Induzierung einer Site Specific Replikation Verstopfungen in

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, eine Replikationsgabel an einem Nukleoprotein-Block zu stoppen und die DNA-Strukturen an der Blockierungsstelle zu untersuchen, um DNA-Reparaturwege zu erforschen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur DNA-Replikation und -Reparatur zu beantworten, beispielsweise, wie die DNA verarbeitet wird, wenn der Replikationsapparat der Zelle auf eine proteinbasierte Hindernis trifft. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass wir eine Replikationsgabel reversibel an einer definierten Position auf dem Chromosom in einer gesamten Population lebender Zellen anhalten können.

Die Durchführung dieses Verfahrens wird von den folgenden Mitgliedern meines Labors demonstriert: Dr. Karla Mettrick, der Doktorandin Georgia Weaver und Tayla-Ann Corocher. Für dieses Verfahren wird ein E. coli-Stamm verwendet, der ein Tetracyclin-Operator-Array im Plasmid pKM1 trägt. pKM1 kodiert für TetR-YFP, ein induzierbares, mit gelbem fluoreszierendem Protein markiertes Tetracyclin-Repressorprotein.

Verdünnen Sie eine frische Übernachtkultur dieses E.coli-Stamms auf eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,01 in einem verdünnten komplexen Medium mit Antibiotika, wie zur Selektion erforderlich. Kultivieren Sie die Zellkultur bei 30 Grad Celsius unter Schütteln bis zu einer optischen Dichte bei 600 Nanometern von 0,05 bis 0,1. Entnehmen Sie eine 10-Milliliter-Probe, die als nicht induzierte Kontrolle dient.

Fügen Sie 0,01 % Arabinose zur verbleibenden Kultur hinzu, um die Produktion von TetR-YFP aus pKM1 zu induzieren. Kultivieren Sie sowohl die nicht induzierte als auch die induzierte Kultur weiterhin bei 30 Grad Celsius unter Schütteln. Überprüfen Sie nach einer Stunde mittels Fluoreszenzmikroskopie das Vorhandensein eines einzelnen Fokalpunkts in jeder Zelle der induzierten Kultur.

Wenn die induzierten Zellen als blockiert bestätigt sind, was durch mehr als 70 % der Zellen mit einem einzelnen Fokus angezeigt wird, erfassen Sie die optische Dichte und entnehmen Sie 7,5 Milliliter der Probe zur Analyse mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese. Entnehmen Sie eine äquivalente Probe aus der nicht induzierten Kontrollkultur. Bereiten Sie vor der Fluoreszenzmikroskopie die Agarose-Pads zur Verhinderung der Zellbewegung während der Visualisierung vor.

Für jede Agarose-Platte pipettieren Sie 500 Mikroliter geschmolzene Agarose auf einen Objektträger und legen sofort das Deckglas auf, bevor die Agarose erstarrt. Bewahren Sie die Objektträger zwischen feuchten Tüchern bei vier Grad Celsius auf, bis sie benötigt werden. Wenn es Zeit ist, die Zellen zu überprüfen, entfernen Sie das Deckglas von der Agarose-Platte und pipettieren Sie 10 Mikroliter Bakterienkultur in die Mitte der Platte.

Nach ungefähr fünf Minuten, wenn das Agarose-Pad getrocknet ist, setzen Sie das Deckglas wieder ein. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das Deckglas und platzieren Sie die Probe unter der Optik. Betrachten Sie die Zellen mittels Phasenkontrstmikroskopie bei 100facher Vergrößerung.

Stellen Sie im Dialogfeld „Acquire“ der Bildgebungssoftware die Belichtungszeit auf 100 Millisekunden ein. Wählen Sie „Acquire“, um das Bild aufzunehmen. Bewegen Sie nicht die Bühne.

Wählen Sie im Dialogfeld „Acquired“ YFP als Beleuchtung für den externen Verschluss, der mit der Kamera verbunden ist, aus. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 1.000 Millisekunden ein. Schalten Sie das Objektbeleuchtung aus und wählen Sie „Acquire“, um das Fluoreszenzbild aufzunehmen.

Um dieses Verfahren zu beginnen, fügen Sie Natriumazid zu zuvor gesammelten Kulturproben hinzu, sodass eine Endkonzentration von 0,1 % erreicht wird, und inkubieren Sie die Proben mindestens fünf Minuten auf Eis. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 5.000 × g für zehn Minuten. Entsorgen Sie den Überstand.

Suspendieren Sie jedes Zellpellet in 200 Mikroliter PIV-Puffer und überführen Sie die Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie kurz im Mikrozentrifugator, um die Zellen zu pelletieren, und entsorgen Sie den Überstand. Behandeln Sie eine Objektträgerplatte mit 40 Mikroliter einer geeigneten wasserabweisenden Glas- oder Silikonlösung.

Reiben Sie den Objektträger mit einem Tuch, bis er trocken ist. Resuspendieren Sie die Zellen mit der niedrigsten Zelldichte in 50 Mikrolitern PIV und stellen Sie sie bei 50 Grad Celsius in einen Heizblock. Für alle anderen Proben passen Sie die Volumina von PIV so an, dass die endgültige Zelldichte in jedem Reaktionsgefäß gleich ist.

Geben Sie ein gleiches Volumen einer frisch hergestellten 0,8 %igen Agarose-Lösung in PIV zu den Proben hinzu. Halten Sie die Proben im Wärmeprotokoll, um sicherzustellen, dass sie über 50 Grad Celsius bleiben, um eine Verfestigung zu verhindern. Geben Sie 20-Mikroliter-Tropfen der Zell-Agarose-Suspension auf den behandelten Objektträger, um halbkugelförmige Plugs zu erzeugen.

Wenn die Plugs erstarrt sind, schieben Sie vorsichtig alle Plugs einer Probe in ein einzelnes Mikrozentrifugenröhrchen und geben Sie ein Milliliter Zelllysepuffer hinzu. Inkubieren Sie zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Nach zwei Stunden entfernen Sie den Zelllysepuffer und geben ein Milliliter EDTA-Sarkosyl-Proteinase-K-Lösung oder ESP-Lösung hinzu.

Übernacht bei 50 Grad Celsius inkubieren oder bis die Plugs durchsichtig sind. Sobald die Plugs durchsichtig sind, den ESP-Puffer entfernen und die Plugs in ein 15-Milliliter-Gefäß überführen. 12 Milliliter TE-Puffer hinzufügen und 30 Minuten stehen lassen.

Die Plugs insgesamt fünfmal mit TE-Puffer waschen. Die Plugs bei vier Grad Celsius in einem Milliliter TE-Puffer lagern. Zur Analyse der Replikationsintermediate wird die DNA in den Agarose-Plugs mit einem geeigneten Restriktionsenzym für den Bereich von Interesse digeriert.

In diesem Beispiel schneidet EcoRV die DNA unmittelbar vor der Anordnung, innerhalb der Anordnung und hinter der Anordnung, wodurch im Bereich des Interesses Fragmente von 5,5 kb und 6,7 kb entstehen. Um dieses Verfahren zu beginnen, überführen Sie einen Agarose-Plug in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen und geben 150 Mikroliter Restriktionspuffer hinzu. Fügen Sie 25 bis 100 Einheiten Restriktionsenzym hinzu und inkubieren Sie acht Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Stellen Sie ein 0,4 %iges Agarosegel bei vier Grad Celsius her. Gießen Sie 300 Milliliter geschmolzene Agarose in ein Gelltray mit einer Größe von etwa 25 mal 25 Zentimetern. Setzen Sie einen Kamm ein, um die Vertiefungen etwa so breit wie der Durchmesser des Plugs zu gestalten.

Wenn das Gel erstarrt ist, entfernen Sie den Kamm und bringen Sie das Gel auf Raumtemperatur. Mit einer Inokulationsnadel schieben Sie eine der digerierten Agarose-Plugs in eine Vertiefung, wobei die flache Seite des Plugs an der Seite der Vertiefung platziert wird, wo die DNA in das Gel eintreten wird. Fügen Sie auf die gleiche Weise in jede zweite Vertiefung jeweils einen einzelnen Plug ein.

Pipettieren Sie geschmolzenes 0,4 %iges Agarose in die Vertiefungen, um die Plugs an ihrem Platz zu fixieren. Geben Sie eine 1-kb-DNA-Leiter in eine leere Vertiefung, wobei zwischen der Leiter und den Proben ein Abstand freigelassen wird. Führen Sie das Gel über Nacht bei Raumtemperatur in 1x TBE aus.

Am folgenden Tag färben Sie das Gel in einem Wasserbad, das 0,3 Mikrogramm pro Milliliter Ethidiumbromid enthält, für 20 Minuten. Sichtbaren Sie die DNA mit einem Transilluminator für langwelliges UV-Licht und schneiden Sie jeden Gellappen mit einem geraden, gleichmäßigen Schnitt aus, wobei die Einbeziehung von überschüssigem Agarose auf beiden Seiten der Spur minimiert wird. Legen Sie den ausgeschnittenen Gellappen in eine Gelwanne im 90-Grad-Winkel zur Richtung der DNA-Wanderung.

Der nächste Schritt besteht darin, 300 Milliliter Agarose für das Gel der zweiten Dimension vorzubereiten. Wenn die Agarose auf 50 Grad Celsius abgekühlt ist, pipettieren Sie die geschmolzene Agarose um die Gelschnitte herum, um deren Position zu fixieren. Gießen Sie die restliche Agarose in die Schale, bis sie mindestens auf gleicher Höhe mit den Gelschnitten steht.

Nachdem das Gel erstarrt ist, wird es in 1xTBE unter Zusatz von 0,3 Mikrogramm pro Milliliter Ethidiumbromid bei vier Grad Celsius elektrophoretisch laufen gelassen, bis sich die DNA etwa 10 Zentimeter bewegt hat. Die Bereiche, in denen die genomische DNA vorhanden ist, zusammen mit dem darüberliegenden Gel, werden ausgeschnitten, um auch die nicht sichtbare DNA einzuschließen. Die DNA im Gel wird anschließend mittels Southern-Hybridisierung sichtbar gemacht, wie im textbasierten Protokoll beschrieben.

In diesem System wurde ein Replikationsblock durch eine Mehrheit von Zellen bestätigt, die einen Fokus enthielten, der einer Kopie des Arrays innerhalb der Zelle entsprach. Die Zugabe von Anhydrotetracyclin hob den Block auf, und die anschließende Verdopplung des Arrays wurde als Anreicherung von Zellen mit mehreren Foci sichtbar. Zellen mit blockierter Replikation zeigten ebenfalls ein Wachstumshemmung, das durch anschließendes Wachstum in Gegenwart von Anhydrotetracyclin rückgängig gemacht wurde.

Um die Replikationsintermediate zu analysieren, wurde die DNA in der ersten Dimension elektrophoretisch aufgetrennt. Die gewünschte DNA wurde anschließend ausgeschnitten, und eine Elektrophorese in der zweiten Dimension ergab eine Diagonale aus linearer DNA. Die Southern-Hybridisierung der Array-DNA zeigte zwei Signale in der unblockierten Probe, die den erwarteten Fragmenten von 5,5 kb und 6,7 kb des Arrays entsprachen.

Die blockierte Probe zeigte eine Abnahme des 5,5 kb-Flecks und das Hinzukommen eines elliptischen Signals, das eine Anreicherung von Y-förmiger DNA anzeigt. Die Zugabe von Anhydrotetracyclin beseitigte das Signal der Y-förmigen DNA. Ein weiteres häufiges Zwischenprodukt ist der Holliday-Knoten, der als kegelförmiges Signal an der Spitze des Y-Bogens und als Spitze vom linearen DNA-Anteil am Ende des Y-Bogens sichtbar ist.

Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von acht Tagen durchgeführt werden. Obwohl es sich um ein zweidimensionales Verfahren handelt, ist es wichtig, sich bewusst zu machen, dass die Qualität der DNA-Plugs entscheidend für die optimale Visualisierung der DNA-Strukturen ist.