Name: Wiederverwendbare Einzelzelle für iterative epigenomische Analysen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Lernen Sie eine innovative Methode zur iterativen epigenomischen Analyse wiederverwendbarer Einzelzellen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung mehrerer epigenetischer Markierungen in derselben Zelle und unterstützt die Entwicklung gezielter epigenetischer Therapien.

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Wir danken Dr. David Sanchez-Martin und Dr. Christopher B. Buck für ihre Kommentare während der Konzeptphase des Projekts. Wir danken auch dem Genomics Core, dem Center for Cancer Research, dem National Cancer Institute, den National Institutes of Health für die Hilfe bei vorläufigen Experimenten und der Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH für die Beratung bei der computergestützten Analyse. Wir danken Frau Anna Word für ihre Hilfe bei der Optimierung der in der Methode verwendeten DNA-Polymerasen. Diese Arbeit nutzte die Rechenressourcen des NIHHPC-Biowulf-Clusters (http://hpc.nih.gov). Dieses Projekt wird durch das Intramurale Programm des Center for Cancer Research, des National Cancer Institute, der National Institutes of Health, des NCI Director's Innovation Award (#397172) und Bundesmittel des National Cancer Institute unter der Vertragsnummer HHSN261200800001E unterstützt. Wir danken Dr. Tom Misteli, Dr. Carol Thiele, Dr. Douglas R. Lowy und allen Mitgliedern des Laboratory of Cellular Oncology für ihre produktiven Kommentare.

<ol><li>Perkel, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+enters+the+multiomics+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis enters the multiomics age.</a> Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).</li>
<li>Clark, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scNMT-seq+enables+joint+profiling+of+chromatin+accessibility+DNA+methylation+and+transcription+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 781(2018).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+potential+identified+by+shared+single-cell+profiling+of+RNA+and+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin.</a> Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra+high-throughput+method+for+single-cell+joint+analysis+of+open+chromatin+and+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+profiling+of+histone+modifications+and+transcriptome+in+single+cells+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain.</a> Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).</li>
<li>Mimitou, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable%2C+multimodal+profiling+of+chromatin+accessibility%2C+gene+expression+and+protein+levels+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells.</a> Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).</li>
<li>Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+epigenomic+analyses+in+the+same+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Iterative epigenomic analyses in the same single cell.</a> Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).</li>
<li>Tosato, G., Ohnuki, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTosato%2C+G+%22Methods+of+preparing+a+re-usable+single+cell+and+methods+fro+analyzing+the+epigenome%2C+transcriptome%2C+and+genome+of+a+single+cell%22">Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell</a>. , EP 3619307, US 202001026704 (2021).</li>
<li>Harada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromatin+integration+labelling+method+enables+epigenomic+profiling+with+lower+input%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input.</a> Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Marina, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET-catalyzed+oxidation+of+intragenic+5-methylcytosine+regulates+CTCF-dependent+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing.</a> EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).</li>
<li>Weast, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeast%2C+RC+%22Handbook+of+chemistry+and+physics%3A+a+ready-reference+book+of+chemical+and+physical+data.+56th+edn%22">Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn</a>. Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H. , Chemical Rubber Company Press. (1975).</li>
<li>Aydin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+history%2C+principles%2C+and+types+of+ELISA%2C+and+our+laboratory+experience+with+peptide%2Fprotein+analyses+using+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA.</a> Peptides. 72, 4-15 (2015).</li>
<li>Gan, S. D., Patel, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassay+and+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12(2013).</li>
<li>Porstmann, T., Kiessig, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassay+techniques.+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassay techniques. An overview.</a> Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).</li>
<li>Chao, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+RNA-Seq+preparation+protocol+performance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance.</a> BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).</li>
<li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+library+prep+approaches+for+sequencing+low+input+translatome+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples.</a> BMC Genomics. 19 (1), 696(2018).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Ku, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+immunocleavage+sequencing+%28scChIC-seq%29+to+profile+histone+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification.</a> Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).</li>
<li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+%28ACT-seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).</li>
<li>Maskell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+retroviral+integration+into+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for retroviral integration into nucleosomes.</a> Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).</li>
</ol>

Dr. Ohnuki und Dr. Tosato sind Miterfinder eines Patents mit dem Titel "Verfahren zur Herstellung einer wiederverwendbaren Einzelzelle und Verfahren zur Analyse des Epigenoms, Transkriptoms und Genoms einer einzelnen Zelle" (EP3619307 und US20200102604). Die Patentanmeldung wurde zum Teil auf der Grundlage vorläufiger Ergebnisse im Zusammenhang mit der im vorliegenden Manuskript beschriebenen Technologie eingereicht. Die Erfindung oder Erfindungen, die in dieser Patentanmeldung beschrieben und beansprucht werden, wurden gemacht, während die Erfinder Vollzeitangestellte der US-Regierung waren. Daher wurden gemäß 45 Code of Federal Regulations Part 7 alle Rechte, Titel und Interessen an dieser Patentanmeldung per Gesetz an die US-Regierung abgetreten oder sollten gesetzlich übertragen werden. Die US-Regierung überträgt einen Teil der Lizenzgebühren, die sie erhält, gemäß 15 U.S. Code § 3710c an ihre angestellten Erfinder.

Dieser Artikel beschreibt das Schritt-für-Schritt-Protokoll für die kürzlich berichtete multiepigenomische Einzelzellanalyse mit wiederverwendbaren Einzelzellen7. In den folgenden Abschnitten diskutieren wir kritische Punkte und betonen mögliche Einschränkungen des Protokolls. 
Einer der kritischen Punkte im gesamten Protokoll (aus den Schritten 7.2-13) ist die Vermeidung einer DNase-Kontamination. Eine einzelne Zelle hat nur zwei Kopien der genomischen DNA. Daher verri...

Die Single-Cell-Technologie tritt in die Ära der Single-Cell-Multiomics ein, bei der einzelne Single-Cell-Omics-Technologien integriertwerden 1. In jüngster Zeit wurde die Einzelzell-Transkriptomik mit Methoden zum Nachweis der Chromatinzugänglichkeit (scNMT-seq2 und SHARE-seq3) oder Histonmodifikationen (Paired-seq4 und Paired-Tag5) kombiniert. In jüngerer Zeit wurden Einzelzell-Transkriptomik und Proteomik in die Chromatin-Zugänglichkeit integriert (DOGMA-seq6). Diese Methoden verwenden Transposase-basiertes Tagging, um die Zugänglichkeit von Chromatin oder Histonmodifikationen zu erkennen.
Transposase-basierte Ansätze spalten genomische DNA und fügen am Ende des genomischen DNA-Fragments einen DNA-Barcode hinzu. Jedes gespaltene genomische Fragment kann nur bis zu zwei DNA-Barcodes (= eine epigenetische Markierung pro Spaltstelle) aufnehmen, und die genomische DNA an der Spaltstelle geht verloren. Daher haben spaltungsbasierte Ansätze einen Kompromiss zwischen der Anzahl der getesteten epigenetischen Markierungen und der Signaldichte. Dies erschwert die Analyse mehrerer epigenetischer Markierungen in derselben Zelle. Um dieses Problem zu lösen, wurde eine einzelzellige epigenomische Methode entwickelt, bei der die genomische DNA nicht gespalten wird 7,8.
Zusätzlich zu dem oben erwähnten Problem der Spaltung weisen Transposase-basierte Ansätze weitere Einschränkungen auf. Bei der Einzelzell-Epigenomanalyse ist es von entscheidender Bedeutung, die Position von Histonen und DNA-assoziierten Proteinen im Genom zu kennen. In aktuellen Ansätzen wird dies durch die Verwendung unfixierter Einzelzellen und die Beibehaltung von Protein-DNA- und Protein-Protein-Interaktionen erreicht. Dies führt jedoch zu einer starken Verzerrung zugänglicher Chromatinregionen, selbst bei der Analyse von Histonmodifikationen 9. Die Lage von Histonen und genomassoziierten Proteinen auf dem Genom kann ohne Vernetzung von Protein-DNA und Protein-Protein unter Verwendung eines Polyacrylamid-Gerüsts erhalten werden 7,8. Dieser Ansatz reduziert die strukturelle Verzerrung, die bei aktuellen Ansätzen beobachtet wird, die von Protein-DNA- und Protein-Protein-Interaktionen abhängen.
Transposase-basierte Ansätze können Signale nur einmal von einer einzelnen Zelle erfassen. Daher ist es aufgrund des Abfalls der Signale schwierig, das gesamte Epigenom einer einzelnen Zelle abzugrenzen. Wiederverwendbare Einzelzellen wurden entwickelt, um die derzeitigen Einschränkungen zu überwinden, indem sie eine iterative epigenomische Analyse in derselben Einzelzelle ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>10x CutSmart Puffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B6004</td><td>10x Aufschlusspuffer</td></tr><tr><td>200 proof Ethanol</td><td>Warner-Graham Company</td><td>200 proof</td><td>Ethanol</td></tr><tr><td>5-Hydroxymethylcytosin (5-hmC) monoklonaler Antikörper [HMC/4D9]</td><td>Epigentek</td><td>A-1018-100</td><td>Anti-5hmC</td></tr><tr><td>Acridin Orange/Propidium Iodid Stain</td><td>Logos Biosystems</td><td>F23001</td><td>Zellzähler</td></tr><tr><td>Acrylamidlösung, 40 % in H2O, für die Molekularbiologie</td><td>MilliporeSigma</td><td>01697-500ML</td><td>40 % Acrylamidlösung</td></tr><tr><td>All-in-One-Fluoreszenzmikroskop BZ-X710</td><td>Keyence</td><td>BZ-X710</td><td>Rastermikroskop</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0,5 Zentrifugalfiltereinheit</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC510024</td><td>Ultrafiltrationskassette</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat für die Molekularbiologie</td><td>MilliporeSigma</td><td>A3678-100G</td><td>Ammoniumpersulfatpulver</td></tr><tr><td>Wasserfreies DMF</td><td>Vektorlaboratorien</td><td>S-4001-005</td><td>Wasserfreies N,N-Dimethylformamid (DMF)</td></tr><tr><td>Anti-RNA-Polymerase II CTD repeat YSPTSPS (Phospho S5) Antikörper [4H8]</td><td>Abcam</td><td>ab5408</td><td>Anti-Pol II</td></tr><tr><td>Anti-TRAP220/MED1 (Phospho T1457) Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab60950</td><td>Anti-Med1</td></tr><tr><td>BciVI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0596L</td><td>BciVI</td></tr><tr><td>Rinderserumalbuminlösung, 20 mg/ml in H2O, geringe Keimbelastung, proteasefrei, für die Molekularbiologie</td><td>MilliporeSigma</td><td>B8667-5ML</td><td>20% BSA (Tabelle 7)</td></tr><tr><td>Bst DNA-Polymerase, großes Fragment</td><td>New England BioLabs</td><td>M0275L</td><td>Bst DNA-Polymerase</td></tr><tr><td>BT10 Serie 10 &micro; l Barrierespitze</td><td>NEPTUNE</td><td>BT10</td><td>P10 Low-Retention-Spitze</td></tr><tr><td>CellCelector</td><td>Automated Lab</td><td>Solutions N/A</td><td>Automatisierter Einzelzell-Picking-Roboter</td></tr><tr><td>CellCelector 4 nl Nanowell-Platten für die Klonierung von Einzelzellen, Platte S200-100 100K, 24 Well, ULA</td><td>Automated Lab Solutions</td><td>CC0079</td><td>4 nL Nanowell-Platte</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>Chloroform</td></tr><tr><td>Corning Costar 96-Well, Zellkultur-behandelte Mikroplatte mit flachem Boden</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>96-Well-Platten mit flachem Boden</td></tr><tr><td>Deep Vent (Exo-) DNA-Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0259L</td><td>Exo- DNA-Polymerase</td></tr><tr><td>DNA LoBind-Röhrchen, 0,5</td><td>mL Eppendorf</td><td>30108035</td><td>0,5 mL DNA-Röhrchen mit geringer Bindung DNA-Oligo</td></tr><tr><td>, 1. zufälliger Primer</td><td>Integrated DNA</td><td>Technologies N/ A, siehe Tabelle 3</td><td>1. Zufallsprimer</td></tr><tr><td>DNA-Oligo, 2. Zufallsprimer Zelle#01</td><td>Integrated DNA</td><td>Technologies N/A, siehe Tabelle 3 2</td><td>. Zufallsprimer</td></tr><tr><td>DNA-Oligo, 2. Zufallsprimer Zelle#02</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td>N/A, siehe Tabelle 3</td><td>2. Zufallsprimer</td></tr><tr><td>DNA-Oligo, 2. Zufallsprimer Zell#03</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td>N/A, siehe Tabelle 3</td><td>2. Zufallsprimer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2. zufälliger Primer Cell#04</td><td>Integrated DNA</td><td>Technologies N/A, siehe Tabelle 3</td><td>2. zufälliger Primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2. zufälliger Primer Cell#05</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, siehe Tabelle 3</td><td>2. zufälliger Primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2. zufälliger Primer Cell#06</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, siehe Tabelle 3</td><td>2. zufälliger Primer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, 2. Zufallsprimer Zelle#07</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, siehe Tabelle 3</td><td>2. Zufallsprimer</td></tr><tr><td>DNA-Oligo, 2. Zufallsprimer Zelle#08</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td>N/A, siehe Tabelle 3</td><td>2. Zufallsprimer</td></tr><tr><td>DNA-Oligo, 2. Zufallsprimer Zell#09</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td>N/A, siehe Tabelle 3</td><td>2. Zufallsprimer</td></tr><tr><td>DNA-Oligo, 2. Zufallsprimer Zelle#10</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td>N/A, siehe Tabelle 3</td><td>2. Zufallsprimer</td></tr><tr><td>DNA-Oligo, 2. Zufallsprimer Cell#11</td><td>Integrated DNA</td><td>Technologies N/A, siehe Tabelle 3</td><td>2. Zufallsprimer</td></tr><tr><td>DNA-Oligo, 2. Zufallsprimer Cell#12</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, siehe Tabelle 3</td><td>2. Zufallsprimer</td></tr><tr><td>DNA-Oligo, 2. Syntheseprimer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, siehe Tabelle 3</td> 2<td>. Syntheseprimer</td></tr><tr><td>DNA Oligo, Ligation Adaptor</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, siehe Tabelle 3</td><td>Ligation Adaptor</td></tr><tr><td>DNA Oligo, Reverse Transkription Primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, siehe Tabelle 3</td><td>Reverse Transkription Primer</td></tr><tr><td>DNase I (RNase-frei)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0303L</td><td>DNase I (RNase-frei, 4 U).</td></tr><tr><td>DNase I Reaktionspuffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B0303S</td><td>10x DNase I Puffer (NEB)</td></tr><tr><td>dNTP Mix (je 10 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0192</td><td>10 mM dNTPs</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, USA-Herkunft, Hitzeinaktiviertes</td><td>MilliporeSigma</td><td>F4135-500ML</td><td>Fötales Rinderserum</td></tr><tr><td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesekit</td><td>New England BioLabs</td><td>E2040S</td><td>In-vitro-Transkriptions-Mastermix</td></tr><tr><td>Histon H3K27ac Antikörper</td><td>Aktives Motiv</td><td>39133</td><td>Anti-H3K27ac</td></tr><tr><td>Histon H3K27me3 Antikörper</td><td>Aktives Motiv</td><td>39155</td><td>Anti-H3K27me3</td></tr><tr><td>IgG aus Kaninchenserum</td><td>Millipore Sigma</td><td>I5006-10MG</td><td>Control IgG</td></tr><tr><td>Eisenoxid(II,III)-magnetisches Nanopulver, 30 nm durchschnittliche Teilegröße (TEM), NHS-Ester funktionalisiert</td><td>MilliporeSigma</td><td>747467-1G</td><td>NHS-Ester funktionalisiertes 30 nm Eisenoxidpulver</td></tr><tr><td>K-562</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>CCL-243</td><td>Zellen</td></tr><tr><td>Lineares Acrylamid (5 mg/ml)</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9520</td><td>Lineares Acrylamid</td></tr><tr><td>LUNA-FL Dual-Fluoreszenz-Zellzähler</td><td>Logos Biosystems</td><td>L20001</td><td>Zellzähler</td></tr><tr><td>LUNA Zellzählungsobjektträger, 50 Objektträger</td><td>Logos Biosystems</td><td>L12001</td><td>Zellzähler</td></tr><tr><td>Mineralöl, BioReagenz, für die Molekularbiologie, Leichtöl</td><td>MilliporeSigma</td><td>M5904-500ML</td><td>Mineralöl</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethylethylendiamin für die Molekularbiologie</td><td>MilliporeSigma</td><td>T7024-100ML</td><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethylethylendiamin</td></tr><tr><td>NaCl (5 M), RNase-frei</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9760G</td><td>5M NaCl</td></tr><tr><td>NanoDrop Lite</td><td>Thermo Fisher</td><td>2516</td><td>&nbsp; Mikrovolumen-Spektralphotometer</td></tr><tr><td>NEST 2 mL 96-Well Deep-Well-Platte, V Bottom</td><td>Opentrons</td><td>N/A</td><td>2 mL Deep Well 96-Well-Platte 96-Well-PCR-Platte</td></tr><tr><td>ohne Rand</td><td>Genesee Scientific</td><td>27-405</td><td>96-Well-PCR-Platte</td></tr><tr><td>NuSive GTG Agarose Lonza</td><td></td><td>50081</td><td>Agarose</td></tr><tr><td>OmniPur Acrylamid: Bis-Acrylamid 19:1, 40% Lösung</td><td>MilliporeSigma</td><td>1300-500ML</td><td>40 % Acrylamid / Bis-Acrylamid</td></tr><tr><td>OT-2 Laborroboter</td><td>Opentrons</td><td>OT2</td><td>Automatisierter Liquid-Handling-Roboter</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, EM-Qualität, gereinigt, 20 % wässrige Lösung</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15713</td><td>20 % Pararmaldehyd</td></tr><tr><td>PBS (10x), pH 7,4</td><td>Thermo Fisher</td><td>70011044</td><td>10x PBS</td></tr><tr><td>PIPETMAN Classic P1000</td><td>GILSON</td><td>F123602</td><td>A P1000 Pipette</td></tr><tr><td>Protein LoBind Röhrchen, 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>925000090</td><td>1,5 mL Protein niedrig bindendes Röhrchen</td></tr><tr><td>QIAgen Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>A P1000 Pipette</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay</td><td>Thermo Fisher</td><td>P11495</td><td>&nbsp; dsDNA-spezifischer Interkalator-Farbstoff</td></tr><tr><td>Quick Ligation Kit</td><td>New England BioLabs</td><td>M2200L</td><td>T4 DNA-Ligase (NEB)</td></tr><tr><td>RNaseOUT Rekombinanter Ribonuklease-Inhibitor</td><td>Thermo</td><td>Fisher 10777019</td><td>RNAse-Inhibitor</td></tr><tr><td>S-4FB Crosslinker (DMF-löslich)</td><td>Vektorlaboratorien</td><td>S-1004-105</td><td>Succinimidyl-4-formylbenzoat (S-4FB)</td></tr><tr><td>S-HyNic</td><td>Vektorlaboratorien</td><td>S-1002-105</td><td>Succinimidyl-6-hydrazinonicotinatacetonhydrazon (S-HyNic)</td></tr><tr><td>Natriumacetat, 3 M, pH 5,2, Molekularbiologie</td><td>MilliporeSigma</td><td>567422-100ML</td><td>3M Natriumacetat (pH 5,2)</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat, 1M Pufferlösung, pH 8,5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60408</td><td>1M Natriumbicarbonat-Puffer, pH 8,5</td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch für die Molekularbiologie</td><td>MilliporeSigma</td><td>S3264-250G</td><td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>Monobasisches Natriumphosphat für die Molekularbiologie</td><td>MilliporeSigma</td><td>S3139-250G</td><td>NaH2PO4</td></tr><tr><td>SuperScript IV reverse Transkriptase</td><td>Thermo Fisher</td><td>18090050</td><td>Reverse Transkriptase</td></tr><tr><td>SYBR Gold Nukleinsäure Gel Stain (10.000x Konzentrat in DMSO)</td><td>Thermo Fisher</td><td>S11494</td><td>Ein Interkalatorfarbstoff für DNA</td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase-Reaktionspuffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202S</td><td>10x T4-DNA-Ligase-Reaktionspuffer</td></tr><tr><td>ThermoPol Reaktionspuffer Pack</td><td>New England BioLabs</td><td>B9004S</td><td>10x TPM-T-Puffer (Tris-HCl/Kaliumchlorid/Magnesiumsulfat/Triton X-100)</td></tr><tr><td>TRIzol LS Reagenz</td><td>Thermo Fisher</td><td>10296-028</td><td>Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion</td></tr><tr><td>TruSeq Nano DNA-Bibliothek Vorbereitungskit</td><td>Illumina</td><td>20015965</td><td>Ein Vorbereitungskit für DNA-Bibliotheken (siehe auch die Anweisungen des Herstellers)</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, siehe Tabelle 3</td><td>Eine aminmodifizierte DNA-Sonde für Antikörper</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, siehe Tabelle 3</td><td>Eine aminmodifizierte DNA-Sonde für Antikörper</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003</td><td>Integrated DNA</td><td>Technologies N/A, siehe Tabelle 3</td><td>Eine aminmodifizierte DNA-Sonde für Antikörper</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, siehe Tabelle 3</td><td>Eine aminmodifizierte DNA-Sonde für Antikörper</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, siehe Tabelle 3</td><td>Eine aminmodifizierte DNA-Sonde für Antikörper</td></tr><tr><td>Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A, siehe Tabelle 3</td><td>Eine aminmodifizierte DNA-Sonde zur Kontrolle IgG</td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td>0,5M EDTA, pH 8,0</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-freies destilliertes Wasser</td><td>Thermo Fisher</td><td>10977023</td><td>Reinstwasser</td></tr><tr><td>Zeba Splin Entsalzungskolonnen, 7K MWCO, 0,5 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>89882</td><td>Entsalzungskolonne</td></tr></tbody></table>

wiederverwendbare einzelzelle für iterative epigenomische analysen

Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses

Aktuelle Einzelzell-Epigenomanalysen sind für den einmaligen Gebrauch konzipiert. Die Zelle wird nach einmaliger Verwendung verworfen, wodurch die Analyse mehrerer epigenetischer Markierungen in einer einzelnen Zelle verhindert wird und Daten von anderen Zellen benötigt werden, um das Signal vom experimentellen Hintergrundrauschen in einer einzelnen Zelle zu unterscheiden. In diesem Artikel wird eine Methode beschrieben, mit der dieselbe Einzelzelle für iterative epigenomische Analysen wiederverwendet werden kann. 
Bei dieser experimentellen Methode werden zelluläre Proteine zunächst an einem Polyacrylamid-Polymer verankert, anstatt sie mit Protein und DNA zu vernetzen, wodurch strukturelle Verzerrungen verringert werden. Dieser kritische Schritt ermöglicht wiederholte Experimente mit derselben Einzelzelle. Als nächstes wird ein zufälliger Primer mit einer Gerüstsequenz für die Proximity-Ligation an die genomische DNA geglüht, und die genomische Sequenz wird dem Primer durch Erweiterung unter Verwendung einer DNA-Polymerase hinzugefügt. Anschließend werden ein Antikörper gegen einen epigenetischen Marker und Kontroll-IgG, die jeweils mit unterschiedlichen DNA-Sonden markiert sind, an die jeweiligen Ziele in derselben Einzelzelle gebunden. 
Die Proximity-Ligation wird zwischen dem Random-Primer und dem Antikörper induziert, indem eine Konnektor-DNA mit komplementären Sequenzen an die Gerüstsequenz des Random-Primers und der Antikörper-DNA-Sonde angehängt wird. Dieser Ansatz integriert Antikörperinformationen und benachbarte Genomsequenzen in einem einzigen DNA-Produkt der Proximity-Ligation. Durch die Ermöglichung wiederholter Experimente mit derselben Einzelzelle ermöglicht diese Methode eine Erhöhung der Datendichte einer seltenen Zelle und eine statistische Analyse, bei der nur IgG- und Antikörperdaten derselben Zelle verwendet werden. Die auf diese Weise hergestellten wiederverwendbaren Einzelzellen können mindestens einige Monate gelagert und später wiederverwendet werden, um die epigenetische Charakterisierung zu erweitern und die Datendichte zu erhöhen. Diese Methode bietet Forschern und ihren Projekten Flexibilität.

K562-Einzelzellen wurden unter Verwendung des in Schritt 8 beschriebenen Protokolls erzeugt (siehe Abbildung 5). Einzelne Zellen wurden in die äußere Schicht des Polyacrylamid-Beads eingebettet. Die Zell-DNA wurde gefärbt und mit einem Interkalatorfarbstoff für die DNA-Färbung visualisiert.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63456/63456fig05.jpg"> Abbildung 5: Generie...

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Einzelzellmethode für iterative epigenomische Analysen unter Verwendung einer wiederverwendbaren Einzelzelle. Die wiederverwendbare Einzelzelle ermöglicht die Analyse mehrerer epigenetischer Markierungen in derselben Einzelzelle und die statistische Validierung der Ergebnisse.

Wiederverwendbare Einzelzelle für iterative epigenomische Analysen

Current single-cell epigenome analyses are designed for single use. The cell is discarded after a single use, preventing analysis of multiple epigenetic ...

Diese experimentelle Methode ermöglicht die Langzeitlagerung der wiederverwendbaren Einzelzellen für epigenomische Tests. Es ermöglicht auch die Analyse vieler epigenetischer Markierungen und Transkriptionsfaktoren in derselben einzelnen Zelle. Bei aktuellen Methoden zur Einzelzell-Epigenomanalyse können dieselben Einzelzellen nicht erneut analysiert werden.Bei wiederverwendbaren Einzelzellen können jedoch dieselben Einzelzellen viele Male neu analysiert werden. Diese Technik ist nützlich für die Diagnose und das Design einer epigenetischen Therapie, insbesondere wenn die Anzahl der Patientenzellen begrenzt ist. Diese Methode eignet sich am besten für die Untersuchung des Epigenoms, der Regulation der Genexpression und anderer Systeme, solange spezifische Antikörper für epigenetische Markierungen verfügbar sind.Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal ausprobieren, empfehlen wir Ihnen, mit Proben zu üben, die nicht zu wertvoll sind, und das Experiment mithilfe einer flachen Sequenzierung wie MiSeq oder iSeq 100 zu validieren. Mischen Sie zunächst in einer sauberen Laminar-Flow-Haube einen Milliliter Zellsuspension und 199 Milliliter eines millimolaren EDTA-PBS, das einen Interkalatorf

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

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räumlich aufgelöste, integrierte einzelzellige multiomische Profilierung des Transkriptoms und epigenomischen Zielen in gefrorenen Gewebeschnitten

Lernen Sie eine innovative Methode zur iterativen epigenomischen Analyse wiederverwendbarer Einzelzellen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung mehrerer epigenetischer Markierungen in derselben Zelle und unterstützt die Entwicklung gezielter epigenetischer Therapien.

Wiederverwendbare Einzelzelle für iterative epigenomische Analysen

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