Extraktion von Nicht-Protein-Aminosäuren aus Cyanobakterien für die Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Analyse

Dieses Protokoll wird den Benutzern helfen und den Schülern die richtigen Schritte bei der Extraktion von BMA, AEG und 2, 4-DAB beibringen. Dadurch wird die Fehlerwahrscheinlichkeit minimiert und konsistente Ergebnisse erzielt. Diese Methode ist eine häufig verwendete und validierte Methode zur Extraktion von BMA und seinen Isomeren, AEG und 2,4-DAB in einer bakteriellen Saunamatrix.

Diese Methode kann verwendet werden, um die Toxizität von BMAs weiter zu erforschen und ein besseres Verständnis über BMA und die damit verbundenen gesundheitlichen Auswirkungen zu ermöglichen. Beginnen Sie mit der Zentrifusion der Cyanobakterienprobe bei 3.500 G für 10 Minuten bei 25 Grad Celsius. Und den Überstand in biologischen Abfall zu entsorgen.

Decken Sie das Zentrifugenröhrchen mit dem Pellet mit einer Dichtungsfolie ab und stechen Sie mit einer scharfen Pinzette mit langer Nase einige Löcher in die Folie. Dann lagern Sie das Rohr aufrecht bei minus 80 Grad Celsius. Nach 30 Minuten das Rohr aufrecht in einen Gefriertrockner-Glasbehälter stellen und den Behälter für fünf Minuten zum Abkühlen in den minus 80 Grad Celsius heißen Gefrierschrank stellen.

Nehmen Sie den Glasbehälter aus dem Gefrierschrank und befestigen Sie den Gummideckel. Stellen Sie sicher, dass der Griff am Gummiventilauslass des Gefriertrockners nach oben zeigt und in die Atmosphäre entlüftet ist. Befestigen Sie den Glasbehälter fest.

Drehen Sie langsam den Griff des Gummiventilauslasses, um ihn in eine nach unten gerichtete Position zu bringen, um das Glas dem Vakuum auszusetzen. Und lassen Sie bis zu 24 Stunden Gefriertrocknung, um die gesamte Flüssigkeit zu sublimieren. Wenn Sie fertig sind, wiegen Sie 15 bis 50 Milligramm gefrorene Probenpellets in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Mit einer Analysenwaage. Zu der Probe werden 300 bis 600 Mikroliter 10% wässrige Trichloressigsäure oder TCA hinzugefügt. Legen Sie die Probenröhrchen in einen mit zerstoßenem Eis gefüllten Behälter.

Wischen Sie die Sondatorsonde mit einem fusselfreien Papiertuch ab, das mit 70% Ethanol besprüht ist, bevor Sie das Ende der Sonde vollständig in die Probe eintauchen und Start drücken. Wenn Sie fertig sind, legen Sie die Probe mit dem Zentrifugenröhrchen für eine Minute auf Eis. Und wiederholen Sie den Ultraschallprozess, um die Zelllyse sicherzustellen.

Nach dem Abkühlen der Probe bei vier Grad Celsius für 24 Stunden. Zentrifugieren bei 3.500 g für 15 Minuten bei acht Grad Celsius. Dann mit einer Mikropipette den Überstand in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen mit der Bezeichnung freie Fraktion übertragen.

Fügen Sie 400 Mikroliter 10% wässriges TCA in das Probenpellet hinzu und brechen Sie das Pellet entweder durch Wirbelrühren oder mit der Mikropipettenspitze auf. Zentrifugieren und den Überstand in dasselbe Zwei-Milliliter-Freifraktionsröhrchen überführen. Wiederholen Sie diesen Schritt ein drittes Mal mit 10% TCA-Aceton.

Legen Sie das freie Fraktionsröhrchen bei geöffnetem Deckel in einen Zentrifugalverdampfer, bis die gesamte flüchtige Flüssigkeit entfernt ist. Sobald die Probe frei von flüchtigen Flüssigkeiten ist, bedecken Sie das Röhrchen sicher mit der Deckenfolie und durchstechen Sie die Folie mit einigen Löchern mit einer scharfen langen Pinzette. Nach der zuvor demonstrierten Gefriertrocknung wird die Probe mit 200 Mikrolitern 20 Millimolarer Salzsäure rekonstituiert und in einen Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius gegeben.

Geben Sie 400 Mikroliter 100% Aceton mit einer Mikropipette auf das Probenpellet und brechen Sie das Pellet entweder durch Wirbelrühren oder die Mikropipettenspitze auf. Übertragen Sie das gewaschene und resuspendierte Pellet quantitativ in die entsprechende Glashüllendurchstechflasche. Mit einer Ein-Milliliter-Mikropipette.

Fügen Sie weitere 400 Mikroliter Aceton in das Probenröhrchen hinzu, um das verbleibende Pellet zu übertragen. Zentrifugieren und dekantieren Sie die überstehende Flüssigkeit in biologischen Abfall, bevor Sie das Pellet in einem Zentrifugalverdampfer trocknen, bis die Flüssigkeit entfernt und das Pellet trocken ist. Zur Vorbereitung der Vakuumhydrolysedatei wird ein Milliliter sechs molare Salzsäure auf den Boden der Hydrolysedatei gegeben.

Führen Sie die beschrifteten Schalenfläschchen mit getrockneten Proben vorsichtig mit einer Pinzette in die Hydrolysefeile ein, um eine aufrechte stabile Position zu gewährleisten. Befestigen Sie den Deckel an der Hydrolysedatei und drücken Sie den roten Knopf am Deckel, um das Ventil zu schließen. Nachdem Sie die Vakuumpumpe eingeschaltet haben, befestigen Sie den Vakuumschlauch am Kopf des Hydrolysedateideckels und drücken Sie den grünen Knopf auf dem Deckel, um das Ventil zu öffnen.

Lassen Sie anschließend die Vakuumpumpe die Luft für eine Minute aus der Durchstechflasche entfernen. Schließen Sie dann die Durchstechflasche, indem Sie den roten Knopf am Deckel der Hydrolysedurchstechflasche drücken. Schalten Sie die Vakuumpumpe aus und entfernen Sie den Vakuumschlauch.

Befestigen Sie einen Gummischlauch am Stickstoffgashahn auf dem Labortisch. Und öffnen Sie den Wasserhahn leicht. Legen Sie den Daumen an das Ende des Röhrchens, verschließen Sie es und zählen Sie, bis das Gas zu entweichen beginnt, wenn sich Druck aufbaut.

Als nächstes befestigen Sie das andere Ende des Gummischlauchs am Kopf des Hydrolyseflaschendeckels. Und drücken Sie sofort den grünen Knopf des Deckels. Zählen Sie die Zeit, die benötigt wird, bis das Gas entweicht.

Drücken Sie schnell den roten Knopf auf dem Deckel und entfernen Sie den Gummischlauch. Wiederholen Sie den gesamten Vakuumbehandlungsprozess zweimal. Sicherstellen, dass das Glashydrolysegefäß luftfrei und mit Stickstoffgas gefüllt ist.

Die Durchstechflasche mit Hydrolyse für 16 bis 18 Stunden in einen vorgeheizten Ofen bei 110 Grad Celsius geben. Nehmen Sie die Glashydrolyseflasche mit Ofenhandschuhen aus dem Ofen. Lassen Sie die Durchstechflasche 10 Minuten im Abzug abkühlen, bevor Sie den grünen Knopf drücken, während Sie ihn wegdrehen, um Druck und Gas abzubauen.

Rekonstituieren Sie die hydrolysierten Probenpellets mit 200 Mikrolitern 20 molar Salzsäure in die Hüllendurchstechflasche und resuspendieren Sie das Pellet. Zentrifugieren Sie die Schalenfläschchen mit den rekonstituierten Probenpellets zwei Minuten lang bei 5, 300 g und 25 Grad Celsius. Die rekonstituierten Freifraktionsproben und die Proteinfraktion werden in die beiden Milliliter-Filterröhrchen überführt, die 0,2 μm Porenmembranfilter enthalten und als freie Fraktion und Proteinfraktion gekennzeichnet sind.

Stellen Sie die Röhrchen für die Zentrifugation für 30 Minuten bei 5.000 G und 25 Grad Celsius. Das Mehrfachreaktionsüberwachungschromatogramm eines Standards, der Beta-Methylamino-L-Alanin oder BMAA und seine durch die farbcodierten Linien angegebenen Isomere enthält, ist hier dargestellt. Ein positiver Nachweis für alle drei Isomere, BMAA, DAB und AEG, wurde in der freien Fraktion der Merismopedia-Arten aus dem Liddelsee beobachtet.

Während die gebundene Fraktion der Microcystis flos-aquae-Spezies, die in Waka Waterworks gesammelt wurde, ein negatives Ergebnis für BMAA und seine Isomere zeigte. Das resuspendierte Pellet muss quantitativ in die entsprechende Schalendurchstechflasche überführt werden, um einen genauen Normalisierungspunkt basierend auf der Cyanobakterienmasse zu ermöglichen. Patienten und Due Diligence werden bei diesem Schritt beraten.

Befolgen Sie dieses Verfahren. Die extrahierten Fraktionen müssen einem Devitalisierungsschritt unterzogen werden, um eine umgekehrte Phase zu ermöglichen. Flüssigkeitschromatographie, Tandem-Massenspektrometrie-Analyse.

Die Anwendung dieser Technik erweitert verschiedene wissenschaftliche Bereiche. Einbeziehung der Umweltwissenschaften durch die Analyse von Cynotoxinen in Umweltproben. Und Bereiche wie Toxikologie und Biochemie durch die Untersuchung der Misincorporation-Theorie von BMA.