Name: Standardisierung und Pflege von 3D-Organoidkulturen bei Hunden für den Einsatz in der biomedizinischen Forschung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Erfahren Sie standardisierte Protokolle zur Kultur von intestinalen und hepatischen Hunde-Organoiden. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Isolation, Biobanking und Anwendung in biomedizinischer Forschung.

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Die Autoren möchten den Mitarbeitern des Veterinary Diagnostic Laboratory der Iowa State University, nämlich Haley M. Lambert, Emily Rahe, Rosalyn M. Branaman, Victoria J. Green und Jennifer M. Groeltz-Thrush, für die rechtzeitige Verarbeitung der zur Verfügung gestellten Proben danken. Die Autoren möchten die Unterstützung des Faculty Startup, des ISU VPR Miller Award, des ISU VPR Miller Award und des NSF SBIR Sub-Award für ISU # 1912948 anerkennen.

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K. Allenspach ist Mitbegründer von LifEngine Animal Health und 3D Health Solutions. Sie ist als Beraterin für Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics und Mars tätig. J. P. Mochel ist Mitbegründer von LifEngine Animal Health und 3D Health Solutions. Dr. Mochel ist als Berater für Ceva Animal Health und Ethos Animal Health tätig. Andere Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Derzeit fehlen standardisierte Protokolle für die Isolierung und Aufrechterhaltung von Leber- und Darmorganoiden bei Hunden. Die Festlegung von Standardarbeitsanweisungen für Organoidkulturen ist gerechtfertigt, damit dieses Modell in verschiedenen Laborumgebungen anwendbar ist. Insbesondere die Bereitstellung standardisierter Betriebsprotokolle für die Kultur dieser kaninen Organoidmodelle ist der Schlüssel zur Charakterisierung des normalen Wachstums von Organoiden während der Kultur und des Passagings, um optimale Zeitpunkte für Expansion und Wartung abzuleiten. Canine Darmorganoide, die mit dem Protokoll kultiviert wurden, wurden zuvor von Chandra et al.12 charakterisiert.
Einer der kritischsten Schritte des Protokolls ist die Übertragung von Organoiden. Der optimale Zeitpunkt für die erste Passage von Lebersphäroiden wurde auf der Grundlage der Lebersphäroidmessungen am Tag 7 nach der Isolierung bestimmt. Das maximale Volumen der Sphäroide wurde am Tag 7 erreicht, und gleichzeitig begannen die Sphäroide zu knospen und bildeten hepatische Organoide. Der Anstieg des gesamten Organoidvolumens von Tag 2-7 nach der Isolierung betrug mehr als das 365-fache, was darauf hindeutet, dass die optimale Durchgangszeit länger ist als die der Organoidkultur des Hundedarms. Nach 7 Tagen in Kultur wurden keine groben Anzeichen einer zellulären Apoptose im Lebersphäroid beobachtet, auch ohne Reinigung oder Verlauf (Abbildung 7). Das Passieren der Darm- und Leberorganoide kann eine Herausforderung sein, da das Verfahren zum Verlust von Zellen und einer veränderten Lebensfähigkeit führen kann. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine längere Inkubation von Leberorganoiden mit trypsinähnlicher Protease (bis zu 12 min) die Subkultur nicht negativ beeinflusst. Die Inkubation der Organoide in trypsinartiger Protease für länger als 24 min kann der nachfolgenden Subkultur der Organoide abträglich sein.
Im Falle eines suboptimalen Bruchs in den Zellclustern mit der Organoidpassage könnte eine mechanische Dissoziation anstelle einer längeren Inkubation mit trypsinartiger Protease vorteilhafter sein. Wenn Probleme mit der ordnungsgemäßen Dissoziation der Organoide auftreten, kann versucht werden, die Durchgangsausbeute kurz zu wirbeln, um die Durchgangsausbeute zu erhöhen. Auf der anderen Seite hat das Vortexing das Potenzial, eine Kultur zu ruinieren und Zellen zu schädigen, so dass es nur verwendet werden sollte, wenn andere Verfahren wiederholt fehlgeschlagen sind. Das Aufbrechen hepatischer Organoide in einzelne Zellen senkt die Wachstumsrate der Organoide, während das Aufbrechen in Zellcluster ihre Lebensfähigkeit erheblich verbessern kann. Als Inkubationszeit für das Organoidprotokoll wurden zehn Minuten gewählt. Ein 12-minütiger Inkubationszeitpunkt wurde im Vergleich zu einer 24-minütigen Inkubation im Trypsin-ähnlichen Protease-Experiment als nicht zytotoxisch eingestuft.
Das Überlebensfähigkeitsexperiment bestätigte, dass hepatische Organoide von Hunden unter ungünstigen Bedingungen (strukturelle und ernährungsphysiologische Erschöpfung) bis zu 19,5 Tage überleben können. Organoide, die diese Bedingungen am längsten überlebten, wurden mit CMGF+-Medien kultiviert. Diese Beobachtung könnte durch das langsamere Wachstum von Leberorganoiden in Medien verursacht worden sein, die nicht mit Rock-Inhibitor und GSK3β ergänzt wurden. Organoide Kulturen mit CMGF+ R/G wuchsen schneller und haben ihre Ressourcen möglicherweise schneller erschöpft. Dieses Experiment eröffnet Möglichkeiten der Miniaturisierung der Organoidkultur bei Hunden, um eine Hochdurchsatz-Systemumwandlung zu erreichen. Eine solche Technologie zeigt das Potenzial, die Arzneimittelforschung oder toxikologische Studien zu wesentlich reduzierten Kosten zu erleichtern.
Einige häufige Probleme, die während der Aufrechterhaltung der Organoidkultur bei Hunden auftreten, sind eine unsachgemäße Probenerstarrung beim Plattieren, eine Kulturkontamination und die Bestimmung der richtigen Dichte und Größe der Organoide. Wenn sich das gelöste ECM während der Beschichtung vorzeitig verfestigt, legen Sie es sofort für 10 min auf Eis. Wenn solubilisiertes ECM keine kuppelartigen Strukturen bildet, ist es wahrscheinlich, dass nicht genügend Medien aus der Probe entfernt wurden. Wenn dies der Fall ist, verdünnen Sie die Probe mit einem stärker gelösten ECM, bis sich Kuppeln bilden.
Wenn eine pilzliche oder bakterielle Kontamination in einer ganzen Platte gefunden wird (siehe Abbildung 4), besteht die beste Lösung darin, die Platte zu entsorgen. Die Behandlung mit antimykotischen oder antibiotischen Medikamenten kann versucht werden, aber der Erfolg eines solchen Versuchs ist extrem gering. Wenn ein einzelnes Bohrloch in einer Platte kontaminiert ist, können lebensfähige und nicht betroffene Bohrlöcher (Schritte 4.1 bis 4.5) zu einer neuen Platte gereinigt und genau überwacht werden. Wenn die Probe bereits im Notfall eingefroren wurde, ist es ratsam, die gesamte Probe zu entsorgen, da das Auftauen der Probe den Inkubator einem zusätzlichen Kontaminationsrisiko aussetzt.
Eine gesunde Organoidkultur sollte mindestens in der Kategorie mittlerer Größe und mittlerer Dichte oder größer sein. Eine optimale Dichte ist entscheidend für das Wachstum der Organoidkultur. Eine geringere Dichte muss korrigiert werden, indem die Organoide auf mittlere Dichte gereinigt werden. Wenn die Situation der extremen Dichte auftritt (Überfüllung), sollten die Organoide auf weitere Brunnen ausgedehnt werden. Grobe Anzeichen einer zellulären Apoptose begleiten oft sowohl die Überfüllung als auch die geringe Dichte der Organoidkultur. Wenn diese Probleme nicht rechtzeitig behoben werden, wird die gesamte Organoidkultur innerhalb weniger Tage apoptotisch. Wenn Organoide eine besonders große Größe oder eine sehr hohe Dichte erreichen, sollte die Kultur für ein Experiment, Einfrieren oder Fixieren verwendet werden.
Das Organoidmedium enthält derzeit 17 Komponenten, und die Zugabe von Wachstumsfaktoren, die für die Erhaltung und Expansion von Organoiden benötigt werden, kann daher teuer sein. Dieses Problem kann durch das Züchten von 2D-Zellkulturen gelöst werden, die die Wachstumsfaktoren synthetisieren, um konditioniertes CMGF+ zu erzeugen. Zellkultur L-WRN produziert Wnt-3a, R-Spondin-3 und Noggin Wachstumsfaktoren37. Die Zellkolonie verwendet 90% DMEM/F12 und 10% FBS Kulturmedien. Wenn die Kultur 90 Prozent Konfluenz erreicht, werden Medien 1 Woche lang jeden Tag geerntet. Die geernteten Medien werden dann mit 2x CMGF+ (ohne diese Wachstumsfaktoren) gemischt. Während 2D-Kulturen die erforderlichen Wachstumsfaktoren zu einem Bruchteil der Kosten erzeugen können, muss mit der zusätzlichen Zeit und Vorbereitung zur Herstellung der Medien gerechnet werden. Die Konzentrationen von Wachstumsfaktoren zwischen konditionierten Medienchargen können ebenfalls unterschiedlich sein37,38.
Aus adulten Stammzellen gewonnene Organoidkulturen von Hunden sind ein einzigartiges biomedizinisches Modell, das dazu beitragen kann, die Ziele der One Health Initiative39 zu erreichen. Die Organoidtechnologie kann in vielen grundlegenden und biomedizinischen Forschungsbereichen eingesetzt werden, von der Entwicklungsbiologie, Pathophysiologie, Wirkstoffforschung und -prüfung, Toxikologie bis hin zur Erforschung von Infektionskrankheiten und regenerativer Medizin40. Translationale und umgekehrte translationale Forschung sind beide Bereiche, in denen Hundeorganoide anwendbar sind15. Hunde werden seit Jahrhunderten in translationalen experimentellen Umgebungen eingesetzt, und ihr Status als Haustier hat auch ihre Position als eine der am meisten erforschten Arten in der Veterinärmedizin erleichtert.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Manuskript standardisierte Betriebsprotokolle für die Isolierung, Wartung, Ernte und das Biobanking von Leber- und Darmorganoiden bei Hunden bereitstellt, um die Anwendung dieses Modells in verschiedenen biomedizinischen Bereichen zu erleichtern. Dieses Modell eignet sich in einzigartiger Weise, um die reverse translationale Forschung als Instrument der One Health Initiative zur Förderung des inter- und intradisziplinären Wissensaustauschs zu fördern.

Nagetiere sind das am häufigsten verwendete Tiermodell für die biomedizinische und translationale Forschung1. Sie sind außerordentlich nützlich für die Untersuchung der grundlegenden molekularen Pathogenese der Krankheiten, obwohl ihre klinische Relevanz für chronische multifaktorielle Erkrankungen kürzlich in Frage gestellt wurde2. Das Hundemodell weist im Vergleich zu Nagetieren mehrere Vorteile auf3,4. Hunde und Menschen teilen Ähnlichkeiten in der Metabolomik und im Darmmikrobiom, die sich aufgrund des Verzehrs der menschlichen Ernährung während verschiedener Perioden ihrer Domestizierung entwickelt haben5,6,7. Ähnlichkeiten zwischen der Anatomie und Physiologie des Hundes und des menschlichen Magen-Darm-Trakts sind ein weiteres Beispiel8.
Darüber hinaus teilen Hunde oft ähnliche Umgebungen und Lebensstile mit ihren Besitzern9. Die längere Lebensdauer von Hunden im Vergleich zu Nagetieren ermöglicht die natürliche Entwicklung zahlreicher chronischer Erkrankungen10. Entzündliche Darmerkrankungen oder metabolisches Syndrom sind Beispiele für multifaktorielle chronische Erkrankungen, die wichtige Ähnlichkeiten zwischen Mensch und Hund aufweisen11,12. Präklinische Studien von Hunden, an denen Hunde mit natürlich vorkommenden Krankheiten beteiligt sind, können zuverlässigere Daten generieren als solche, die aus Nagetiermodellen gewonnen wurden13. Um jedoch den Einsatz von Lebendtierversuchen zu minimieren und den Prinzipien der 3R (Reduce, Refine, Replace)14 zu entsprechen, haben sich Alternativen zu In-vivo-Tests mit 3D-In-vitro-Organoiden für Hunde ergeben15.
Organoide sind selbstorganisierte 3D-Stammzellstrukturen, die die Physiologie und Mikroanatomie ihrer ursprünglichen Organe rekapitulieren16,17. Diese Technologie wurde erstmals 200917 von Sato et al. beschrieben und ermöglichte mehr übersetzbare In-vitro-Studien in Epithelzelllinien als bisher mit 2D-Krebszellkulturen18,19,20. Organoide sind in vitro-Modellen in vielen biomedizinischen Disziplinen nützlich, z. B. in präklinischen toxikologischen21,22,23-, Absorptions- oder Metabolismusstudien24,25,26,27,28 sowie in personalisierten medizinischen Ansätzen29,30,31 . Die erfolgreiche Kultur der Darmorganoide von Hunden wurde erstmals 201912 beschrieben, während Leberorganoide, die von einem Hund stammen, erstmals 201532 von Nantasanti et al. berichtet wurden. Canine Organoide wurden seitdem erfolgreich in Studien zur Untersuchung von chronischen Enteropathien bei Hunden, gastrointestinalen Stromatumoren, kolorektalen Adenokarzinomen12 und Morbus Wilson33,34 eingesetzt.
Während adulte Stammzellen über Nekropsien geerntet werden können, erfordert die Organoidtechnologie nicht immer die Opferung der Tiere. Endoskopische und laparoskopische Biopsien oder sogar Feinnadelaspirate von Organen35 sind eine lebensfähige Quelle für adulte Stammzellen zur epithelialen Organoidisolierung12. Der weit verbreitete Einsatz solcher nicht-invasiven Techniken in der tierärztlichen Praxis erleichtert Optionen für die reverse translationale Forschung (Übersetzung von Informationen aus der veterinärmedizinischen klinischen Praxis in die klinische Praxis am Menschen und umgekehrt)15. Die Weiterentwicklung der Organoidtechnologie kann durch die Standardisierung der Organoidkultur und der Wartungsmethoden sichergestellt werden. Das hier vorgestellte Organoidprotokoll basiert teilweise auf zuvor veröffentlichten Arbeiten von Saxena et al. aus dem Jahr 201536, und die Methoden wurden an die Besonderheiten der intestinalen und hepatischen Organoidkultur von Hunden angepasst. Der Gesamtablauf der Organoidprotokolle für Hunde ist in Abbildung 1 dargestellt.
Das Canine Organoid Isolation Protocol führt Methoden zur Gewinnung von Proben aus endoskopischen, laparoskopischen und chirurgischen Biopsien sowie Nekropsien ein. Es skizziert die anfängliche Vorbehandlung von Gewebeproben und Methoden für den Transport zum Labor. Materialien und Reagenzien, die für die Organoidisolierung benötigt werden, sind im Abschnitt "Vorbereitung zur Isolierung" zusammengefasst. Der Prozess der adulten Stammzellisolierung aus Gewebeproben wird ausführlicher beschrieben. Schließlich wird der Prozess der Beschichtung von Organoiden in kuppelartige Strukturen unter Verwendung einer solubilisierten extrazellulären Membranmatrix diskutiert.
Das zweite Protokoll, Canine Organoid Maintenance Protocol, beschreibt Methoden zur Dokumentation und Kultivierung von Organoiden. Medienwechsel und deren Häufigkeit werden in diesem Abschnitt behandelt. Weiterhin werden die Laborverfahren wie das Passieren und Reinigen der Zellkulturen beschrieben, die für die erfolgreiche Aufrechterhaltung von 3D-Canin-Organoiden unerlässlich sind. Die angemessene Weitergabe ist ein kritischer Schritt des Protokolls, und mögliche Anpassungen und Fehlerbehebungen dieses Schritts werden im Manuskript weiter diskutiert.
Das letzte Protokoll ist das Canine Organoid Harvesting and Biobanking Protocol, das Methoden zur Herstellung ausgewachsener Organoide für die Paraffineinbettung und RNA-Konservierung enthält. Auch Verfahren des Biobankings von Organoidproben in der Lagerung von flüssigem Stickstoff werden hier beschrieben. Schließlich werden die Möglichkeiten diskutiert, gefrorene Proben aufzutauen und ihr Wachstum zu unterstützen.
Zusammenfassend zielt dieser Artikel darauf ab, konsistente Organoidkulturverfahren für Hunde durch die Standardisierung von Ringprotokollen bereitzustellen. Auf diese Weise zielt das Manuskript darauf ab, die Reproduzierbarkeit von Daten aus Organoidmodellen von Hunden zu erleichtern, um ihre Relevanz in der translationalen biomedizinischen Forschung zu erhöhen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63515/63515fig01.jpg"> Abbildung 1: Workflow von Organoidprotokollen für Hunde. Das Canine Organoid Isolation Protocol beschreibt die Vorbereitung der Materialien, die für die Organoidisolierung benötigt werden, die Entnahme einer Gewebeprobe (durch Nekropsie, endoskopische, laparoskopische und chirurgische Biopsien) und die Anleitung zur Zelldissoziation und -plattierung der Zellpopulation. Das Canine Organoid Maintenance Protocol behandelt die Reinigung und den Übergang der Organoidkultur. Das Organoid Harvesting and Biobanking Protocol diskutiert die Vorbereitung von Organoidproben für die Paraffineinbettung und die weitere Organoidcharakterisierung. Methoden zur Biobank-Organoidkultur und deren Wiederbelebung aus der Speicherung in flüssigem Stickstoff werden ebenfalls diskutiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63515/63515fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td><stark>Chelatlösung</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbit</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP439-500</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Promega</td><td>V3151</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655-100G</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4-2H2</td><td>O Sigma</td><td>S5136-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher Chemical</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>Organoid media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin I human</td><td>Sigma</td><td>G9145-.5MG</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>PeproTech</td><td>9094360</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR Life Science</td><td>J848-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Human R-Spondin-1</td><td>PeproTech</td><td>120-38-500UG</td><td></td></tr><tr><td>Maus EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Maus Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38-250UG</td><td></td></tr><tr><td>Maus Wnt-3a</td><td>PeproTech</td><td>315-20-10UG</td><td></td></tr><tr><td>N2 Ergänzung</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetyl-L-cystein</td><td>Sigma</td><td>A9165-25G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamid</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>ROCK-Inhibitor (Y-27632)</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td>SCM 075</td><td></td></tr><tr><td>SB202190 (P38-Inhibitor)</td><td>Sigma</td><td>S7067-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Stemolecule CHIR99021 (GSK3&beta;)</td><td>Reprocell</td><td>04-0004-base</td><td></td></tr><tr><td>Trimethoprim</td><td>Sigma</td><td>T7883-5G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfamethoxazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7507-10G</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure, Glacial</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Fisher Chemicals</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, pH 8,0, 0,5 M</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd (37%)</td><td>Fisher Chemical</td><td>F79P-4</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehydlösung</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel-Matrix für Organoidkulturen</td><td>Corning</td><td>356255</td><td>Extrazelluläre Membranmatrix</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 97%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11313</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1X (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1X (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>RNAspäter Soln.</td><td>Invitrogen</td><td>AM7021</td><td>RNA-Speicherreagenz</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td>Trypsin-ähnliche Protease</td></tr><tr><td>Other</td><td></td><td></td><td></td></tr>6 <tr><td>Well Zellkulturplatte</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>ACD Hybez II Hybridisierungssystem</td><td>ACD a Biotechne</td><td>Marke 321710</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen, 15 mL</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX</td><td>Corning</td><td>BCS-405MC</td><td></td></tr><tr><td>Kryofläschchen</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Zentrifugenröhrchen (50 mL)</td><td>Fisherbrand</td><td>05-539-13</td><td></td></tr><tr><td>GyroMini Nutating Mixer (Wippe)</td><td>Labnet</td><td>S0500-230V-EU</td><td></td></tr><tr><td>Wärmebad</td><td>Lab-Line Instruments</td><td>3000</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty Gefrierbehälter</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td>SpektralphotometerAnalyse</td></tr><tr><td>Panasonic Inkubator Panasonic</td><td></td><td>MCO-170ML-PA</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M Wrapping Film</td><td>Bemis Company Inc</td><td>PM996/EMD</td><td>Labor Flexible Folie Klebeband</td></tr><tr><td>geschützt Einweg Skalpelle</td><td>Bard-Parker</td><td>239844</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 2.5 HD Assay &ndash; RED</td><td>ACD eine Biotechne-Marke</td><td>322350</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope H2O2 & Protease Plus Reagents</td><td>ACD eine Biotechne-Marke</td><td>322330</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope Target Retrieval Reagents</td><td>ACD eine Biotechne-Marke</td><td>322000</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope Wash Buffer Reagents</td><td>ACD eine Biotechne-Marke</td><td>310091</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Dish</td><td>Dot</td><td>Scientific 6676621</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Plate 24 Wells</td><td>Fisherbrand</td><td>FB012929</td><td></td></tr></tbody></table>

standardisierung und pflege von 3d-organoidkulturen bei hunden für den einsatz in der biomedizinischen forschung

Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research

Hunde entwickeln komplexe multifaktorielle Krankheiten analog zum Menschen, einschließlich entzündlicher Erkrankungen, Stoffwechselerkrankungen und Krebs. Daher stellen sie relevante Großtiermodelle mit dem translationalen Potenzial für die Humanmedizin dar. Organoide sind 3-dimensionale (3D), selbstzusammengesetzte Strukturen, die aus Stammzellen gewonnen werden und die Mikroanatomie und Physiologie ihres Ursprungsorgans nachahmen. Diese translationalen In-vitro-Modelle können für Anwendungen der Arzneimittelpermeabilität und -entdeckung, zur toxikologischen Bewertung und zur Bereitstellung eines mechanistischen Verständnisses der Pathophysiologie multifaktorieller chronischer Erkrankungen verwendet werden. Darüber hinaus können Hundeorganoide das Leben von Begleithunden verbessern, indem sie Input in verschiedenen Bereichen der veterinärmedizinischen Forschung liefern und personalisierte Behandlungsanwendungen in der Veterinärmedizin erleichtern. Eine kleine Gruppe von Spendern kann eine Biobank von Organoidproben erstellen, wodurch die Notwendigkeit einer kontinuierlichen Gewebeentnahme reduziert wird, da Organoidzelllinien unbegrenzt subkultiviert werden können. Hierin werden drei Protokolle vorgestellt, die sich auf die Kultur von Darm- und Leberkrebs-Organoiden aus adulten Stammzellen konzentrieren. Das Canine Organoid Isolation Protocol beschreibt Methoden zur Verarbeitung von Gewebe und zur Einbettung des Zellisolats in eine unterstützende Matrix (solubilisierte extrazelluläre Membranmatrix). Das Canine Organoid Maintenance Protocol beschreibt das Wachstum und die Wartung von Organoiden, einschließlich Reinigung und Passieren zusammen mit einem geeigneten Zeitpunkt für die Expansion. Das Organoid Harvesting and Biobanking Protocol beschreibt Möglichkeiten, Organoide für weitere Analysen zu extrahieren, einzufrieren und zu konservieren.

Experimentelle Methoden zur Gewinnung adulter Stammzellen aus dem Darm- und Lebergewebe von Hunden zur Etablierung von 3D-Organoidkulturen werden beschrieben. Darüber hinaus werden die Labortechniken diskutiert, um ein konsistentes Wachstum zu gewährleisten und Standardarbeitsanweisungen für die Ernte, Biobank und Wiederbelebung von Darm- und Leberorganoidkulturen bei Hunden bereitzustellen.

Standardisierung und Pflege von 3D-Organoidkulturen bei Hunden für den Einsatz in der biomedizinischen Forschung

Dogs develop complex multifactorial diseases analogous to humans, including inflammatory diseases, metabolic diseases, and cancer. Therefore, they ...

Die Protokolle für die Kultur von Leber- und Darmorganoiden bei Hunden sind wichtig für die Standardisierung dieser neuartigen Technologie. Diese Technik ermöglicht die zuverlässige und reproduzierbare Etablierung der Organoidkultur des Hundes, einschließlich der Organoidisolierung, Wartung, Ernte und anschließenden Biobankierung von Proben. Canine Organoide können ein hervorragendes Modell für zahlreiche Anwendungen bieten, die von der Biologie über die Entwicklung von Infektionskrankheiten, die Arzneimittelprüfung und -entdeckung bis hin zur Übertragungsmedizin reichen.Bereiten Sie zunächst fünf 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit fünf Millilitern 1X kompletter Chelatlösung, ein Röhrchen mit drei Millilitern 1X kompletter Chelatlösung, ein leeres Röhrchen und ein Röhrchen mit fünf Millilitern 1X kompletter Chelatlösung und zwei Milliliter fetalem Rinderserum vor. Stellen Sie am Tag der Isolierung eine sterile Petrischale, ein Skalpell, einen Eiskübel und eine kalte fortschrittliche DMEM-Nährstoffmischung F12 in die Biosicherheitskabine. Legen Sie die erforderliche Anzahl von 24-Well-Zellkulturplatten in den Kohlendioxid-Inkubator, um sich vorzuwärmen.Legen Sie die gelöste extrazelluläre Membranmatrix zum Auftauen auf Eis. Die Zentrifuge auf vier Grad Celsius vorkühlen. Bewegen Sie komplette Medien mit Wachstumsfaktoren aus dem Gefrierschrank in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad und vermeiden Sie direkte Lichteinwirkung.Schütteln Sie Gewebeproben im Transportröhrchen für 30 Sekunden. Entfernen Sie übermäßigen Überstand, ohne Gewebe zu verwerfen, indem Sie langsam in der Nähe der Flüssigkeitsoberfläche pipettieren, bis 0,5 Milliliter in der Röhre verbleiben. Gewebe und Restgut in eine sterile Petrischale überführen.Schneiden Sie das Gewebe mit einem Einwegskalpell und zerkleinern Sie es etwa fünf Minuten lang in kleinere Stücke, die einer Maischekonsistenz ähneln. Das gehackte Gewebe mit Flüssigkeit aus der Petrischale in das erste komplette Chelatlösungsröhrchen pipettieren und dann zwei Milliliter fortschrittliche DMEM-Nährstoffmischung F12 in die Petrischale geben. Das restliche Gewebe spülen und in das erste komplette Chelatlösungsröhrchen überführen.Wirbeln Sie das 1X komplette Chelatlösungsröhrchen etwa fünfmal für fünf Sekunden auf. Lassen Sie Biopsien eine Minute lang am Boden der Röhre absetzen und entfernen Sie den Überstand, bis fünf Milliliter übrig sind. Übertragen Sie die 1X komplette Chelatlösung aus dem neuen Röhrchen in das Probenröhrchen.Wiederholen Sie den vorherigen Schritt für die folgenden beiden Röhren. Und entfernen Sie bei den letzten beiden Wäschen den Überstand auf drei Milliliter, die in der Röhre verbleiben. Übertragen Sie die Biopsien und 1X komplette Chelatlösung aus dem Probenröhrchen in eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte.Fügen Sie dem Probenröhrchen drei Milliliter 1X komplette Chelatlösung hinzu. Vorsichtig schwenken, um das verbleibende Gewebe zu sammeln und in den gleichen Brunnen der Platte zu gelangen. Fügen Sie 150 Mikroliter 0,5 molare Ethylendiamintetraessigsäure in eine Vertiefung und legen Sie die Sechs-Well-Platte auf eine 20 Grad 24 U / min Wippe bei vier Grad Celsius.Inkubieren Sie die Leberproben für 10 Minuten und die Darmproben für eine Stunde auf der beweglichen Wippe. Transportieren Sie die Sechs-Well-Platte zurück zur Biosicherheitskabine und geben Sie das gehackte Gewebe und die Flüssigkeit in ein Röhrchen, das 1X komplette Chelatlösung mit fetalem Rinderserum enthält. Lassen Sie das Gewebe absetzen und transportieren Sie den Überstand mit 0,2 Millilitern des oberen Teils des Gewebes zu einem leeren Röhrchen.Drehen Sie das Röhrchen, das die Probe bei 700 XG enthält, fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius durch. Stammzellen werden nun zusammen mit dem gehackten Gewebe pelletiert. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, um das Pellet nicht zu stören.Resuspendiert das Pellet in fortschrittlichem DMEM F12. Drehen Sie das Rohr erneut und saugen Sie den Überstand ab, ohne das Pellet zu stören. Addieren Sie das berechnete Volumen der solubilisierten extrazellulären Membranmatrix zum Probenröhrchen.Seien Sie vorsichtig beim Entfernen von Medien, um das Zellpellet nicht zu verlieren. Wenn Sie eine extrazelluläre Membranmatrix hinzufügen, pipettieren Sie langsam, um keine übermäßigen Blasen in der Organoidsuspension zu erzeugen. Halten Sie die Probe mit der gelösten extrazellulären Membranmatrix auf Eis und säen Sie die Suspension in der Mitte der Vertiefungen aus, so dass die solubilisierte extrazelluläre Membranmatrix eine kuppelartige Struktur bildet.Transportieren Sie die Platte in einen Inkubator und lassen Sie die solubilisierte extrazelluläre Membranmatrix 30 Minuten lang erstarren. Mischen Sie ROCK-Inhibitor und GSK3 beta in vollständigen Medien mit Wachstumsfaktoren und fügen Sie 500 Mikroliter dieser Lösung zu jeder Vertiefung hinzu. Legen Sie die Platte in den Inkubator.Das Organoidprotokoll des Hundes erzeugt typischerweise etwa 50.000 bis 150.000 Darm- oder Leberzellen pro Well. Nach der Isolation von Stammzellen beginnen Leberkrebs-Organoide ihren Lebenszyklus als expandierende Sphäroide, und nach sieben Tagen verwandeln sie sich in knospende und differenzierende Organoide. Das Volumen, die Oberfläche, die 2D-Ellipsenfläche und der Umfang der Sphäroide wurden berechnet.2D-Ellipsenfläche und -umfang wurden verwendet, um die Gesundheit der Organoidkultur zu beurteilen. Die Beurteilung der Expression der Marker in semiquantitativer Weise zeigte, dass die Sphäroide bevorzugt den Cholangiozytenmarker KRT7 im Bereich von eins bis 26% exprimiertenDer Stammzellmarker LGR5 Expression lag zwischen 0,17 und 0,78%, während Hepatozytenmarker in geringerem Maße bei 0,05 bis 0,34% für Forkhead Box 1A und 0,03 bis 0,28% für Cytochrom-P450 exprimiert wurden. Eine 12-minütige Inkubation mit Trypsin-ähnlicher Protease hemmte das Organoidwachstum nicht.Das Wachstum von Organoiden wurde jedoch durch eine 24-minütige Inkubation negativ beeinflusst. Die Überlebensfähigkeit von hundeförmigen Leberorganoiden in einer ungünstigen Umgebung wurde analysiert, um das Volumen der Organoidmedien und der Kellermatrix zu bestimmen, die für das erfolgreiche Wachstum und Überleben der Leberorganoide benötigt werden. Die Überlebensrate von Organoiden reichte von 12,9 Tagen bis 18 Tagen.Grundlegende Zellkulturtechniken und aseptische Ansätze sind die wesentlichen Voraussetzungen für eine ordnungsgemäße Isolierung und Wartung von Organoiden.

standardization-maintenance-3d-canine-hepatic-intestinal-organoid

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer Maus extrahepatische Gallenwege 3-dimensionale organoide Systems. Diese biliären Organellen können in Kultur Cholangiocyte Biologie gepflegt werden. Biliären Organellen express Marker der Stammvater und biliären Zellen und polarisierten epithelialen Zellen zusammengesetzt sind.

Generation von Organellen von Maus extrahepatische Gallenwege

Dreidimensionale Kulturen von Patienten-BMPC-Proben und Xenografts von Knochenmetastasierung Prostatakrebs erhalten die funktionelle Heterogenität ihrer ursprünglichen Tumoren, was zu Zysten, Sphäroiden und komplexen, tumorartigen Organoiden führt. Dieses Manuskript bietet eine Optimierungsstrategie und ein Protokoll für die 3D-Kultur heterogener Patientenproben und deren Analyse mit IFC.

Etablierung und Analyse von dreidimensionalen (3D) Organoiden, abgeleitet von Patienten prostatakrebs Knochenmetastasen Proben und ihre Xenografts

Die gesamte 3D-Struktur und der zelluläre Gehalt von Organoiden sowie ihre phänotypische Ähnlichkeit mit dem ursprünglichen Gewebe können mit dem hier beschriebenen einzelligen 3D-Bildgebungsprotokoll erfasst werden. Dieses Protokoll kann auf eine breite Palette von Organoiden mit unterschiedlichem Ursprung, Größe und Form angewendet werden.

Single-Cell Resolution Dreidimensionale Bildgebung intakter Organoide

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Kultur der Darmorganoide von Hunden in einem durchlässigen Zweikammer-Stützsystem beschreibt. Die organoide Aussaat in den durchlässigen Trägern, die Monolayer-Wartung und nachfolgende Wirkstoffpermeabilitätsexperimente werden beschrieben.

Darmorganoide für Hunde in einem durchlässigen Zweikammer-Trägersystem

Hier beschreiben wir eine Methode, um Organoide des Glioblastoms (GBM) aus primären Patientenproben oder von Patienten stammenden Zellkulturen zu erzeugen und bis zur Reife zu erhalten. Diese GBM-Organoide enthalten phänotypisch vielfältige Zellpopulationen und bilden Tumormikroumgebungen ex vivo nach.

Erhaltung der zellulären Vielfalt des menschlichen Glioblastoms ex vivo unter Verwendung dreidimensionaler Organoidkultur

Die Integration von caninen Darmorganoiden und einem mikrofluidischen Gut-on-a-Chip-System bietet relevante translationale Modelle für menschliche Darmerkrankungen. Die vorgestellten Protokolle ermöglichen eine 3D-Morphogenese und eine dynamische In-vitro-Modellierung des Darms und helfen so bei der Entwicklung wirksamer Behandlungen für Darmerkrankungen bei Hunden und Menschen mit One Health.

Dreidimensionale Morphogenese im Darm-on-a-Chip von Hunden unter Verwendung von Darmorganoiden, die von Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen stammen

Enteroide entwickeln sich zu einem neuen Modell für die Untersuchung der Gewebephysiologie und Pathophysiologie, der Arzneimittelentwicklung und der regenerativen Medizin. Hier beschreiben wir ein bovines primäres 2D-enteroides Kultursystem, das eine Co-Kultivierung mit relevanten Gewebezelltypen ermöglicht. Dieses Modell bietet einen translationalen Vorteil für die gastrointestinale Forschungsmodellierung.

Generierung eines bovinen primären enteroiden zweidimensionalen Monolayer-Kultursystems für Anwendungen in der translationalen biomedizinischen Forschung

Dieses Protokoll stellt eine optimierte zweistufige Kollagenase-Leberperfusionstechnik in einem Rattenmodell vor und zeigt die Verwendung von isolierten Hepatozyten für die in vitro Langzeitkultur von 3D-Organoiden.

Perfusion der Rattenleber und Isolierung primärer Hepatozyten: ein altes Verfahren, das für die hochmoderne 3D-Organoidkultur entscheidend ist

Diese Studie skizziert ein Protokoll zur Erzeugung von 2D-Monolayern von Schweineorganoiden, die aus dem Dünn- und Dickdarm stammen. Das Wachstum dieser Monoschichten ist durch steigende TEER-Werte gekennzeichnet, was auf eine robuste epitheliale Integrität hinweist. Darüber hinaus zeigten diese Monoschichten physiologische sekretorische Reaktionen in Ussing-Kammerexperimenten nach der Anwendung von Forskolin.

Zweidimensionale Organoide des Schweine-Darms, die die physiologischen Eigenschaften des nativen Darms widerspiegeln

Wir beschreiben eine minimal-invasive und schmerzfreie Methode, Hunde Hinterlauf der Muskelkraft und der Reaktion auf wiederholte exzentrische Kontraktionen zu messen.

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Erfahren Sie standardisierte Protokolle zur Kultur von intestinalen und hepatischen Hunde-Organoiden. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Isolation, Biobanking und Anwendung in biomedizinischer Forschung.

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