Name: Echtzeit-, zweifarbige stimulierte Raman-Streubildgebung des Mausgehirns für die Gewebediagnose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-01T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Erfahren Sie die Implementierung von zweifarbiger stimulierte Raman-Streumikroskopie für die Echtzeit-Gewebediagnose im Mausgehirn. Diese markierungsfreie Methode ermöglicht schnelle histologische Analysen ohne Gewebeaufbereitung.

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Diese Studie wurde unterstützt durch NIH R35 GM133435 bis D.F.

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</ol>

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Das in diesem Protokoll vorgestellte zweifarbige SRS-Bildgebungsschema hängt von der ordnungsgemäßen Implementierung der einfarbigen SRS-Bildgebung ab. Bei der einfarbigen SRS-Bildgebung sind die kritischen Schritte die räumliche Ausrichtung, die zeitliche Ausrichtung, die Modulationstiefe und die Phasenverschiebung. Die räumliche Kombination der beiden Balken wird durch einen dichroitischen Spiegel erreicht. Mehrere Lenkspiegel werden zur Feineinstellung verwendet, wenn die Strahlen zum dichroitischen Spiegel geschickt ...

Die traditionelle Gewebediagnostik stützt sich auf Färbeprotokolle, gefolgt von einer Untersuchung unter einem optischen Mikroskop. Eine gängige Färbemethode, die von Pathologen verwendet wird, ist die H & E-Färbung: Hämatoxylin färbt Zellkerne in einem violetten Blau und Eosin färbt die extrazelluläre Matrix und das Zytoplasma rosa. Diese einfache Färbung bleibt der Goldstandard in der Pathologie für viele Aufgaben der Gewebediagnose, insbesondere für die Krebsdiagnose. Die H & E-Histopathologie, insbesondere die gefrorene Schnitttechnik, die in einer intraoperativen Umgebung verwendet wird, hat jedoch immer noch Einschränkungen. Das Färbeverfahren ist ein mühsamer Prozess, bei dem Gewebe eingebettet, geschnitten, fixiert und gefärbtwird 1. Die typische Bearbeitungszeit beträgt 20 Minuten oder länger. Die Durchführung von H&E während des gefrorenen Abschnitts kann manchmal schwieriger werden, wenn mehrere Abschnitte gleichzeitig verarbeitet werden, da zelluläre Merkmale oder Wachstumsmuster in 3D zur Margenbewertung bewertet werden müssen. Darüber hinaus erfordern intraoperative histologische Techniken qualifizierte Techniker und Kliniker. Die Begrenzung der Anzahl der Board-zertifizierten Pathologen in vielen Krankenhäusern ist in vielen Fällen eine Einschränkung für die intraoperative Konsultation. Solche Einschränkungen können durch die schnellen Entwicklungsinteressen in der digitalen Pathologie und der auf künstlicher Intelligenz basierenden Diagnosegemildert werden 2. Die H&E-Färbeergebnisse sind jedoch je nach Erfahrung des Technikers variabel, was zusätzliche Herausforderungen für die computergestützte Diagnosedarstellt 2.
Diese Herausforderungen können potenziell mit markierungsfreien optischen Bildgebungsverfahren angegangen werden. Eine solche Technik ist die SRS-Mikroskopie. SRS verwendet synchronisierte gepulste Laser – Pumpe und Stokes – um molekulare Schwingungen mit hoher Effizienzanzuregen 3. Jüngste Berichte haben gezeigt, dass die SRS-Bildgebung von Proteinen und Lipiden H & E-äquivalente Bilder (auch bekannt als stimulierte Raman-Histologie oder SRH) mit intaktem frischem Gewebe erzeugen kann, was die Notwendigkeit einer Gewebeverarbeitung umgeht, die für die Diagnose erforderliche Zeit signifikant verkürzt und intraoperativ angepasstwurde 4. Darüber hinaus kann die SRS-Bildgebung 3D-Bilder liefern, was zusätzliche Informationen für die Diagnose bietet, wenn 2D-Bilder unzureichend sind5. SRH ist unvoreingenommen und generiert digitale Bilder, die für die computergestützte Diagnose leicht verfügbar sind. Es stellt sich schnell als mögliche Lösung für die intraoperative Krebsdiagnose und Tumorrandanalyse heraus, insbesondere bei Hirntumoren 6,7,8. In jüngerer Zeit wurde auch vorgeschlagen, dass die SRS-Bildgebung chemischer Veränderungen des Gewebes nützliche diagnostische Informationen liefert, die Klinikern bei der Stratifizierung verschiedener Krebsarten oder -stadien9 helfen können.
Trotz ihres enormen Potenzials in der Gewebediagnose ist die SRS-Bildgebung aufgrund der Komplexität, die mit der Bildgebungsplattform verbunden ist, die ultraschnelle Laser, das Laserscanning-Mikroskop und anspruchsvolle Detektionselektronik umfasst, meist auf akademische Labors beschränkt, die auf Optik spezialisiert sind. Dieses Protokoll bietet einen detaillierten Workflow, um die Verwendung einer gemeinsamen Femtosekunden-Laserquelle für die zweifarbige Echtzeit-SRS-Bildgebung und die Erzeugung von Pseudo-H & E-Bildern aus dem Hirngewebe der Maus zu demonstrieren. Das Protokoll deckt die folgenden Verfahren ab:
Ausrichtungs- und Chirp-Optimierung Die meisten SRS-Bildgebungsschemata verwenden entweder Pikosekunden- oder Femtosekundenlaser als Anregungsquelle. Bei Femtosekundenlasern ist die Bandbreite des Lasers viel größer als die Raman-Linienbreite. Um diese Einschränkung zu überwinden, wird ein spektraler Fokussierungsansatz verwendet, um die Femtosekundenlaser auf eine Pikosekunden-Zeitskala zu chirpen, um eine enge spektrale Auflösung10 zu erreichen. Eine optimale spektrale Auflösung wird nur erreicht, wenn das zeitliche Zwitschern (auch bekannt als Gruppenverzögerungsdispersion oder nur Dispersion) für die Pumpe und die Stokes-Laser richtig abgestimmt ist. Hier werden das Ausrichtungsverfahren und die notwendigen Schritte zur Optimierung der Dispergierung der Laserstrahlen mit hochdispersiven Glasstäben demonstriert.
Frequenzkalibrierung Ein Vorteil der spektralen Fokussierung SRS besteht darin, dass die Raman-Anregung schnell abgestimmt werden kann, indem die Zeitverzögerung zwischen der Pumpe und den Stokes-Lasern geändert wird. Eine solche Abstimmung ermöglicht eine schnelle Bildgebung und zuverlässige spektrale Erfassung im Vergleich zur Abstimmung von Laserwellenlängen. Die lineare Beziehung zwischen Anregungsfrequenz und Zeitverzögerung erfordert jedoch eine externe Kalibrierung. Organische Lösungsmittel mit bekannten Raman-Peaks werden verwendet, um die Raman-Frequenz für die spektrale Fokussierung von SRS zu kalibrieren.
Zweifarbige Echtzeit-Bildgebung Es ist wichtig, die Bildgebungsgeschwindigkeit in Gewebediagnoseanwendungen zu erhöhen, um die Zeit für die Analyse großer Gewebeproben zu verkürzen. Durch die gleichzeitige zweifarbige SRS-Bildgebung von Lipiden und Proteinen entfällt die Notwendigkeit, den Laser oder die Zeitverzögerung abzustimmen, was die Bildgebungsgeschwindigkeit um mehr als das Doppelte erhöht. Dies wird durch die Verwendung einer neuartigen orthogonalen Modulationstechnik und einer zweikanaligen Demodulation mit einem Lock-in-Verstärker11 erreicht. Dieses Papier beschreibt das Protokoll für orthogonale Modulation und zweikanalige Bildaufnahme.
Epi-Mode-SRS-Bildgebung Der Großteil der bisher gezeigten SRS-Bildgebung wird im Übertragungsmodus durchgeführt. Die Epimode-Bildgebung erkennt rückgestreute Photonen aus Gewebe12. Für pathologische Anwendungen können chirurgische Proben ziemlich groß sein. Für die Bildgebung im Übertragungsmodus ist häufig eine Gewebeschnittaufnahme erforderlich, die unerwünschterweise zusätzliche Zeit in Anspruch nimmt. Im Gegensatz dazu kann die Epimode-Bildgebung mit intakten chirurgischen Proben arbeiten. Da das gleiche Ziel verwendet wird, um rückgestreutes Licht zu sammeln, ist es auch nicht erforderlich, einen Kondensator mit hoher numerischer Apertur, der für die Transmissionsbildgebung erforderlich ist, auszurichten. Der Epi-Modus ist auch die einzige Option, wenn der Gewebeschnitt schwierig ist, z. B. bei Knochen. Zuvor haben wir gezeigt, dass die Epimode-Bildgebung für Hirngewebe eine überlegene Bildgebungsqualität für die Gewebedicke > 2 mm13 bietet. Dieses Protokoll verwendet einen polarisierenden Strahlteiler (PBS), um gestreute Photonen zu sammeln, die durch Gewebe depolarisiert sind. Es ist möglich, mehr Photonen mit einem ringförmigen Detektor auf Kosten der Komplexität der kundenspezifischen Detektorbaugruppezu sammeln 12. Der PBS-Ansatz ist einfacher zu implementieren (ähnlich wie bei der Fluoreszenz), wobei die Standard-Fotodiode bereits für die Transmissionsmodusdetektion verwendet wird.
Pseudo-H&E-Bildgenerierung Sobald zweifarbige SRS-Bilder gesammelt wurden, können sie neu eingefärbt werden, um H & E-Färbungen zu simulieren. Dieses Papier demonstriert das Verfahren zur Umwandlung von Lipid- und Protein-SRS-Bildern in Pseudo-H & E SRS-Bilder für pathologische Anwendungen. Das experimentelle Protokoll beschreibt kritische Schritte, die erforderlich sind, um qualitativ hochwertige SRS-Bilder zu erzeugen. Das hier gezeigte Verfahren ist nicht nur für die Gewebediagnostik anwendbar, sondern kann auch für viele andere hyperspektrale SRS-Bildgebungsanwendungen wie Arzneimittelbildgebung und metabolische Bildgebungangepasst werden 14,15.
Allgemeine Systemanforderungen Das Lasersystem für dieses Protokoll muss in der Lage sein, 2 synchronisierte Femtosekunden-Laserstrahlen auszugeben. Die Systeme verfügen idealerweise über einen optischen parametrischen Oszillator (OPO) zur Breitwellenlängenabstimmung eines der Laserstrahlen. Der Aufbau in diesem Protokoll verwendet ein kommerzielles Lasersystem Insight DS+, das zwei Laser (einen festen Strahl bei 1.040 nm und einen OPO-basierten abstimmbaren Strahl im Bereich von 680 bis 1.300 nm) mit einer Wiederholrate von 80 MHz ausgibt. Laserscanning-Mikroskope, entweder von großen Mikroskopherstellern oder selbst gebaut, können für die SRS-Bildgebung verwendet werden. Das verwendete Mikroskop ist ein aufrechtes Laser-Scanning-Mikroskop, das auf einem handelsüblichen aufrechten Mikroskoprahmen aufgebaut ist. Ein Paar 5-mm-Galvospiegel wird verwendet, um den Laserstrahl zu scannen. Für Benutzer, die sich für ein selbstgebautes Laserscanning-Mikroskop entscheiden, verweisen wir auf ein zuvor veröffentlichtes Protokoll für die Konstruktion eines Laserscanning-Mikroskops16.

<table><tbody><tr><td>100 mm achromatisches Objektiv</td><td>THORLABS</td><td>AC254-100-B</td><td>Breitband, 650 - 1.050 nm, achromatisches Objektiv Brennweite, 100 mm</td></tr><tr><td>20 MHz Bandpassfilter</td><td>Minicircuits</td><td>BBP-21.4+</td><td>Lumped LC Bandpassfilter, 19,2 - 23,6 MHz, 50 &Omega;</td></tr><tr><td>200 mm Achromatische Linse</td><td>THORLABS</td><td>AC254-200-B</td><td>Breitband, 650 - 1.050 nm, achromatische Linse Brennweite, 200 mm</td></tr><tr><td>Achromatische Halbwellenplatte</td><td>Union Optik</td><td>WPA2210-650-1100-M25.4</td><td>Breitband Halbwellenplatte</td></tr><tr><td>Achromatische Viertelwellenplatte</td><td>Union Optik</td><td>WPA4210-650-1100-M25.4</td><td>Breitband Halbwellenplatte</td></tr><tr><td>Strahlabnehmer</td><td>THORLABS</td><td>BSN11</td><td>10:90 Plattenstrahlteiler</td></tr><tr><td>Dichroitischer Spiegel</td><td>THORLABS</td><td>DMSP1000</td><td>Es können auch andere Dichroiten mit einer Mittenwellenlänge um 1.000 nm verwendet werden.</td></tr><tr><td>DMSO (Dimethylsulfoxid)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>472301</td><td>Lösungsmittel zur Kalibrierung der Raman-Verschiebung. Andere Lösungsmittel mit bekannten Raman-Peaks können verwendet werden.</td></tr><tr><td>Elektrooptischer Amplitudenmodulator</td><td>THORLABS</td><td>EO-AM-NR-C1</td> Für <td>die orthogonale Modulation und die Zweikanal-Bildgebung werden zwei EOMs benötigt. Die Resonanzversion wird empfohlen, damit eine niedrigere Ansteuerspannung verwendet werden kann.</td></tr><tr><td>Falsch H& E Staining Script</td><td>Matlab</td><td></td><td>https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining</td></tr><tr><td>Fanout Buffer</td><td>PRL-414B</td><td>Pulse Research Lab</td><td>1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer und Line Driver, zur Erzeugung der EOM-Treiberfrequenz und der Referenz zur Lock-in</td></tr><tr><td>Schnelle Fotodiode</td><td>THORLABS</td><td>DET10A2</td><td>Si Detector, 1 ns Rise Time</td></tr><tr><td>Frequency Divider</td><td>PRL-220A</td><td>Pulse Research Lab</td><td>TTL Freq. Teiler (f/2, f/4, f/8, f/16), zur Erzeugung von 20MHz aus dem Laserausgang.</td></tr><tr><td>Hochdispersive Glasstäbe</td><td>Union Optic</td><td>CYLROD01</td><td>Hohe Dispersion H-ZF52A Stablinse 120 mm, SF11 Stablinse 100 mm</td></tr><tr><td>Insight DS+</td><td>Newport</td><td></td><td>Lasersystem, das in der Lage ist, zwei synchronisiert gepulste Laser (ein fester Strahl bei 1.040 nm und ein abstimmbarer Strahl im Bereich von 680-1.300 nm) mit einer Wiederholrate von 80 MHz auszugeben.</td></tr><tr><td>Lock-in-Verstärker</td><td>Liquid Instruments</td><td>Moku Lab</td><td>Lock-in-Verstärker zur Extraktion des SRS-Signals von der Fotodiode. Ein Zurich Instrument HF2LI oder ein ähnliches Instrument kann ebenfalls verwendet werden.</td></tr><tr><td>Spiegel</td><td>THORLABS</td><td>BB05-E03-10</td><td>Breitband-Dielektrischer Spiegel, 750 - 1.100 nm. Auch silberne Spiegel können verwendet werden.</td></tr><tr><td>Motorisierter Verzögerungstisch</td><td>Zaber</td><td>X-DMQ12P-DE52</td><td>Verzögerungsstufe zur Feinsteuerung der zeitlichen Überlappung der Pumpe und der Stokes-Laser. Jeder andere motorisierte Tisch sollte funktionieren.</td></tr><tr><td>Öl-Immersionskondensator</td><td>Nikon</td><td>CSC1003</td><td>1.4 NA. Es können auch andere Kondensatoren mit NA>1,2 verwendet werden.</td></tr><tr><td>Oszilloskop</td><td>Tektronix</td><td>TDS7054</td><td>Jedes andere Oszilloskop mit einer Bandbreite von 400 MHz oder höher sollte funktionieren.</td></tr><tr><td>Phasenschieber</td><td>SigaTek</td><td>SF50A2</td><td>Zum Verschieben der Phase der Modulationsfrequenz</td></tr><tr><td>Fotodiode</td><td>Hamamatsu Corp</td><td>S3994-01</td><td>Silizium-PIN-Diode mit großer Fläche (10 x 10 cm2). Es können auch andere Dioden mit großer Fläche und geringer Kapazität verwendet werden.</td></tr><tr><td>Polarisations-Strahlteiler</td><td>Union Optic</td><td>PBS9025-620-1000</td><td>Breitband-Polarisations-Strahlteiler</td></tr><tr><td>Refactive Index Database</td><td></td><td></td><td>refractiveindex.info</td></tr><tr><td>Retro-Reflektor</td><td>Edmund Optics</td><td>34-408</td><td>BBAR Rechtwinkliges Prisma. Es können auch andere Prismen oder Retroreflektoren verwendet werden.</td></tr><tr><td>HF Leistungsverstärker</td><td>Minischaltungen</td><td>ZHL-1-2W+</td><td>Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 &Omega;</td></tr><tr><td>Scan-Spiegel</td><td>Cambridge Technologies</td><td>6215H</td><td>Wir haben einen 5-mm-Spiegelsatz mit Silberbeschichtung</td></tr><tr><td>verwendet ScanImage</td><td>Vidrio</td><td>ScanImage Basic</td><td>Laser-Scanning-Mikroskop-Steuerungssoftware</td></tr><tr><td>Shortpass-Filter</td><td>THORLABS</td><td>FESH1000</td><td>25,0 mm Premium-Kurzpassfilter, Cut-Off-Wellenlänge: 1.000 nm. Für eine effiziente Unterdrückung der Stokes können zwei Filter notwendig sein.</td></tr><tr><td>Aufrechtes Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse FN1</td><td>Es kann jeder andere Mikroskoprahmen verwendet werden. Steht ein Laser-Scanning-Mikroskop zur Verfügung, kann dieses direkt eingesetzt werden. Andernfalls mussten das Mikroskop um einen Galvoscanner und ein Scanobjektiv erweitert werden.</td></tr><tr><td>Wasser-Immersionsobjektiv</td><td>Olympus</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td>Das Multiphotonen-25X-Objektiv hat eine NA von 1,05. Andere ähnliche Ziele können verwendet werden.</td></tr></tbody></table>

echtzeit-, zweifarbige stimulierte raman-streubildgebung des mausgehirns für die gewebediagnose

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) hat sich zu einem leistungsstarken optischen Bildgebungsverfahren für die Gewebediagnose entwickelt. In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass zweifarbiges SRS in der Lage ist, Hämatoxylin und Eosin (H & E) -äquivalente Bilder zu liefern, die eine schnelle und zuverlässige Diagnose von Hirntumoren ermöglichen. Diese Fähigkeit hat aufregende intraoperative Krebsdiagnoseanwendungen ermöglicht. Die zweifarbige SRS-Bildgebung von Gewebe kann entweder mit einer Pikosekunden- oder Femtosekunden-Laserquelle durchgeführt werden. Femtosekundenlaser haben den Vorteil, dass sie flexible Bildgebungsmodi ermöglichen, einschließlich schneller hyperspektraler Bildgebung und zweifarbiger SRS-Bildgebung in Echtzeit. Ein spektraler Fokussierungsansatz mit chirped Laserpulsen wird typischerweise mit Femtosekundenlasern verwendet, um eine hohe spektrale Auflösung zu erreichen. 
Die Zwei-Farben-SRS-Erfassung kann mit orthogonaler Modulation und Lock-in-Erkennung realisiert werden. Die Komplexität des Pulschirpens, der Modulation und der Charakterisierung ist ein Engpass für die weit verbreitete Einführung dieser Methode. Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll, um die Implementierung und Optimierung von spektral fokussierendem SRS und der zweifarbigen Echtzeitbildgebung von Hirngewebe der Maus im Epi-Modus zu demonstrieren. Dieses Protokoll kann für eine breite Palette von SRS-Bildgebungsanwendungen verwendet werden, die die Hochgeschwindigkeits- und spektroskopische Bildgebungsfähigkeit von SRS nutzen.

Optimierung der spektralen Auflösung: Die Ausbreitung durch ein Material wird durch das dispersive Medium (Länge und Material) und die Wellenlänge beeinflusst. Eine Änderung der Dispersionsstablänge wirkt sich auf die spektrale Auflösung und die Signalgröße aus. Es handelt sich um eine Geben-Nehmen-Beziehung, die je nach Anwendung unterschiedlich abgewogen werden kann. Die Stäbe strecken den Strahlpuls von breit in der Frequenz und schmal in der Zeit zu eng in der Frequenz und breit in der Zeit. <stro...

Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) ist eine leistungsstarke, zerstörungsfreie und markierungsfreie Bildgebungstechnik. Eine aufkommende Anwendung ist die stimulierte Raman-Histologie, bei der die zweifarbige SRS-Bildgebung an den Protein- und Lipid-Raman-Übergängen verwendet wird, um Pseudo-Hämatoxylin- und Eosin-Bilder zu erzeugen. Hier demonstrieren wir ein Protokoll für die zweifarbige SRS-Bildgebung in Echtzeit für die Gewebediagnose.

Echtzeit-, zweifarbige stimulierte Raman-Streubildgebung des Mausgehirns für die Gewebediagnose

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...

Dieses Protokoll wird die Implementierung und Optimierung der spektral fokussierenden SRS-Mikroskopie demonstrieren und wie sie für Echtzeit-stimulierte Raman-Histologie-Anwendungen verwendet werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Geschwindigkeit, mit der Proben verarbeitet werden können, sobald die Instrumentierung richtig ausgerichtet ist, da SRS keine Gewebeverarbeitung und -färbung erfordert. Dieses Protokoll gilt für andere SRS-Anwendungen, nicht nur für die Histologie.Solche Anwendungen umfassen kleine Moleküle, Medikamente, Zellen und Gewebe. Beginnen Sie mit der Installation eines Paares achromatischer Linsen für den Pumpstrahl, um die Laserstrahlgröße als Ausgangspunkt um das Doppelte zu vergrößern. Platzieren Sie ein 100- und 200-Millimeter-Objektiv etwa 300 Millimeter voneinander entfernt.Richten Sie dann den Pumpstrahl durch die Mitte beider Linsen aus. Als nächstes platzieren Sie einen Spiegel nach der zweiten Linse, um den Strahl in Richtung einer Wand zu senden, die mehr als einen Meter entfernt ist. Verfolgen Sie den Strahl vom Spiegel zur Wand mit einer IR-Karte und prüfen Sie, ob sich der Strahl in der Größe ändert.Kollimieren Sie den Balken, wenn sich die Größe des Balkens in Abhängigkeit von der Entfernung ändert. Kombinieren Sie die beiden Laserstrahlen, indem Sie einen dichroitischen Spiegel mit mehreren Lenkspiegeln zur Einstellung installieren. Optimieren Sie die räumliche Überlappung der Pumpe und von Stokes, indem Sie die Strahlen nach dem dichroitischen Spiegel an zwei verschiedenen Positionen im Abstand von etwa einem Meter überwachen.Stellen Sie den Lenkspiegel, gefolgt vom dichroitischen Spiegel, iterativ ein, um den Stokes-Strahl mit dem Pumpenstrahl auszurichten. Stellen Sie sicher, dass die kombinierten Strahlen in die Mitte der Scanspiegel des Laserscanning-Mikroskops geschickt werden, indem Sie ein Paar Lenkspiegel einstellen, wenn sich die Scanspiegel in der geparkten Position befinden. Verwenden Sie nach dem Kondensator ein weiteres Paar Linsen mit Brennweiten von 100 Millimetern bzw. 30 Millimetern, um den übertragenen Strahl auf die Fotodiode zu leiten und sicherzustellen, dass beide Strahlen in der Fotodiode enthalten sind.Installieren Sie dann zwei Tiefpassfilter, um den modulierten Stokes-Strahl zu blockieren. Platzieren Sie einen Strahlsampler im Stokes-Strahlpfad, um 10% des Strahls aufzunehmen, und senden Sie ihn an eine schnelle Fotodiode, um den 80-Megahertz-Pulszug zu erkennen. Nehmen Sie einen der Ausgänge des Fanout-Puffers und filtern Sie ihn mit einem Bandpassfilter, um eine 20-Megahertz-Sinuswelle zu erhalten.Verwenden Sie dann einen HF-Dämpfungsglied, um die Ausgangsspitze bis zur Spitzenspannung auf etwa 500 Millivolt einzustellen. Senden Sie den resultierenden Ausgang an einen Phasenschieber, der eine Feineinstellung der HF-Phase mit einer Spannungsquelle ermöglicht. Senden Sie diesen Ausgang an einen HF-Leistungsverstärker und schließen Sie den Ausgang des Verstärkers an die EOM an.Nachdem Sie den Stokes-Strahl entsperrt haben, optimieren Sie die Modulationstiefe des ersten EOM, indem Sie eine Fotodiode im Strahlweg platzieren. Stellen Sie die EOM-Spannung und die Viertelwellenplatte so lange ein, bis die Modulationstiefe zufriedenstellend erscheint. Platzieren Sie eine Fotodiode nach dem dichroitischen Spiegel, um den Laserstrahl zu erkennen.Blockieren Sie zuerst den Stokes-Strahl und zoomen Sie dann auf einen der Pumpimpulsspitzen des Oszilloskops. Platzieren Sie einen vertikalen Cursor, um die zeitliche Position dieses Peaks mit dem Oszilloskop zu markieren. Blockieren Sie nun den Pumpenstrahl und entsperren Sie den Stokes-Balken.Übersetzen Sie die Verzögerungsstufe so, dass die Spitzenpositionen auf dem Oszilloskop vorübergehend an die markierte Position im vorherigen Schritt angepasst werden. Durch Berechnung der Verzögerungsentfernung, die erforderlich ist, um die beiden Strahlen anzupassen, gefolgt von der Verlängerung des Balkenpfads des schnelleren Strahls oder der Verkürzung des Strahlwegs des langsameren Strahls. Als nächstes bereiten Sie eine Objektträgerprobe mit DMSO und doppelseitigem Klebeband als Abstandshalter vor, um die Probe zwischen dem Objektträger und einem Deckglas zu halten.Legen Sie die Probe auf das Mikroskop, wobei die Deckglasseite dem Mikroskopobjektiv zugewandt ist, und beobachten Sie die Probe vom I-Stück unter Hellfeldbeleuchtung. Suchen Sie den Fokus der Probe sowohl an der oberen als auch an der unteren Luftblasenschicht an der Glasbandschnittstelle und verschieben Sie den Fokus zwischen die beiden Schichten des Bandes. Als nächstes stellen Sie die abstimmbare Strahlleistung auf 798 Nanometer ein.Stellen Sie basierend auf dem optischen Durchsatz des Kondensators die optische Leistung für die Pumpe und die Stokes-Strahlen im Objektivfokus auf jeweils etwa 40 Milliwatt ein. Öffnen Sie dann das Scanbild in MATLAB und klicken Sie auf die Schaltfläche mit der Bezeichnung Fokus, um den Scanvorgang zu starten. Stellen Sie den Lenkspiegel vor dem Galvo-Scanner so ein, dass er das DC-Signal auf dem Kanal-One-Display zentriert.Bewegen Sie die motorisierte Verzögerungsstufe und beobachten Sie den Lock-in-Ausgang, der auf dem Display des Kanals zwei angezeigt wird, genau. Passen Sie schließlich die Zeitverzögerung an, um die AC-Signalintensität zu maximieren. Stellen Sie den dichroitischen Spiegel so ein, dass er das SRS-Signal auf dem AC-Kanal zentriert.Stellen Sie dann die Phase des Lock-in-Verstärkers ein, um das Signal zu maximieren. Nach der Montage des Objektträgers auf das Mikroskop und Einstellen der Leistung beider Strahlen auf jeweils etwa 40 Milliwatt bei Probenfokus, wie bereits gezeigt. Öffnen Sie das Scanbild von MATLAB.Finden Sie dann das maximale SRS-Signal, indem Sie durch die Verzögerungsstufe scannen, die dem 2.913 inversen Zentimeter Raman-Peak von DMSO entspricht. Erfassen Sie ein SRS-Bild, das dem 2.913 inversen Zentimeter Raman-Peak von DMSO entspricht. Öffnen Sie das Bild in ImageJ, und wählen Sie einen kleinen Bereich in der Mitte des Rahmens aus.Verwenden Sie die Messfunktion, um den Mittelwert und die Standardabweichung von Werten im ausgewählten Bereich zu berechnen. Speichern Sie für die Frequenzzugangskalibrierung einen hyperspektralen Scan mit dem Verzögerungsstufenbereich, der die 2, 913 und 2.994 inversen Zentimeter Raman-Spitzen von DMSO abdeckt. Speichern Sie dann die Bühnenpositionen, die dem hyperspektralen Datensatz entsprechen.Führen Sie eine lineare Regression für die Bühnenpositionen und Raman-Verschiebungen bei 2, 913 und 2, 994 inversen Zentimetern durch. Konvertieren Sie die Verzögerungspositionen mithilfe der linearen Regressionsgleichung in die entsprechenden Raman-Frequenzen. Für die Kalibrierung der spektralen Auflösung schätzen Sie die Tischposition basierend auf der vorherigen Position mit der erhöhten optischen Weglänge aufgrund des Einsetzens von Stäben.Richten Sie die räumliche Überlappung der Balken aufgrund der leichten Abweichung des Balkens beim Hinzufügen von Glasstäben neu aus. Installieren Sie einen polarisierenden Strahlteiler, eine Viertelwellenplatte und eine zweite EOM in den Strahlpfad nach dem ersten EOM. Trennen Sie den Signaleingang vom zweiten EOM, schließen Sie den Signaleingang an den ersten EOM an, und schalten Sie ihn ein.Modulieren Sie den Stokes-Strahl mit 20 Megahertz, indem Sie den Strahl durch die erste EOM senden. Passen Sie die Neigung und Position des ersten EOM an, um sicherzustellen, dass der Strahl durch den EOM-Kristall zentriert ist. Bereiten Sie eine Objektträgerprobe mit doppelseitigem Klebeband, Objektträger und Deckglas vor.Legen Sie die Probe auf das Mikroskop, wobei die Deckglasseite dem Mikroskopobjektiv zugewandt ist. Für die Epi-Mode-SRS-Bildgebung installieren Sie eine Halbwellenplatte, bevor der Strahl in das Mikroskop eintritt, um die Polarisation des Strahls zu ändern, der in das Mikroskop eindringt. Platzieren Sie einen polarisierenden Strahlteiler über dem Objektiv, damit der depolarisierte rückreflektierte Strahl den Detektor erreichen kann.Als nächstes verwenden Sie eine 75-Millimeter-Achromatlinse und eine 30-Millimeter-asphärische Linse, um die rückseitigen gestreuten Photonen von der hinteren Öffnung des Objektivs an den Fotodetektor weiterzuleiten. Montieren Sie den Detektor, um das vom Polarisationsstrahlteiler geleitete Streulicht zu sammeln. Installieren Sie dann einen Filter, um das Eindringen des modulierten Strahls in den Detektor zu verhindern.Die Variation der Stablängen wirkt sich auf die spektrale Auflösung aus. Wenn keine Glaszwitscherstäbe verwendet werden, werden die beiden Raman-Peaks von DMSO überhaupt nicht aufgelöst. Eine Zunahme der Anzahl der Glaszwitscherstäbe beginnt, die beiden Spitzen an einem zufriedenstellenden Punkt aufzulösen.Abgestimmtes Zwitschern löst beide Spitzen auf und kann verwendet werden, um die Tischpositionen auf Frequenz zu kalibrieren. Zwei zeitverzögerte Pulszüge orthogonaler Polarisation, die zur Abbildung von DMSO-Spektren verwendet werden, zeigen die Zeitverzögerung zwischen den SRS-Anregungen mit akzeptabler Modulationstiefe und zeitlicher Trennung. Im Gegensatz dazu führt eine schlechte zweifarbige SRS-Phasenverschiebung zu invertierten oder negativen Spitzen.Hier wird eine zweifarbige SRS-Bildgebung in Echtzeit bei 2.850 und 2.930 inversen Zentimetern Ex-vivo-Hirngewebe der Maus gezeigt. Die rohen Lipid- und Proteinbilder wurden farbcodiert, um ein einziges Bild zu erzeugen, das Lipid- und Proteinbeiträge darstellt. Falsche Hämatoxylin- und Eosin-Umfärbungen wurden auch durchgeführt, um die Hämatoxylin- und Eosinfärbung für pathologische Anwendungen nachzuahmen.Raumzeitliche Überlappung und räumliche Auflösungsoptimierung sind die wichtigsten Schritte für den räumlichen Fokussierungsansatz von SRS. Diese Methode ist allgemein für andere Pumpsondenmikroskopie-Experimente wie die transiente Absorptionsmikroskopie anwendbar. Die Methode ermöglicht auch die Bildgebung von nicht-fluoreszierenden Molekülen in Zellen und Geweben.Die hier vorgestellte Methode beschleunigt die Bildaufnahmezeit für die zukünftige Translation der stimulierten Raman-Histologie in der Klinik.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Bioimaging Methoden zur Zelle Bioverteilung von Nanopartikeln zu beurteilen sind anwendbar für therapeutische und diagnostische Überwachung von nanoformulated Verbindungen. Die hierin beschriebenen Verfahren sind sensitiver und spezifischer als durch histologische Koregistrierung beurteilt. Die Methoden liefern eine translatorische Weg von Nagetieren auf Menschen-Anwendungen.

Registrierte Bioimaging von Nanomaterialien für Diagnostische und Therapeutische Überwachung

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