Im lebenden Organismus Weitfeld- und Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung einer Maus mit einem großen Schädelfenster

Dieses Protokoll zeigt die Erstellung eines großen Schädelfensters zur Messung von Weitfeld- und Einzelzellreservierungsaktivitäten in derselben Maus. Mit unserer Methode können große und stabile Schädelfenster mit Lebensmittelverpackung zu geringen Kosten hergestellt werden. Diese Methode ist effektiv, um die neuronalen und glialen Aktivitäten während des Verhaltens auf makroskopischer und mikroskopischer Ebene zu untersuchen.

Es wird empfohlen, mit einem kleinen Schädelfenster zu beginnen. Wenn dies erfolgreich ist, vergrößern Sie das Fenster. Beginnen Sie, indem Sie den zusätzlichen Zement über dem Schädel mit einem Zahnbohrer entfernen.

Markieren Sie den zu schneidenden Bereich mit einem Stift. Schneiden Sie mit einem Skalpell mit einer stumpfen Spitze in den Knochen, um sicherzustellen, dass die Spitze nicht in den Schädel eindringt. Schaben Sie den Knochen wiederholt mit einem Skalpell ab, um die Rille zu vertiefen, bis sich der Knochen im zu schneidenden Bereich bei leichter Berührung bewegt.

Entfernen Sie den eingeschnittenen Knochen mit einer feinen Pinzette. Seien Sie vorsichtig, um den Knochenlappen nicht in das Gehirn zu drücken, was das Gehirn schädigen kann. Um die Dura mater zu entfernen, schneiden Sie die Dura mit einer gezogenen Glaspipette mit einer konischen Spitze von etwa 10 Mikrometern.

Verwenden Sie eine U-förmige Nadel, um diesen Schnitt über das gesamte Fenster zu erweitern. Entfernen Sie unter einem Stereomikroskop mit 60- bis 100-fachem Zoom die durchtrennte Dura Mater mit einer ultrafeinen Pinzette. Im Falle einer Blutung mit aCSF spülen oder einen Gelatineschwamm verwenden, um die Blutung zu stoppen.

Dann sterilisieren Sie ein großes Stück PVDC-Folie durch Autoklavieren und mit 70% Ethanol. Verwenden Sie unter einem Stereomikroskop eine Pinzette und ein Skalpell, um eine Packung in der erforderlichen Größe auszuschneiden. Legen Sie den Wickel auf die Gehirnoberfläche, während Sie das aCSF auf der Oberfläche belassen.

Saugen Sie das aCSF vom Rand des Wickels ab, so dass der Wickel fest an der Gehirnoberfläche haften bleibt. Schneiden Sie den Wickel mit einem Skalpell und einer Pinzette so, dass zwischen dem Rand des Schädelfensters und dem Wickel etwa ein Millimeter Abstand liegt. Sobald der Wickel an Ort und Stelle ist, kleben Sie den Rand des Wickels mit einem biologischen Klebstoff auf den Schädel.

Lassen Sie den Klebstoff ca. 30 Minuten trocknen. Tragen Sie mit einem Spender mit einer Mischspitze ein transparentes Silikonelastomer auf die Folie auf. Stellen Sie das Deckglas mit einer Stärke von 0,12 bis 0,17 Millimetern darauf.

Versiegeln Sie den Umfang des Deckglases mit wasserdichter Folie, Sekundenkleber oder Zahnzement. Mischen Sie zunächst Fibroin- und AAV-Lösungen im Verhältnis eins zu vier in einem kleinen Probenröhrchen. Tropfen Sie ein Aliquot der Lösung auf die Plastikfolie für das Schädelfenster und trocknen Sie es mindestens drei Stunden lang.

Befestigen Sie dann den Wickel an der Gehirnoberfläche, wie im vorherigen Abschnitt gezeigt. Überprüfen Sie den Zustand der Mäuse und Fenster regelmäßig, zwei bis vier Wochen. Zu diesem Zeitpunkt werden die genetisch kodierten Kalziumindikatoren nach der Schaffung des AAV-behandelten Fensters ausreichend exprimiert sein.

Mit diesem Protokoll konnten Schädelfenster in acht von 10 Mäusen für bis zu 10 Wochen aufrechterhalten werden. Ein breites Fenster wird mit Plastikfolie, transparentem Silikon und Deckglas in einer transgenen Maus erstellt, die membranverankerte genetisch kodierte Kalziumindikatoren in Astrozyten exprimiert. Durch dieses Fenster wurde eine Weitfeld-Kalziumbildgebung durchgeführt und Fluoreszenzänderungen wurden beobachtet, wenn die Luftstoßstimulation auf die kontralateralen Schnurrhaare angewendet wurde.

Der zeitliche Verlauf der Fluoreszenzänderung im somatosensorischen Kortex zeigte kortikale Aktivität. Die Zwei-Photonen-Bildgebung ermöglichte die Beobachtung von Einzelzellfluoreszenzbildern, die spezifisch für Gliazellen sind. Fluoreszenzänderungen, die durch sensorische Stimulation induziert wurden, wurden in einzelnen Zellen aus verschiedenen kortikalen Regionen beobachtet.

Wrap kodiert mit AAV, der genetisch kodierten Kalziumindikator exprimiert; und Fibroin wurde verwendet, um das Schädelfenster zu machen. Die Weitfeld-Kalziumbildgebung zeigte kortikale Aktivität, die sich zwei bis vier Wochen nach der Operation durch sensorische Stimulation über den Kortex ausbreitete. Da das Fenster groß war, wurden verschiedene kortikale Bereiche derselben Maus abgebildet und durch sensorische Stimulation induzierte Fluoreszenzänderungen in einzelnen Zellen beobachtet.

Es ist wichtig, Schäden am Gehirn zu vermeiden, wenn Sie ein Schädelfenster herstellen. Man kann Verhaltensaufgaben an Mäusen mit einem großen Schädelfenster ausführen. Dies ermöglicht es, die Beziehung zwischen neuronaler Aktivität und Mausverhalten zu untersuchen.

Diese Methode kann auf eine Vielzahl von neurowissenschaftlichen Studien angewendet werden. Zum Beispiel kann es verwendet werden, um kortikale Aktivität während Entscheidungsfindungsaufgaben, motorischem Laufen und in Massenmodellen von Hirnverletzungen und Krankheiten zu beobachten.