Induzierung einer Site Specific Replikation Verstopfungen in E. coli Ein fluoreszierendes Repressor Operator System verwenden

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, eine Replikationsgabel an einem Nukleoproteinblock zu blockieren und die DNA-Strukturen an der Stelle des Blocks zu beobachten, um DNA-Reparaturwege zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zur DNA-Replikation und -Reparatur zu beantworten, z. B. wie die DNA verarbeitet wird, wenn der Replikationsapparat der Zelle auf eine Proteinblockade stößt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir eine Replikationsgabel an einer bestimmten Stelle auf dem Chromosom über eine ganze Population lebender Zellen hinweg reversibel blockieren können.

Dieses Verfahren wird von den folgenden Mitgliedern meines Labors, Dr. Karla Mettrick, und der Doktorandin, Georgia Weaver und Tayla-Ann Corocher, demonstriert. Für dieses Verfahren wird ein E.coli-Stamm verwendet, der ein Tetracyclin-Operator-Array im pKM1-Plasmid trägt. pKM1 kodiert für TetR-YFP, ein induzierbares, gelb fluoreszierendes Protein-markiertes Tetracyclin-Repressorprotein.

Eine frische Übernachtkultur dieses E.coli-Stammes wird auf eine optische Dichte von 0,01 Nanometern bei 600 Nanometern in einem verdünnten Komplexmedium mit Antibiotika verdünnt, wie für die Selektion erforderlich. Züchten Sie die Kultur bei 30 Grad Celsius unter Schütteln auf eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,05 bis 0,1. Entnehmen Sie eine 10-Milliliter-Probe, die als nicht induzierte Kontrolle dient.

Fügen Sie der verbleibenden Kultur 0,01 % Arabinose hinzu, um die Produktion von TetR-YFP aus pKM1 zu induzieren. Züchten Sie sowohl die nicht induzierten als auch die induzierten Kulturen bei 30 Grad Celsius unter Schütteln. Überprüfen Sie nach einer Stunde mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie, ob in jeder Zelle der induzierten Kultur ein einzelner Brennpunkt vorhanden ist.

Wenn die induzierten Zellen als blockiert bestätigt werden, was durch mehr als 70 % der Zellen mit einem einzigen Fokus angezeigt wird, ist die optische Dichte aufzuzeichnen und 7,5 Milliliter der Probe für die Analyse durch zweidimensionale Gelelektrophorese zu entnehmen. Entnehmen Sie eine gleichwertige Probe aus der nicht induzierten Kontrollkultur. Bereiten Sie vor der Fluoreszenzmikroskopie die Agarose-Pads vor, um eine Bewegung der Zellen während der Visualisierung zu verhindern.

Pipettieren Sie für jedes Agarose-Pad 500 Mikroliter geschmolzene Agarose auf einen Objektträger und überlagern Sie das Deckglas unmittelbar vor dem Erstarren der Agarose. Lagern Sie die Objektträger zwischen feuchten Taschentüchern bei vier Grad Celsius, bis sie benötigt werden. Wenn es an der Zeit ist, die Zellen zu überprüfen, entfernen Sie das Deckglas vom Agarose-Pad und pipettieren Sie 10 Mikroliter Bakterienkultur in die Mitte des Pads.

Nach etwa fünf Minuten, wenn das Agarose-Pad getrocknet ist, setzen Sie das Deckglas wieder auf. Geben Sie einen Tropfen Tauchöl auf das Deckglas und platzieren Sie den Objektträger unter der Optik. Visualisieren Sie die Zellen mit Hilfe der Phasenmikroskopie bei 100-facher Vergrößerung.

Stellen Sie im Dialogfeld "Erfassen" in der Imaging-Software die Belichtungszeit auf 100 Millisekunden ein. Wählen Sie Erfassen, um das Bild aufzunehmen. Bewegen Sie die Bühne nicht.

Wählen Sie im Dialogfeld "Erfasst" die Option "YFP" als Beleuchtung für den externen Verschluss aus, der mit der Kamera verknüpft ist. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 1.000 Millisekunden ein. Schalten Sie das Bühnenlicht aus und wählen Sie Erfassen, um das Fluoreszenzbild aufzunehmen.

Um dieses Verfahren zu beginnen, fügen Sie zuvor entnommenen Kulturproben Natriumazid bis zu einer Endkonzentration von 0,1 % hinzu und inkubieren Sie mindestens fünf Minuten lang auf Eis. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 5.000 g für zehn Minuten. Entsorgen Sie den Überstand.

Jedes Zellpellet wird in 200 Mikrolitern PIV-Puffer resuspendiert und die Zellen in ein Mikrofuge-Röhrchen überführt. Mikrozentrifuge zum Pelletieren der Zellen und Entsorgen des Überstands. Behandeln Sie einen Objektträger mit 40 Mikrolitern einer geeigneten wasserabweisenden Glas- oder Silikonlösung.

Reiben Sie den Objektträger mit einem Taschentuch ab, bis er trocken ist. Die Zellen mit der geringsten Zelldichte in 50 Mikrolitern PIV resuspendieren und bei 50 Grad Celsius in einen Wärmeblock legen. Passen Sie bei allen anderen Proben das PIV-Volumen so an, dass die endgültige Zelldichte in jedem Röhrchen gleich ist.

Geben Sie den Proben das gleiche Volumen frisch zubereiteter 0,8%iger Agaroselösung in PIV. Bewahren Sie die Proben im Wärmeblock auf, um sicherzustellen, dass sie über 50 Grad Celsius liegen, um eine Verfestigung zu verhindern. Geben Sie 20 Mikroliter der Zell-Agarose-Suspension auf den behandelten Objektträger, um halbkugelförmige Pfropfen herzustellen.

Wenn die Stopfen fest geworden sind, schieben Sie vorsichtig alle Stopfen einer Probe in ein einzelnes Mikrofurge-Röhrchen und fügen Sie einen Milliliter Zelllysepuffer hinzu. Inkubieren Sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie nach zwei Stunden den Zelllysepuffer und fügen Sie 1 Milliliter EDTA-Sarkosyl-Proteinase K oder ESP-Lösung hinzu.

Inkubieren Sie bei 50 Grad Celsius über Nacht oder bis die Pfropfen transparent sind. Sobald die Stopfen transparent sind, entfernen Sie den ESP-Puffer und übertragen Sie die Stopfen auf ein 15-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie 12 Milliliter TE-Puffer hinzu und lassen Sie es 30 Minuten stehen.

Waschen Sie die Stopfen insgesamt fünfmal mit TE-Puffer. Lagern Sie die Stecker bei vier Grad Celsius in einem Milliliter TE-Puffer. Um die Replikationszwischenprodukte zu analysieren, wird die DNA in den Agarose-Pfropfen mit einem für die interessierende Region geeigneten Restriktionsenzym verdaut.

In diesem Beispiel schneidet EcoRV die DNA unmittelbar vor dem Array, innerhalb des Arrays und nach dem Array, um 5,5 kb und 6,7 kb Fragmente im interessierenden Bereich zu erhalten. Um dieses Verfahren zu starten, übertragen Sie einen Agarose-Plug in ein frisches Mikrofugenröhrchen und fügen Sie 150 Mikroliter Restriktionsenzympuffer hinzu. Fügen Sie 25 bis 100 Einheiten des Restriktionsenzyms hinzu und verdauen Sie es sechs bis acht Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Bereiten Sie ein 0,4%iges Agarose-Gel bei vier Grad Celsius vor. Gießen Sie 300 Milliliter geschmolzene Agarose in eine Gelschale von etwa 25 x 25 Zentimetern. Führen Sie einen Kamm ein, um die Vertiefungen ungefähr so breit wie den Durchmesser des Stopfens zu machen.

Wenn das Gel fest ist, entfernen Sie den Kamm und bringen Sie das Gel auf Raumtemperatur. Schieben Sie mit einer Impfschlaufe einen der verdauten Agarose-Pfropfen in eine Vertiefung und positionieren Sie die flache Seite des Pfropfens gegen die Seite der Vertiefung, an der die DNA in das Gel eindringen wird. Stecken Sie einen einzelnen Stopfen auf die gleiche Weise in jede zweite Vertiefung.

Pipettieren Sie geschmolzene 0,4 % Agarose in die Vertiefungen, um die Stopfen in Position zu verschließen. Laden Sie eine DNA-Leiter von einem KB in ein leeres Well, wobei Sie einen Spalt zwischen der Leiter und den Proben lassen. Lassen Sie das Gel über Nacht in 1xTBE bei Raumtemperatur laufen.

Am nächsten Tag färben Sie das Gel in einem Wasserbad mit 0,3 Mikrogramm pro Milliliter Ethidiumbromid für 20 Minuten. Visualisieren Sie die DNA mit einem langwelligen UV-Transilluminator und schneiden Sie jedes Spurfragment mit einem geraden, gleichmäßigen Schnitt aus, um den Einschluss von überschüssiger Agarose auf beiden Seiten der Spur zu minimieren. Legen Sie die herausgeschnittene Gelbahn in einem Winkel von 90 Grad zur Richtung der DNA-Migration in eine Gelschale.

Der nächste Schritt besteht darin, 300 Milliliter Agarose für das Gel der zweiten Dimension vorzubereiten. Wenn die Agarose auf 50 Grad Celsius abgekühlt ist, pipettieren Sie die geschmolzene Agarose um die Gelscheiben, um ihre Position zu verfestigen. Gießen Sie die restliche Agarose in die Schale bis zu einer Tiefe, die mindestens auf Höhe der Gelscheiben ist.

Sobald das Gel verfestigt ist, elektrophoresieren Sie es in 1xTBE mit 0,3 Mikrogramm pro Milliliter Ethidiumbromid bei vier Grad Celsius, bis die DNA etwa 10 Zentimeter gewandert ist. Die Blöcke, in denen die genomische DNA vorhanden ist, einschließlich des darüber liegenden Gels, werden herausgeschnitten, um die nicht sichtbare DNA einzuschließen. Die DNA im Gel wird anschließend durch Southern-Hybridisierung, wie im Textprotokoll beschrieben, sichtbar gemacht.

In diesem System wurde ein Replikationsblock durch eine Mehrheit der Zellen bestätigt, die einen Fokus enthielten, der einer Kopie des Arrays innerhalb der Zelle entsprach. Die Zugabe von Anhydrotetracyclin kehrte die Blockade um und die anschließende Duplikation des Arrays wurde als Akkumulation von Zellen mit mehreren Herden visualisiert. Zellen mit blockierter Replikation zeigten auch eine Wachstumshemmung, die durch nachfolgendes Wachstum in Gegenwart von Anhydrotetracyclin rückgängig gemacht wurde.

Um die Replikationszwischenprodukte zu analysieren, wurde die DNA in der ersten Dimension elektrophoresiert. Die interessierende DNA wurde dann herausgeschnitten und eine Elektrophorese der zweiten Dimension ergab eine Diagonale der linearen DNA. Die südliche Hybridisierung der Array-DNA ergab zwei Flecken in der nicht blockierten Probe, die den erwarteten 5,5 kb und 6,7 kb Fragmenten des Arrays entsprachen.

Die blockierte Probe zeigte eine Abnahme des 5,5 kb Spots und die Hinzufügung eines elliptischen Signals, was auf eine Akkumulation von Y-förmiger DNA hinweist. Die Zugabe von Anhydrotetracyclin eliminierte das Y-förmige DNA-Signal. Ein weiteres häufiges Zwischenprodukt ist der Holliday-Übergang, der als Kegelsignal am oberen Ende des Y-Bogens und als Spike aus der linearen DNA am Ende des Y-Bogens visualisiert wird.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in acht Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig vorgeformt ist. Bei einem 2D-Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Qualität der DNA-Plugs für die optimale Visualisierung der DNA-Strukturen entscheidend ist.