftige Darmbakterienstudien, insbesondere für Nicht-Modellinsekten ohne gut entwickelte künstliche Diäten. Halten Sie die P.versicolora-Population in einer Wachstumskammer bei 27 Grad Celsius und 70% relativer Luftfeuchtigkeit, mit einer 16-stündigen hellen und einer achtstündigen dunklen Photoperiode. Legen Sie die Insekten in perforierte Plastikboxen mit gekipptem, nass absorbierendem Papier und füttern Sie sie mit frischen Pappelzweigen.Sprühen Sie sauberes Wasser auf das absorbierende Papier, um die Feuchtigkeit zu erhalten, und wechseln Sie die Zweige alle zwei Tage. Isolieren Sie Erwachsene für die Eiablage nach der Verpuppung und füttern Sie sie mit zarten Blättern, um mehr Eier zu erhalten. Sammeln Sie innerhalb von 24 Stunden neu gelegte Eier und legen Sie sie 60 Stunden lang auf feuchtes, absorbierendes Papier, um axenische Larven vorzubereiten.Bereiten Sie MS-Medium in einem Milligramm pro Milliliter Alpha-Naphthalin-Essigsäure oder NAA-Stammlösungen vor. In einer Biosicherheitshaube 50 Mikroliter der NAA-Stammlösung zu 500 Milliliter MS-Medium geben und schütteln, um gut zu mischen. Gießen Sie dann ca. 50 Milliliter pro Gewebekulturbehälter und warten Sie auf die Erstarrung.Sterilisieren Sie Skalpelle und Pinzetten in einer Alkohollampenflamme in der Biosicherheitshaube. Schneiden Sie drei bis vier Zentimeter große Stielsegmente mit apikalen Knospen oder lateralen Knospen aus Pappelsämlingen nach etwa einem Monat Wachstum und fügen Sie sie in das Kulturmedium ein, ein oder zwei Stielsegmente pro Behälter. Inkubieren Sie diese Stammsegmente in einer Wachstumskammer für ca. 30 Tage.Und verwenden Sie diese keimfreien Blätter, um die axenischen Larven zu füttern. Autoklav Petrischale, Pinsel, Filterpapier, destilliertes Wasser in einer Petrischale mit LB-Agar-Medium. Blätter mit anhaftenden Eiern in eine Petrischale geben.Entfernen Sie dann vorsichtig die Eier mit einer Pinzette von den Blättern und geben Sie sie in eine andere Petrischale. Waschen Sie diese Eier acht Minuten lang mit 75% Ethanol. Dann wiederholen Sie die Wäsche viermal mit sterilem Wasser.Übertragen Sie die Eier auf LB-Agarmedium, um Feuchtigkeit für das Schlüpfen zu erhalten. Legen Sie die Petrischale in eine Wachstumskammer und warten Sie, bis die Eier innerhalb von 24 Stunden geschlüpft sind. Gießen Sie in einer Biosicherheitshaube drei Stücke nasses Filterpapier in eine Petrischale und legen Sie keimfreie Pappelblätter auf das Papier.Sammle die Larven und lege sie auf die Blätter. Verschließen Sie die Petrischale mit Parafilm und inkubieren Sie sie in einer Wachstumskammer. Wechseln Sie die Blätter alle zwei Tage.Für die konventionell aufgezogenen Gruppen die Eier von den Blättern in eine Petrischale mit feuchtem Filterpapier geben und diese Larven mit keimfreien Pappelblättern füttern. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip drei Larven im ersten, zweiten und dritten Stadium aus den keimfreien und konventionell aufgezogenen Gruppen aus. Sezieren Sie die Larven des dritten Stadiums mit sterilen Scheren und Pinzetten unter einem Stereomikroskop und sammeln Sie ihre Eingeweide in Mikrozentrifugenröhrchen.Sammeln Sie intakte Larven im ersten und zweiten Stadium in Röhren. Fügen Sie 100 Mikroliter PBS und drei Stahlkugeln zu den 1,5-Milliliter-Rohren hinzu und mahlen Sie die Gewebe mit einem Perlenschlag-Homogenisator zu Homogenaten. Fügen Sie 100 Mikroliter des Homogenats mit einem sterilen Glasstreustab zu LB-Agarmedium und -platte hinzu.Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Dann beobachten Sie die Bakterienkolonien. Extrahieren Sie die gesamte DNA der zuvor erhaltenen Gewebe mit einem DNA-Extraktionskit und messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer.Amplifizieren Sie das bakterielle 16S rRNA-Gen mit universellen 16S rRNA-Primern mit PCR und richten Sie die Reaktion wie im Textmanuskript beschrieben ein. Lagern Sie die PCR-Produkte bis zur weiteren Analyse bei vier Grad Celsius. Mischen Sie die PCR-Produkte mit Nukleinsäurefarbstoff und analysieren Sie sie mittels Elektrophorese auf einem 1% Agarosegel in 1X TAE-Puffer.Verwenden Sie 10 Mikroliter eines DNA-Markers als Referenz. Beobachten Sie das Gel mit einem UV-Transilluminator und suchen Sie nach dem Zielfragment um 1.500 Basenpaare. Obwohl in keiner keimfreien Gruppe Bakterienkolonien beobachtet wurden, wurden sie in allen konventionell aufgezogenen Gruppen beobachtet, was darauf hindeutet, dass Larven aus sterilisierten Eiern, die mit gewebekultivierten Pappelblättern gefüttert wurden, keine Bakterien enthielten.Die 1.500 Basispaar-PCR-Bänder erschienen in allen konventionell aufgezogenen Gruppen. Im Gegensatz dazu wurde in den keimfreien Gruppen oder der Negativkontrolle keine Bande beobachtet, was darauf hindeutet, dass in axenischen Larven keine Darmbakterien existierten. Für Insektenarten mit winzigen Eiern mussten die Arten von Desinfektionsmitteln und die Sterilisationsdauer optimiert werden.Darüber hinaus sollten Endophyten in gewebekultivierten Pflanzen bemerkenswert sein. Dieses Protokoll bietet eine neue Methode zur Erhaltung keimfreier Insekten, die ein praktisches Werkzeug ist, um Insekten-Darm-Bakterien-Interaktionsstudien zu erleichtern, insbesondere für Nicht-Modell-Insekten ohne gut entwickelte künstliche Diäten.

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Research

Forschung

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Vorbereitung und Aufzucht axenischer Insekten mit gewebekultivierten Sämlingen für Wirt-Darm-Mikrobiota-Interaktionsstudien des Blattkäfers (Video) | JoVE Journal

Vorbereitung und Aufzucht axenischer Insekten mit gewebekultivierten Sämlingen für Wirt-Darm-Mikrobiota-Interaktionsstudien des Blattkäfers

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