Transplantation von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Mikroglia im immunkompetenten Mäusegehirn über nicht-invasiven transnasalen Weg
31. Mai 2022
Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten menschlichen Mikroglia (iPSMG) in das Gehirn über einen transnasalen Weg bei immunkompetenten Mäusen. Die Methode zur Herstellung und transnasalen Transplantation von Zellen und die Verabreichung von Zytokinmischung zur Aufrechterhaltung von iPSMG wird gezeigt.
Dieses Protokoll ermöglicht eine nicht-invasive Transplantation von iPSMG in das immunkompetente Mäusegehirn durch Kombination eines pharmakologischen Ein- und Ausschaltens eines CSF1-Rezeptorantagonisten PLX5622 mit einer transnasalen Transplantation. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass iPSMG transplantiert werden kann, ohne Hirnschäden zu verursachen, selbst bei immunkompetenten Mäusen. Die Mikrogliatransplantation kann als mögliche Therapie dienen, um dysfunktionale Mikroglia in Zukunft bei verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen mit funktionellen auszutauschen.
Das Verfahren wird Bijay Parajuli, ein Forscher aus meinem Labor, demonstrieren. Beginnen Sie mit dem schnellen Auftauen der gefrorenen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten menschlichen Mikrogliazellen in einem 37-Grad-Celsius-Wasserbad. Schwenken Sie die Proben, bis alles sichtbare Eis geschmolzen ist.
Geben Sie das aufgetaute iPSMG in die Kulturmedien, erwärmt auf 37 Grad Celsius. Fügen Sie einen Milliliter Zellen zu 10 Millilitern Kulturmedien hinzu. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 mal g für fünf Minuten, um ein Zellpellet zu erhalten.
Entfernen Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören. Fügen Sie das Transplantationsmedium hinzu, um eine Zellkonzentration von 10 bis fünf Zellen pro Mikroliter zu erhalten. Legen Sie das iPSMG auf Eis und fahren Sie sofort mit der Transplantation fort.
Um Mäuse für die transnasale Transplantation vorzubereiten, füttern Sie die männlichen Mäuse sieben Tage lang mit einer Diät, die PLX enthält. Beenden Sie am Ende des siebten Tages die PLX-Diät und füttern Sie die Mäuse mit einer normalen Diät. Eine Stunde vor der transnasalen Transplantation von iPSMG 2,5 Mikroliter Hyaluronidase in PBS zweimal mit einer 10-Mikroliter-Pipettenspitze in PBS verabreichen, um die Durchlässigkeit der Nasenschleimhaut zu erhöhen.
Legen Sie die Mäuse nach der Hyaluronidase-Anwendung in Rückenlage. Verabreichen Sie 2,5 Mikroliter Hyaluronidase zehn Minuten vor der transnasalen Transplantation von iPSMG. Tragen Sie 2,5 Mikroliter Zellsuspension mit einer 10-Mikroliter-Pipettenspitze in ein Nasenloch der Maus auf.
Legen Sie die Maus fünf Minuten lang in Rückenlage, bevor Sie die Zellsuspension in das andere Nasenloch verabreichen. Verabreichen Sie die Zellsuspension viermal und wenden Sie ein Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern pro Tier an. Wiederholen Sie 48 Stunden nach Beendigung der PLX-Fütterung die Verabreichung von Hyaluronidase und Zellsuspension an denselben Mäusen.
Zur Verabreichung von Zytokinen 2,5 Mikroliter des Transplantationsmediums mit einer 10-Mikroliter-Pipettenspitze in ein Nasenloch der Maus auftragen. Nach zwei Monaten transnasales Transplantation kann die Anzahl der transplantierten Zellen bestimmt werden, indem Zellen gezählt werden, die sowohl für humanspezifische als auch für panmikrogliale Marker positiv sind. Endogene Mausmikroglia sind nur für pan-Mikroglia-Marker positiv.
Bei Kontrollmäusen wurden sowohl im Kortex als auch im Hippocampus nur Mausmikroglia nachgewiesen. Im Kortex von iPSMG-transplantierten Mäusen wurden nur Mausmikroglia nachgewiesen, während im Hippocampus iPSMG nachgewiesen wurden. Beim Versuch dieses Protokolls ist die vollständige Entfernung des Überstands unerlässlich, um die Verdünnung von Zytokinen zu verhindern.
Es ist wichtig, Zytokin alle 12 Stunden für die Lebensfähigkeit der transplantierten Zellen anzuwenden. Die Erschöpfung der endogenen Mausmikroglia ist für die Transplantation von iPSMG erforderlich. Dieses Verfahren ermöglicht die Transplantation von iPSMG in ein normales oder krankes Mäusegehirn.
So können die charakteristischen Eigenschaften von iPSMG sowie das Ansprechen auf Krankheiten bestimmt werden. Diese Technik eignet sich, um die in vivo Charakteristik von iPSMG im Gehirn der Maus zu bestimmen. Daher wird die Transplantation von iPSMG in Krankheitsmodellmäuse uns helfen, die Reaktion zu verstehen und kann den Weg für ein neues therapeutisches Ziel ebnen.
Übersicht
Diese Studie stellt eine nichtinvasive Methode für die Transplantation von aus induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleiteten menschlichen Mikrogliazellen (iPSMG) in das Gehirn immunkompetenter Mäuse über einen transnasalen Weg vor. Das Protokoll nutzt die Gabe von Zytokinen und den Ausfall der endogenen Mikroglia, um eine effektive Integration der iPSMG zu ermöglichen und könnte damit den Weg für therapeutische Ansätze bei neurodegenerativen Erkrankungen ebnen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Stammzellforschung
- Mikroglialbiologie
Hintergrund
- Induzierte pluripotente Stammzellen können zu funktionellen Mikrogliazellen differenziert werden.
- Eine Dysfunktion der Mikroglia ist an verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt.
- Die transnasale Applikation stellt einen neuartigen Ansatz für die Zelltransplantation dar.
- Die Gabe von Zytokinen ist entscheidend für die Zellviabilität nach der Transplantation.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode für die nicht-invasive Transplantation von Mikrogliazellen.
- Beurteilung der Durchführbarkeit der transnasalen Applikation zur Aufrechterhaltung normaler Gehirnfunktion.
- Beurteilung des Potenzials von iPSMG, dysfunktionale Mikrogliazellen zu ersetzen.
Verwendete Methoden
- Die primäre Plattform beinhaltet die transnasale Transplantation von iPSMG bei immunkompetenten Mäusen.
- Männliche Mäuse wurden vorab mit einem CSF1-Rezeptorantagonisten (PLX5622) und einer Hyaluronidaselösung behandelt, um die nasale Durchlässigkeit zu erhöhen.
- Zell suspensionen wurden in mehreren Dosen gemäß festgelegter Zeitpläne verabreicht, um eine ordnungsgemäße Integration sicherzustellen.
- Die Überwachung nach der Transplantation umfasste die Beurteilung des Vorhandenseins und der Vitalität der transplantierten Zellen.
Hauptergebnisse
- Transplantierte iPSMG wurden erfolgreich in den Maushippocampus integriert, ohne die endogenen Mikrogliazellen zu schädigen.
- Die Gabe von Zytokinen alle 12 Stunden war entscheidend für die Aufrechterhaltung der Zellviabilität nach der Transplantation.
- Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Reaktionen von iPSMG sowohl in normalen als auch in krankhaften Modellen.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll erleichtert die Untersuchung von iPSMG in vivo, was zukünftige Gentherapien bei neurodegenerativen Erkrankungen unterstützen könnte.
- Das Verständnis des Verhaltens transplantierten Mikroglia kann helfen, deren Rolle für die Gesundheit des Gehirns abzugrenzen.
- Dieser Ansatz könnte neue Wege für therapeutische Zielstrukturen bei der Behandlung mikrogliaassoziiierter Pathologien eröffnen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die nichtinvasive Transplantation von menschlichen, aus iPSCs abgeleiteten Mikrogliazellen in immunkompetente Maushirne ermöglicht die direkte in-vivo-Untersuchung der Funktion menschlicher Mikroglia und deren Reaktion auf Krankheiten. Dieser Ansatz schließt translationsrelevante Lücken zwischen Nagetier- und menschlichen Mikrogliazellen und unterstützt prädiktivere präklinische Modelle für die Forschung zu neurodegenerativen Erkrankungen. Das Protokoll verbessert die Zielvalidierung und die mechanistische Risikominderung zu frühen Zeitpunkten der Entdeckungsforschung und in präklinischen Phasen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung der menschlichen Mikroglialbiologie in vivo in einem Säugetiergehirn-Umfeld.
- Unterstützt die mechanistische Ent-Risikobewertung, indem menschenspezifische Mikroglia-Antworten von murinen Modellen unterschieden werden.
- Erleichtert die funktionelle Zielvalidierung für Signalwege der Neuroinflammation und Neurodegeneration.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet ein validiertes System zur Beurteilung der Integration und Vitalität menschlicher Mikroglia in vivo.
- Ermöglicht die reproduzierbare Quantifizierung transplantierten im Vergleich zu endogenen Mikroglia mithilfe spezifischer Marker.
- Ermöglicht die nachgeschaltete Untersuchung von Substanzen, die auf die Funktion menschlicher Mikroglia in einem physiologischen Kontext abzielen.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Abstimmung präklinischer Modelle mit der Relevanz für menschliche Erkrankungen, indem humane Mikrogliazellen in Maushirne integriert werden.
- Ermöglicht die Beurteilung der Reaktion humaner Mikrogliazellen sowohl in gesunden als auch in Mausmodellen von Erkrankungen.
- Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Entdeckung translationaler Biomarker und der Überprüfung therapeutischer Hypothesen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Protokoll verbindet die frühe Entdeckungsforschung mit der präklinischen Forschung, indem es funktionelle Studien menschlicher Mikroglia in vivo ermöglicht und somit die Identifizierung von Leitstrukturen und die translationale Kontinuität unterstützt.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur Rolle humaner Mikroglia in der Physiologie und Pathologie des Gehirns.
- Screening: Liefert quantitative Aussagen zur Zellintegration und Vitalität nach Transplantation.
- Analytik: Ermöglicht die markergestützte Unterscheidung zwischen humanen und murinen Mikroglia für eine robuste Datenanalyse.
- Translationale Forschung: Erleichtert die modellbasierte Untersuchung krankheitsrelevanter Prozesse durch die Transplantation von iPSMG in Mausmodelle mit Erkrankungen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Bewertung der Funktion humaner Mikroglia in verschiedenen Krankheitskontexten.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagegenauigkeit und verringert artspezifische Unklarheiten in der Neuroinflammationsforschung.
- Operativer Wert: Standardisiert nicht-invasive Zellapplikations- und Quantifizierungsabläufe für die Reproduzierbarkeit zwischen Studien.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundiertere Go/No-Go-Entscheidungen für mikrogliazielgerichtete Therapeutika durch die Bereitstellung menschlich relevanter Daten.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Programmen zu neurodegenerativen Erkrankungen, indem die Modelltreue verbessert wird.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Kultur von iPSCs, der mikroglialen Differenzierung und in vivo-Transplantationstechniken.
- Benötigt Zugang zu pharmakologischen Wirkstoffen zur Ausschaltung endogener Mikroglia und zur zytokinabhängigen Unterstützung.
- Setzt standardisierte Protokolle für die Zellpräparation, Transplantation und die Analyse nach der Transplantation voraus.
- Die Anpassung an andere Modellsysteme könnte eine Optimierung der Applikations- und Ausschaltungsparameter erfordern.
- Die kontinuierliche Gabe von Zytokinen ist gemäß dem Protokoll entscheidend für die Vitalität der transplantierten Zellen.
