Name: Mikrofluidische Synthese von Mikrogelbausteinen für mikroporös geglühte Partikelgerüste (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Lernen Sie die mikrofluidische Synthese monodisperser Mikrogelbausteine für mikroporöse Partikelgerüste in der regenerativen Medizin. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle der Porosität und verbesserte Gewebeintegration.

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Die Autoren möchten Joe de Rutte und dem Di Carlo Lab an der University of California, Los Angeles, für ihre Unterstützung beim ursprünglichen mikrofluidischen Gerätedesign, aus dem das berichtete Gerät entwickelt wurde, sowie für ihre frühzeitige Anleitung bei der Herstellung und Fehlerbehebung von PDMS-Geräten danken. Mit Biorender.com wurden Figurenschemata erstellt.

<ol><li>Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+wound+healing+by+injectable+microporous+gel+scaffolds+assembled+from+annealed+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks.</a> Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).</li>
<li>Koh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+in+vivo+delivery+of+stem+cells+using+microporous+annealed+particle+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds.</a> Small. 15 (39), 1903147(2019).</li>
<li>Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+microislands+in+microporous+annealed+particle+scaffolds+for+accelerated+diabetic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing.</a> Advanced Functional Materials. 31 (35), 2104337(2021).</li>
<li>Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+and+spatially+patterned+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+hydrogels+for+tissue+repair+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications.</a> Advanced Science. 5 (11), 1801046(2018).</li>
<li>Isaac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microporous+bio-orthogonally+annealed+particle+hydrogels+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).</li>
<li>Pruett, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+microporous+annealed+particle+hydrogel+for+long-term+vocal+fold+augmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Development of a microporous annealed particle hydrogel for long-term vocal fold augmentation.</a> Laryngoscope. 130 (10), 2432-2441 (2020).</li>
<li>Nih, L. R., Sideris, E., Carmichael, S. T., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+microporous+annealing+particle+%28MAP%29+hydrogels+in+the+stroke+cavity+reduces+gliosis+and+inflammation+and+promotes+NPC+migration+to+the+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stroke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion.</a> Advanced Materials. 29 (32), (2017).</li>
<li>Griffin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+an+adaptive+immune+response+from+a+hydrogel+scaffold+imparts+regenerative+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing.</a> Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).</li>
<li>Sideris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+hydrogels+based+on+hyaluronic+acid+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).</li>
<li>Schaeffer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+microannealed+porous+scaffold+for+articular+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Injectable microannealed porous scaffold for articular cartilage regeneration.</a> Annals of Plastic Surgery. 84, 6S Suppl 5 446-450 (2020).</li>
<li>Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+heterogeneous+epidermal+growth+factor+release+from+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+hydrogel+for+improved+wound+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure.</a> Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).</li>
<li>Jivan, F., Alge, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-orthogonal%2C+site-selective+conjugation+of+recombinant+proteins+to+microporous+annealed+particle+hydrogels+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Bio-orthogonal, site-selective conjugation of recombinant proteins to microporous annealed particle hydrogels for tissue engineering.</a> Advanced Therapeutics. 3 (1), 1900148(2020).</li>
<li>de Rutte, J. M., Koh, J., di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+high-throughput+production+of+modular+microgels+for+in+situ+assembly+of+microporous+tissue+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds.</a> Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071(2019).</li>
<li>Pfaff, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+improved+photoannealing+of+microporous+annealed+particle+%28MAP%29+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Selective and improved photoannealing of microporous annealed particle (MAP) scaffolds.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).</li>
<li>Darling, N. J., Hung, Y. S., Sharma, S., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+kinetics+of+thiol-maleimide+Michael-type+addition+gelation+kinetics+for+the+generation+of+homogenous+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlling the kinetics of thiol-maleimide Michael-type addition gelation kinetics for the generation of homogenous poly(ethylene glycol) hydrogels.</a> Biomaterials. 101, 199-206 (2016).</li>
<li>Sandell, J. L., Zhu, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+in-vivo+optical+properties+of+human+tissues+and+its+impact+on+PDT%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">A review of in-vivo optical properties of human tissues and its impact on PDT.</a> Journal of Biophotonics. 4 (11-12), 773-787 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Synthese und Charakterisierung von Mikrogelen, die als Bausteine für mikroporöse geglühte Partikel (MAP)-Gerüste dienen. Dieses Protokoll verwendet einen mikrofluidischen Hochdurchsatzansatz, um große Mengen einheitlicher Mikrogele zu erzeugen, was mit anderen Methoden wie der strömungsfokussierenden Mikrofluidik 1,4,7,9 (hohe Monodisperistie, geringe Ausbeute), Batchemulsion 6,10 und Elektrospritzen 5,12 nicht erreicht werden kann. (geringe Monodispersität, hohe Ausbeute). Mit den hierin beschriebenen Verfahren können monodisperse Mikrogele zur Verwendung in MAP-Gerüsten hergestellt werden, die für eine Vielzahl von Anwendungen der regenerativen Medizin (z. B. Zellabgabe, Wundheilung) verwendet werden können.
Ein kritischer Schritt dieses Protokolls ist die Entwicklung der PDMS-Mikrofluidik-Geräte. Wenn die Geräte nicht korrekt hergestellt werden, könnte dies negative nachgeschaltete Auswirkungen auf die Mikrogelbildung und Monodispersität haben. Es ist wichtig, das Einbringen von Artefakten (z. B. Blasen, Staub) in das PDMS zu verhindern, bevor es aushärtet, da dies die Kanäle verstopfen und die Mikrogelbildung erheblich beeinträchtigen könnte. Um dies so weit wie möglich zu mildern, sollte man Klebeband verwenden, um Staub zu entfernen, die Geräte in einem staubfreien Behälter zu lagern und wenn möglich in einer staubfreien Haube zu arbeiten. Es wird auch empfohlen, die Geräte bei 60 °C zu lagern, um die besten Ergebnisse mit der Oberflächenbehandlung zu erzielen.
Beim Gießen der PDMS-Geräte ist es wichtig, eine gleichmäßige Dicke beizubehalten, die etwa gleich oder kleiner als die Länge des Biopsiestempels ist. Wenn das Gerät zu dick ist, kann der Biopsiestempel nicht vollständig durchdringen. Es ist auch wichtig, dass die Einlässe / Auslässe des PDMS-Geräts beim Stanzen mit dem Biopsiestempel und / oder beim Einführen des Schlauchs nicht gerissen werden. Ein Riss im PDMS-Gerät führt zu einem Auslaufen aus den Einlässen / Ausgängen, was zum Verlust der Gelvorläuferlösung führen kann. Wenn ein PDMS-Gerät undicht ist, ist die beste Lösung, es so schnell wie möglich durch ein neues Gerät zu ersetzen.
Bei der Plasmabehandlung des Gerätes hat die Verwendung von reinem Sauerstoff und die Plasmabehandlung für 30 s die besten Ergebnisse für die Verklebung von PDMS auf dem Objektträger erzielt. Wenn das Gerät nicht richtig haftet (d. h. das PDMS kann nach der Plasmabehandlung immer noch vom Glasobjektträger abgehoben werden), sollte überprüft werden, ob das Plasmabehandlungsgerät ordnungsgemäß funktioniert und ob das Gerät und die Objektträger gründlich gereinigt wurden. Es ist auch wichtig, die richtige Silanoberflächenbehandlung zu verwenden, und für beste Ergebnisse sollten die PDMS-Geräte direkt vor der Verwendung oberflächenbehandelt werden. Andere Methoden der Oberflächenbehandlung, wie die chemische Gasphasenabscheidung, könnten ebenfalls verwendet werden.
Ein weiterer entscheidender Schritt ist der korrekte Einsatz der PDMS-Mikrofluidik-Geräte zur Mikrogelbildung. Es wird empfohlen, ein Durchflussverhältnis von mindestens 2: 1 zu verwenden (dieses Protokoll verwendet eine Öldurchflussrate von 6 ml / h und eine wässrige Durchflussrate von 3 ml / h), aber dies kann abgestimmt werden, um die gewünschte Mikrogelgröße zu erreichen. Der pH-Wert der Mikrogel-Vorläuferlösung ist ebenfalls eine wichtige Metrik, die optimiert werden muss, um ein Verstopfen des Geräts zu vermeiden. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) beschleunigt die Thiolatbildung in der Michael-Typ-Additionschemie, und die in diesem Protokoll verwendeten PBS-Konzentrationen liefern die besten Ergebnisse für die Mikrogelgelierung in den mikrofluidischen Geräten. Sobald die Spritzenpumpen gestartet sind, kann es einige Blasen in den mikrofluidischen Kanälen geben, aber dies sollte sich nach einigen Minuten ausgleichen. Es wird empfohlen, die Mikrogelbildung mit einem Mikroskop zu überwachen. Wenn die Strömung nicht ähnlich aussieht wie in diesem Video und/oder es einige Kanäle gibt, die große Partikel produzieren, ist dies wahrscheinlich auf Probleme mit dem Oberflächenbehandlungsschritt zurückzuführen. Die beste Lösung ist, das Gerät durch ein frisch oberflächenbehandeltes Gerät zu ersetzen.
Wenn die Mikrogele zu koaleszieren scheinen, kann dies auf eine unzureichende Konzentration von Fluortensid zurückzuführen sein. Die empfohlene Lösung besteht darin, den Gew.-% des Tensids in der Ölphase zu erhöhen. Eine Einschränkung bei der Verwendung hoher Tensidkonzentrationen besteht jedoch darin, dass es schwieriger sein kann, es während des Reinigungsschritts zu entfernen. Es wird empfohlen, mikrofluidische Geräte nur einmal zu verwenden, aber die Geräte können wiederverwendet werden, wenn sie sofort nach Gebrauch mit Novec-Öl gespült werden, um wässrige Lösung zu entfernen, die im Gerät gelieren und die Kanäle verstopfen könnte. Während ein mikrofluidisches Gerät ein Hochdurchsatzvolumen von Mikrogelen (ml / h) produzieren kann, kann diese Produktionsrate skaliert werden, indem mehrere mikrofluidische Geräte parallel verwendet werden.
Der Glühschritt der MAP-Gerüstmontage beruht auf der Verwendung eines lichtaktivierten Photoinitiators der radikalischen Polymerisation, und der Photoinitiator kann basierend auf der gewünschten Anwendung ausgewählt werden. Zum Beispiel hat der LAP-Photoinitiator schnelle Glühzeiten (<30 s), wenn langwelliges UV-Licht verwendet wird, was einen minimalen Einfluss auf die Zelllebensfähigkeit in vitrohat 14. Diese Wellenlänge wird jedoch stark vom Gewebe16 absorbiert und hat möglicherweise in vivo keine so hohe Glühwirkung wie in vitro.
Eosin Y ist ein weiterer Photoinitiator, der durch sichtbare Wellenlängen (505 nm) aktiviert wird und tiefer in das Gewebe eindringt, was die Fähigkeit des MAP-Gerüsts verbessert, unter dem Gewebe geglüht zu werden. Die langen Lichtexpositionszeiten, die für das Eosin-Y-Glühen erforderlich sind, können jedoch die Zellexposition gegenüber freien Radikalen verlängern und die Lebensfähigkeit der Zellen in vitro beeinträchtigen 14. Die Verwendung dieser Methoden zur Hochdurchsatzerzeugung von hochgleichmäßigen Mikrogel-Bausteinen wird die auf MAP-Gerüste ausgerichtete Forschung beschleunigen und das Wissen auf dem Gebiet der injizierbaren porösen Materialien für die regenerative Medizin erweitern.

Die MAP-Gerüstplattform ist ein injizierbares Biomaterial, das vollständig aus Hydrogel-Mikropartikeln (Mikrogelen) besteht, die Mikroporosität im Zellmaßstab liefern, wenn sie miteinander vernetzt sind, was eine abbauunabhängige Zellmigration und Massengewebeintegration ermöglicht1. Aufgrund ihrer Fähigkeit, sich schnell in das Wirtsgewebe zu integrieren, und ihrer inhärent geringen Immunogenität hat die MAP-Gerüstplattform ihre präklinische Anwendbarkeit für eine Vielzahl von Therapien der regenerativen Medizin gezeigt 2,3,4,5,6,7,8,9,10, einschließlich der Beschleunigung der dermalen Wundheilung 1,3 ,11, Revaskularisierung der Hirnschlaghöhle7, Abgabe mesenchymaler Stammzellen2 und Bereitstellung von Gewebefüllstoffen zur Behandlung von glottischer Insuffizienz6. Es wurde auch gezeigt, dass MAP durch die Rekrutierung von M2-Makrophagen entzündungshemmende Wirkungen auf das Wirtsgewebe vermittelt 3 und sogar so eingestellt werden kann, dass es eine Th2-Immunantwort "Gewebereparatur" fördert8. Diese günstigen Eigenschaften der MAP-Gerüstplattform ermöglichen es, sie auf ein breites Spektrum klinischer Anwendungen auszuweiten.
Bisher veröffentlichte Methoden zur Erzeugung von Mikrogelen für die MAP-Gerüstbildung umfassen die strömungsfokussierende Tröpfchenmikrofluidik 1,4,7,9, Elektrospritzen 5,12 und Überkopfspinnen mit Batchemulsion 6,10. Die tropfenmikrofluidische Methode kann Partikel mit hoher Monodispersität erzeugen, verwendet jedoch sehr langsame Flussraten, die geringe Partikelausbeuten (μL / h) erzeugen. Alternativ können die Elektrospritz- und Batch-Emulsionsverfahren ein hohes Partikelvolumen mit hoher Partikelpolydispersität erzeugen. Dieses Protokoll verwendet eine mikrofluidische Hochdurchsatzmethode zur Herstellung von Mikrogelen mit einer monodispersen Population, basierend auf Arbeiten von de Rutte et al13. Diese Methode verwendet weiche Lithographietechniken, um aus einer Fotomaske ein mikrofluidisches Gerät für Polydimethylsiloxan (PDMS) herzustellen, das dann mit einem Objektträger verbunden wird. Das Gerätedesign beruht auf einer Schrittemulgierung, um ein hohes Volumen an Mikrogelpartikeln (ml/h) zu erzeugen. Die Monodispersität, die mit dieser Methode erreicht werden kann, bietet eine bessere Kontrolle der Porosität im Vergleich zu anderen Techniken, da monodisperse Mikrogele Gerüste mit gleichmäßigeren Porengrößen bilden können2.
Die Methoden zur Synthese und Charakterisierung der einzelnen Mikrogele, die als Bausteine für MAP-Gerüste dienen können, werden in diesem Manuskript beschrieben, insbesondere im Hinblick auf die Herstellung von Mikrogelen, die aus einem PEG-Rückgrat mit einer Maleimidgruppe (MAL) bestehen, die leicht an einer effizienten Michael-Typ-Addition mit thiolfunktionalisierten Vernetzern für die Mikrogelgelierung beteiligt ist. Um die Mikrogelgelierung vom MAP-Gerüstglühen zu entkoppeln, beschreibt dieses Manuskript auch, wie ein veröffentlichtes14 kundenspezifisches Glühmakromer, MethMAL, synthetisiert wird, bei dem es sich um ein heterofunktionelles Methacrylamid / Maleimid-4-armiges PEG-Makromer handelt. Die funktionellen Methacrylamidgruppen nehmen leicht an der radikalischen Photopolymerisation (für das Mikrogelglühen) teil, bleiben aber relativ inert gegenüber den Bedingungen, die die Michael-Typ-Addition für die funktionellen MAL-Gruppen fördern.
Darüber hinaus beschreibt dieses Manuskript die Protokolle zur Herstellung mikrofluidischer PDMS-Geräte, zur Bestimmung der Mikrogel-Gelierungskinetik und zur Charakterisierung der Mikrogelgröße. Der letzte Teil des Manuskripts beschreibt das MAP-Gerüstglühen, bei dem die Mikrogele in situ durch einen sekundären, photoinitiierten Vernetzungsschritt, der die Oberflächen der Mikrogele kovalent miteinander verbindet, in ein Massengerüst überführt werden. Es ist wichtig zu beachten, dass es andere Glühmethoden gibt, die in MAP-Gerüstsystemen implementiert werden können, die nicht auf lichtbasierte Chemikalien angewiesen sind, wie z. B. enzymvermitteltes Glühen, wie zuvor beschrieben1. Insgesamt können diese Methoden direkt oder mit verschiedenen Hydrogel-Formulierungschemikalien (z. B. Hyaluronsäure-basiert) verwendet werden, um MAP-Gerüste für jede Anwendung zu erzeugen.

<table><tbody><tr><td>2-Aminoethanthiolhydrochlorid</td><td>Acros Organics</td><td>AC153770250</td><td>für die MethMalsynthese MW: 113,61 Da</td></tr><tr><td>35 mm Plattenrotor</td><td>HAAKE</td><td>P35/Ti</td><td>Geometrie für HAAKE Viskosimeter</td></tr><tr><td>4-armiges PEG-Maleimid (10 kDa)</td><td>NOF AMERICA Corporation</td><td>SUNBRIGHT PTE-100MA</td><td>Für Mikrogel-Vorläuferlösung</td></tr><tr><td>4-armiges PEG-Maleimid (20 kDa)</td><td>NOF AMERICA Corporation</td><td>SUNBRIGHT PTE-200MA</td><td>Für die Methmalsynthese Spezifisches Molekulargewicht für jede Charge</td></tr><tr><td>BD-Spritze mit Luer-Lok-Spitzen</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Einwegspritzen</td></tr><tr><td>aus Kunststoff Biopsie-Stanze</td><td>Mitex</td><td>MLTX33-31A-P/25</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform-d</td><td>Acros Organics</td><td>AC209561000</td><td>für die MethMal-Synthese</td></tr><tr><td>Kollimiertes LED-Licht Quelle</td><td>ThorLabs</td><td>M365LP1-C1</td><td>365 nm</td></tr><tr><td>Kulturschale (15 cm)</td><td>Corning</td><td>CLS430599</td><td>150 mm x 25 mm</td></tr><tr><td>DMTMM(4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl-morpholiniumchlorid)</td><td>Oakwood Chemical 151882</td><td></td><td>für die MethMal-Synthese MW: 276,72 Da</td></tr><tr><td>Fluorotenside</td><td>Ran Technologies</td><td>008-Flurosurfactant-5wtH-200G</td><td>5 Gew.-% von 008- Fluorotensid in HFE7500</td></tr><tr><td>FreeZone Triad Freeze Dry System</td><td>Labconco</td><td>7400000 Serie</td><td>für die MethMalsynthese Lyophilisator</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>Objektträger aus Normalglas, unbeschichtet</td></tr><tr><td>HAAKE Rheowin Viskosimeter</td><td>HAAKE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Version 1.8.0_172</td></tr><tr><td>KDS Legato 210 Doppelzinkenspritze Pumpe</td><td>Kd Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LED-Treiber</td><td>ThorLabs</td><td>DC2200</td><td></td></tr><tr><td>Lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat (LAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900889</td><td>Photoinitiator</td></tr><tr><td>Methacrylsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>155721</td><td>für die MethMal-Synthese MW: 86,09 Da Dichte: 1,015 g/ml</td></tr><tr><td>Mikrofluidisches Gerät SU8-Si Master-Wafer</td><td>FlowJem</td><td>N/A</td><td>Maßgeschneiderte, mit Silanisierung</td></tr><tr><td>MMP-2 abbaubarer Vernetzer</td><td>FlowJem</td><td></td><td>Sequenz: Ac-GCGPQGIAGQDGCG-NH2</td></tr><tr><td>Nadeln (25 G, abgeschrägt)</td><td>BD</td><td>305122</td><td>Länge: 15,88 mm Dicke: 0,5 mm</td></tr><tr><td>Novec 7500</td><td>3M</td><td>7100025016</td><td>fluoriertes Öl</td></tr><tr><td>Sauerstoff</td><td>Praxair</td><td>UN1072</td><td>Komprimierter</td></tr><tr><td>Peek-Schlauch</td><td>Trajan Scientific</td><td>03-350-523</td><td>1/32" Außendurchmesser; 0,02" Innendurchmesser; 10' Länge</td></tr><tr><td>PFOCTS (Trichlor(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)silan)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td>Zur Oberflächenbehandlung</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Fisher BioReagants</td><td>BP3994</td><td>1x verdünnt in Reinstwasser, pH = 7,4</td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001-HP</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklinge</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>RGD Zell-Adhäsionspeptid</td><td>WatsonBio Sciences</td><td></td><td>Sequenz: Ac-RGDSPGGC-NH2</td></tr><tr><td>Rheowin Software</td><td>HAAKE&nbsp;</td><td></td><td>Software kompatibel mit HAAKE Viskosimeter</td></tr><tr><td>Skalpellklinge</td><td>Bard-Parker</td><td>371210</td><td>Größe: #10</td></tr><tr><td>Skalpellgriff</td><td>Bard-Parker</td><td>371030</td><td>Größe: #3</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP358-1</td><td>Für die MethMalsynthese MW: 58,44 Da</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silikonelastomer Kit</td><td>DOW Chemical</td><td>2065622</td><td>Base und Härter</td></tr><tr><td>Triethylamin</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4884-100</td><td>für die MethMalsynthese MW: 101,19 Da Dichte: 0,73 g/ml</td></tr><tr><td>Tygon-Schlauch</td><td>Saint Gobain Performance Plastics</td><td>AAD04103</td><td>ID: 0,51 mm OD: 1,52 mm</td></tr><tr><td>Varian Inova 500 Spektrometer</td><td>Varian</td><td></td><td>NMR befindet sich in der UVA Biomolecular Magnetic Resonance Facility</td></tr></tbody></table>

mikrofluidische synthese von mikrogelbausteinen für mikroporös geglühte partikelgerüste

Microfluidic Synthesis of Microgel Building Blocks for Microporous Annealed Particle Scaffold

Die MAP-Gerüstplattform (Microporous Annealed Particle Scared) ist eine Unterklasse von granularen Hydrogelen. Es besteht aus einer injizierbaren Aufschlämmung von Mikrogelen, die nach einem sekundärlichtbasierten chemischen Vernetzungsschritt (d. H. Glühen) ein strukturstabiles Gerüst mit Porosität im Zellmaßstab in situ bilden können. MAP-Gerüst hat sich in einer Vielzahl von Anwendungen der regenerativen Medizin bewährt, einschließlich dermaler Wundheilung, Stimmlippenvergrößerung und Stammzellabgabe. Dieser Artikel beschreibt die Methoden zur Synthese und Charakterisierung von Polyethylenglykol (PEG)-Mikrogelen als Bausteine zur Bildung eines MAP-Gerüsts. Diese Methoden umfassen die Synthese eines kundenspezifischen Glühmakromers (MethMAL), die Bestimmung der Mikrogelvorläufergelationskinetik, die Herstellung mikrofluidischer Bauelemente, die mikrofluidische Erzeugung von Mikrogelen, die Mikrogelreinigung und die grundlegende Charakterisierung von Gerüsten, einschließlich Mikrogeldimensionierung und Gerüstglühen. Insbesondere können die hierin beschriebenen mikrofluidischen Hochdurchsatzmethoden große Mengen an Mikrogelen herstellen, die zur Erzeugung von MAP-Gerüsten für jede gewünschte Anwendung, insbesondere im Bereich der regenerativen Medizin, verwendet werden können.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, alle Schritte zu skizzieren, die für die Synthese von Mikrogelbausteinen erforderlich sind, die in einem MAP-Gerüst verwendet werden. Das MethMAL-Glühmakromer ist hochselektiv und effizient und mit mehreren Polymer-Backbones kompatibel14. Wichtig ist, dass mindestens 67%-75% des 20 kDa PEG-Maleimids mit funktionellen Methacrylamidgruppen modifiziert werden, um eine hohe Glüheffizienz zu gewährleisten. Die prozentuale Modifikation kann am einfachsten durch die Analyse von 1 H-NMR-Spektrenpeaks bestimmt werden, wie in Abbildung 1 dargestellt. Die Gelierungskinetik, die durch ein Viskosimeter bestimmt wird, ist eine wichtige Metrik, die für jede Gelformulierung zu berücksichtigen ist. Dieses Protokoll verwendet eine Gelvorläuferlösung, die aus einem PEG-Rückgrat mit einer MAL-Gruppe besteht, die effizient mit thiolfunktionalisierten Vernetzern für die Mikrogelgelierung reagiert. Viele Hydrogel-Chemikalien können jedoch verwendet werden, um Mikrogele über das hierin beschriebene mikrofluidische Hochdurchsatzverfahren herzustellen. Die Zeit bis zum Beginn der Gelierung gibt Aufschluss über die Dauer der mikrofluidischen Mikrogelbildung. Es wird empfohlen, einen pH-Wert der Gelvorstufe zu wählen, der die Gelierung zwischen 30 min (Abbildung 2) und 2 h initiieren kann.
Wenn die Gelierungszeit zu schnell ist, beginnt die Gelvorläuferlösung innerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung zu polymerisieren und die Kanäle zu verstopfen. Darüber hinaus ist es wichtig zu beachten, dass sich ändernde thiolierte Ligandenkonzentrationen (z. B. RGD) Auswirkungen auf die Netzwerkbildung während der Gelierung haben können und möglicherweise durch Anpassung der Formulierung berücksichtigt werden müssen. Die Schritte zur Herstellung mikrofluidischer Bauelemente können mühsam sein, aber repräsentative Ergebnisse eines erfolgreich verklebten Geräts sind in Abbildung 3 dargestellt. Dieses Protokoll verwendet ein parallelisiertes Mikrofluidisierungsgerät mit hohem Durchsatz, das nach einem Design von de Rutte et al.13 adaptiert wurde, und die Herstellung von Siliziumwafern wurde an ein mikrofluidisches Technologieunternehmen ausgelagert. Die in diesem Protokoll beschriebenen Schritte können jedoch mit jedem Gerätedesign verwendet werden, das auf einer SU-8-Siliziumwafer-Fotomaske geätzt ist. Es ist wichtig zu beachten, dass die Schrittweite der Kanäle auf der Fotomaske während der Geräteherstellung optimiert werden muss, da dies die Größe der Mikrogelpartikel beeinflusst.
Die Durchflussraten für die mikrofluidische Erzeugung von Mikrogelen sollten für jede Gelformulierung basierend auf Faktoren wie Gelierzeit, gewünschter Partikelgröße und mikrofluidischem Gerätedesign optimiert werden. Bei Verwendung des Hochdurchsatzgeräts können die Durchflussraten für die wässrige Phase bis zu 5 ml / h betragen. Abbildung 4B zeigt den Aufbau für Geräte mit hohem Durchsatz, die in diesem Protokoll verwendet werden. Wenn das Gerät korrekt läuft, sollte die Mikrogelbildung ähnlich wie in Abbildung 4D aussehen. Vor der Reinigung sind die Mikrogele undurchsichtig. Nach Abschluss der verschiedenen Öl-, PBS- und Hexanwäschen sollte das Gel wie das repräsentative Bild in Abbildung 5 klar aussehen. Wenn ein Fluorophor in die Mikrogele eingebaut wird, kann das gereinigte Produkt eine leichte Färbung haben, sollte aber immer noch nahezu durchscheinend sein. Nach der Reinigung und Quellung sollten die Mikrogele eine sehr gleichmäßige Größe haben und einen PDI zwischen 1,00 und 1,05 aufweisen, wie in Abbildung 6 dargestellt. Verschiedene Photoinitiatoren können zum Photoglühen von MAP-Gerüsten verwendet werden. Wenn eine Alternative zu LAP verwendet wird, die hierin beschrieben wird, muss man die Glühkinetik wie zuvor beschriebenbestimmen 14. Zusätzlich können verschiedene Lichtquellen zum Photoglühen verwendet werden, sofern die Lichtquelle mit dem Photoinitiator übereinstimmt. Man muss darauf achten, die Lichtquelle zu kalibrieren und zu fokussieren. Die Glühzeit und Lichtintensität müssen möglicherweise basierend auf der Gelformulierung und der Photoinitiatorkonzentration optimiert werden. Das in diesem Protokoll beschriebene Glühverfahren kann für In-vitro- und In-vivo-Studien verwendet werden. Nach dem Glühen bilden die Mikrogele ein poröses Gerüst, das mit Zwei-Photonen-Mikroskopie sichtbar gemacht werden kann (Abbildung 7B-C).

Dieses Protokoll beschreibt eine Reihe von Methoden zur Synthese der Mikrogelbausteine für mikroporös geglühte Partikelgerüste, die für eine Vielzahl von Anwendungen der regenerativen Medizin verwendet werden können.

Mikrofluidische Synthese von Mikrogelbausteinen für mikroporös geglühte Partikelgerüste

The microporous annealed particle (MAP) scaffold platform is a subclass of granular hydrogels. It is composed of an injectable slurry of microgels that ...

Die Hochdurchsatzherstellung von monodispersen Mikrogelbausteinen für mikroporös geglühte Partikelgerüste bietet eine verbesserte Kontrolle der Gerüstporosität. Dies kann sich auf die Porengröße und die nachfolgenden Gewebeintegrationsergebnisse auswirken. Dieses Protokoll verwendet einen mikrofluidischen Ansatz mit hohem Durchsatz, um große Mengen an monodispersen Mikrogelen zu erzeugen, die mit anderen Methoden wie strömungsfokussierender Mikrofluidik, Batch-Emulsion und Elektrospritzen nicht erreicht werden können.Die erzeugten Mikrogele können zu mikroporös geglühten Partikelgerüsten geformt werden, die aufgrund der Porosität im Zellmaßstab, die ein schnelles Gewebe und Wachstum ermöglicht, für Anwendungen der regenerativen Medizin von Vorteil sind. Beginnen Sie mit der Vorbereitung eines Glasobjektträgers pro PDMS-Mikrofluidikgerät. Verwenden Sie Klebeband, gefilterte Luft oder Isopropylalkoholwäschen, um Staub vom Objektträger zu entfernen.Legen Sie einen Objektträger in einem PDMS-Gerätedesign nebeneinander auf einen 96-Well-Plattendeckel und legen Sie ihn in einen Plasmareiniger. Schließen Sie die Tür und das Luftstromventil und schalten Sie die Vakuumpumpe ein. Lassen Sie es mindestens 30 Sekunden laufen und schalten Sie es dann aus.Verbinden Sie den Sauerstofftankgasschlauch mit dem Luftstromventil. Lassen Sie die Plasmakammer 30 Sekunden lang mit Sauerstoff füllen, schalten Sie dann den Sauerstoff aus und schließen Sie das Luftstromventil. Schalten Sie die Vakuumpumpe ein und stellen Sie den Hochfrequenzpegel auf hoch.Warten Sie, bis die Kammer violettrosa Farbe annimmt, und lassen Sie 30 Sekunden verstreichen. Wenn der Timer ausgeht, schalten Sie das Plasma und das Vakuum aus und öffnen Sie dann langsam das Luftstromventil, um das Vakuum freizugeben. Nehmen Sie das Fach aus dem Plasmareiniger.Drehen Sie das PDMS-Gerät vorsichtig auf den Glasobjektträger, um sie zu verkleben. Beachten Sie während der Verklebung den leichten Unterschied in der Transparenz des PDMS. Für beste Ergebnisse lagern Sie die geklebten Geräte bei 60 Grad Celsius bis unmittelbar vor Gebrauch.Bereiten Sie die Oberflächenbehandlung vor, indem Sie PFOCTS und Novec-Öl verdünnen und einen Milliliter für drei bis vier Geräte verwenden. Übertragen Sie das Volumen auf eine Ein-Milliliter-Spritze und befestigen Sie eine 25-Gauge-Nadel. Schneiden Sie ein 10 bis 12 Zentimeter großes Stück Tygon-Schläuche pro Gerät ab.Schneiden Sie ein Stück PEEK-Schlauch von etwa einem Zoll Länge ab. Führen Sie ein paar Millimeter des PEEK-Schlauchs in das Ende des Tygon-Schlauchs ein, um zu verhindern, dass die Nadel die Tygon-Schlaucheinlässe durchsticht. Nehmen Sie die Geräte aus der beheizten Kammer und führen Sie das Nicht-PEEK-Ende des Tygon-Rohrs in das wässrige Einlassloch ein.Führen Sie die Nadel der Oberflächenbehandlungsspritze in den PEEK-Schlauch ein und decken Sie das Ölkammerauslassloch ab. Injizieren Sie die Behandlung langsam und stellen Sie sicher, dass sie das Gerät ohne Blasen füllt. Warten Sie, bis sich zuerst die wässrigen Kammern gefüllt haben, gefolgt von den kleineren Kanälen und dann der Ölkammer.Entfernen Sie den Tygon-Schlauch vom Gerät. Sobald das Gerät gefüllt ist, lassen Sie es 10 Minuten bei Raumtemperatur ruhen. Füllen Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze nur mit Öl und befestigen Sie eine 25-Gauge-Nadel.Saugen Sie die Oberflächenbehandlung durch die Ein- und Auslässe aus dem Gerät ab. Führen Sie Tygon-Schläuche in den wässrigen Einlass ein. Führen Sie die Spritze mit Öl in den PEEK-Schlauch ein und spülen Sie jedes Gerät mit Öl.Saugen Sie das Öl aus dem Gerät ab. Wiederholen Sie die Ölspülung zweimal und entfernen Sie den Tygon-Schlauch. Führen Sie das Nicht-PEEK-Ende des Tygon-Schlauchs in die Einlässe der mikrofluidischen Geräte ein.Führen Sie das restliche Stück Tygon-Schläuch ohne PEEK-Schlauch am Ende in den Ausgang des mikrofluidischen Geräts ein. Fügen Sie mindestens drei Milliliter Öl zu einer Fünf-Milliliter-Kunststoffspritze hinzu und befestigen Sie sie an einer 25-Gauge-Nadel. Führen Sie die Nadel vorsichtig in den PEEK-Schlauch an einem der Tygon-Einlässe ein.Spülen Sie den Schlauch und das Gerät vorsichtig mit Öl. Sammeln Sie das Öl aus dem Auslass in einem konischen Rohr. Wiederholen Sie die Ölspülung am anderen Tygon-Einlass.Stellen Sie die Spritzenpumpen auf die gewünschten Durchflussraten ein. Verbinden Sie die Spritze mit dem Tensid über eine 25-Gauge-Nadel mit dem Öleinlass und dosieren Sie vorsichtig genug Öl, um den Schlauch und den Ölkanal des mikrofluidischen Geräts zu grundieren. Sobald das Gerät und die Öleinlässe eingerichtet sind, fügen Sie 0,5 Milliliter Öl zu einer neuen Fünf-Milliliter-Spritze hinzu, die den Gelvorläufer enthält.Verwenden Sie diese kleine Menge Öl, um die Vorläuferlösung durch das mikrofluidische Gerät zu spülen. In einem konischen Röhrchen werden 1,5 Milliliter der PEG-Rückgratlösung und 1,5 Milliliter der Vernetzerlösung kombiniert. 30 Sekunden lang vorziehen und die kombinierte Gelvorläuferlösung schnell in die Fünf-Milliliter-Spritze überführen.Verbinden Sie die Spritze mit der Gelvorläuferlösung über eine 25-Gauge-Nadel mit dem wässrigen Einlass. Dosieren Sie vorsichtig genug Lösung, um den Schlauch und den wässrigen Kanal zu grundieren. Klemmen Sie die Spritzen auf die Spritzenpumpen und drücken Sie den Lauf.Suchen Sie nach Partikeln einheitlicher Größe aus den Kanälen. Sammeln Sie die Mikrogele aus dem Auslass in einem konischen Röhrchen. Sobald die Gelierung abgeschlossen ist, verwenden Sie eine Pipette, um die Ölphase vorsichtig vom Boden des Röhrchens zu entfernen.Legen Sie diese in einen geeigneten Abfallbehälter für fluorierte Abfälle. Fügen Sie mehr Öl in das Mikrogel-Sammelröhrchen hinzu. Mischen Sie, indem Sie das Sammelrohr vorsichtig umdrehen.Lassen Sie das Sammelröhrchen fünf Minuten ruhen, damit sich die Phasen trennen können. Suchen Sie nach der Ölphase unten und der wässrigen Mikrogelphase oben. Wiederholen Sie die Ölwäschen mindestens zweimal mehr.Fügen Sie mehr Öl mit dem Gel hinzu, wie zuvor gezeigt, und fügen Sie dann PBS zum Gel hinzu. Mehrmals umkehren, um zu mischen. Um die Schichten zu trennen, zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 2.000 RCF für etwa 30 Sekunden.Suchen Sie nach der Ölphase am Boden des Röhrchens, Gel in der Mitte und PBS oben. Entfernen Sie die Ölphase mit einer Pipette und entsorgen Sie sie in einem Abfallbehälter. Öl wiederholen und PBS zweimal waschen.Suchen Sie nach dem Gel, um durch die letzte Wäsche von undurchsichtig zu klar überzugehen. Entfernen Sie das gesamte Öl. Entfernen Sie PBS nicht aus dem konischen Rohr.Verwenden Sie in einem chemischen Abzug eine Glaspipette, um dem Rohr Hexane in einem gleichen Volumen wie das PBS hinzuzufügen. Wirbeln Sie das konische Rohr für 30 Sekunden oder bis es gründlich gemischt ist. Zentrifugieren Sie bei 4, 696 RCF für fünf Minuten.Suchen Sie nach der Trennung nach Hexanen in der oberen Schicht, PBS in der Mitte und Gel in der Unterseite. Entfernen Sie die Hexanschicht und entsorgen Sie sie in einem Behälter für organische Abfälle. Saugen Sie die PBS ab.Wiederholen Sie Hexan in PBS-Waschungen mindestens zweimal oder bis das Gel fast durchscheinend erscheint. Waschen Sie das Gel erneut mit PBS, um verbleibende Hexanrückstände zu entfernen. Zentrifugieren Sie bei 4, 696 RCF für fünf Minuten und saugen Sie die PBS-Schicht ab.Etwa 67-75% des 20 Kilodalton PEG-Maleimids wurden mit funktionellen Methacrylamidgruppen modifiziert, um eine hohe Glüheffizienz zu gewährleisten. Die prozentuale Modifikation wurde durch Analyse von 1H-NMR-Spektrenpeaks bestimmt. Der Beginn der Gelierung gab Aufschluss über die Dauer der mikrofluidischen Mikrogelbildung.Es wird empfohlen, einen Gelvorläufer-pH-Wert zu wählen, der die Gelierung zwischen 30 Minuten und zwei Stunden initiieren kann. Nach Reinigung und Quellung hatten die Mikrogele eine einheitliche Größe und einen Polydispersitätsindex zwischen 1,00 und 1,02, definiert als monodisperse Population. Nach dem Glühen bildeten die Mikrogele ein poröses Gerüst, das mit Zwei-Photonen-Mikroskopie sichtbar gemacht wurde.Die korrekte Verklebung des PDMS-Geräts mit dem Glasobjektträger und die korrekte Oberflächenbehandlung des Geräts sind entscheidend für die beste mikrofluidische Geräteleistung. Diese Technik ermöglicht die schnelle Herstellung einheitlicher Mikrogelbausteine zu Kartengerüsten, die für eine Vielzahl von regenerativen In-vivo-Anwendungen, einschließlich der Wundheilung, verwendet werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Synthese von Poly (<em&gt; N</em&gt; Isopropylacrylamid) Janus Microhydrogels für anisotroper Thermo-Ansprechempfindlichkeit und organophiler / Hydrophilie Belastbarkeit

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Lernen Sie die mikrofluidische Synthese monodisperser Mikrogelbausteine für mikroporöse Partikelgerüste in der regenerativen Medizin. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle der Porosität und verbesserte Gewebeintegration.

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