Experimentelle Quantifizierung von Wechselwirkungen zwischen Wirkstoffabgabesystemen und Zellen in vitro: Ein Leitfaden für die präklinische Bewertung der Nanomedizin

Dieses Protokoll liefert quantitative Daten darüber, wie Trägersysteme mit Zellen interagieren. Quantitative Daten sind der Schlüssel für Engineering und Optimierung. Es erlaubt uns, von Ja- oder Nein-biologischen Fragen zu wie vielen Fragen überzugehen.

Diese Technik ist nützlich, um Ergebnisse aus der präklinischen Arzneimittelträgerleistung, die qualitativ waren, in quantitative Ergebnisse umzuwandeln. Und das funktioniert auch, wenn Sie Ihren Träger auf einem anderen System charakterisieren als Ihre Zellen. Es kann einige Iterationen dauern, um die optimale Trägerverdünnung zu finden, die in die linearen oder quantitativen Bereiche der Nanoseite fällt.

Nehmen Sie sich Zeit, um die richtigen Bedingungen zu finden. Montieren Sie zunächst die Durchflusszelle auf dem Lasermodul. Spülen Sie die Durchflusszelle langsam mit einer Rate von 0,1 Milliliter pro Sekunde mit einem Milliliter destilliertem Wasser.

Wenn sich Blasen in der Durchflusszelle bilden, ziehen Sie die Suspension teilweise zurück, um die Blase mit der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche zu verschmelzen, bevor Sie fortfahren. Verriegeln Sie dann das gesamte Lasermodul im Instrument. Starten Sie die Kamera ungefähr auf halbem Weg durch die Spülung.

Stellen Sie sicher, dass die Trägerablagerungen ausgewaschen sind. Wählen Sie Aufnahme, um die Registerkarte Aufnahmeeinstellungen zu öffnen, und klicken Sie auf Kamera starten. Treiben Sie das System mit einem Milliliter Luft an.

Wenn statische Träger auf dem Bildschirm sichtbar sind, reinigen Sie die Durchflusszelle gemäß den Anweisungen des Herstellers. Bereiten Sie die Träger für die Nanopartikel-Tracking-Analyse vor, indem Sie sicherstellen, dass die Träger je nach Trägersystem durch Ultraschall oder Wirbeln gut aufgehängt sind. Die Träger werden in Wasser verdünnt, um mindestens 0,6 bis einen Milliliter jeder Probe mit einer Trägerkonzentration zwischen 1x10 bis zum siebten und 1x10 bis zum neunten Träger pro Milliliter vorzubereiten.

Nehmen Sie das Lasermodul heraus und stellen Sie es aufrecht. Geben Sie die erste Trägerprobe in eine Ein-Milliliter-Spritze und befestigen Sie die Spritze am Schlaucheinlass. Laden Sie dann die Probe vorsichtig in die Durchflusszelle.

Wenn sich Blasen in der Durchflusszelle bilden, ziehen Sie die Suspension teilweise zurück, um die Blase mit der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche zu verschmelzen, bevor Sie fortfahren. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Durchflusszelle mit Flüssigkeit gefüllt ist, und halten Sie dann die Beladung an. Passen Sie den Kamerafokus bei Bedarf an, um einzelne Träger zu visualisieren.

Nehmen Sie grobe Fokuseinstellungen mit dem Drehknopf auf der rechten Seite des Instruments vor. Nehmen Sie feinere Einstellungen vor, indem Sie die Registerkarte Hardware auswählen. Ändern Sie den Fokus, indem Sie den Fokusschieberegler anpassen.

Um sicherzustellen, dass es keine Übersättigung gibt, wählen Sie die optimale Kamerastufe aus, indem Sie den Schieberegler auf der Aufnahmeregisterkarte anpassen. Wenn das Gerät mit diesem Zubehör ausgestattet ist, legen Sie die Spritze mit der Trägerprobe in die Spritzenpumpe. Wählen Sie auf der Registerkarte SOP die Standardmessung aus, um fünf Aufnahmen von jeweils 30 Sekunden zu machen.

Geben Sie den Namen der Basisdatei ein und fügen Sie bei Bedarf zusätzliche Beispielinformationen hinzu, indem Sie auf die Schaltfläche "Erweitert" klicken, wodurch ein modaler Dialog mit verschiedenen Auswahlmöglichkeiten geöffnet wird. Klicken Sie auf Erstellen und Skript ausführen und warten Sie, bis ein Popup-Fenster angezeigt wird, in dem Sie aufgefordert werden, das Beispiel zu erweitern. Wenn Sie die Spritzenpumpe verwenden, wählen Sie die Registerkarte Hardware und dann die Registerkarte Spritzenpumpe.

Stellen Sie die gewünschte Infusionsrate ein und drücken Sie infuse. Wenn Sie die Spritzenpumpe nicht verwenden, schieben Sie die Probe manuell vor. Wählen Sie im Popup-Fenster OK, um mit der Aufnahme zu beginnen.

Überprüfen Sie nach jeder der fünf Aufnahmen, ob sich die Probe noch durch die Durchflusszelle bewegt, wenn das Popup-Fenster "Bitte erweiterte Proben" erneut angezeigt wird. Wählen Sie dann OK, um mit der nächsten Aufnahme fortzufahren. Stellen Sie auf der Registerkarte Prozess den Schieberegler für die Erkennungsschwelle zwischen vier und acht ein, um verschiedene auf dem Bildschirm sichtbare Träger korrekt zu identifizieren.

Sie können die Bildschirmverstärkung anpassen, um die Visualisierung zu unterstützen, dies hat keinen Einfluss auf die nachgelagerte Analyse. Drücken Sie im Popup-Fenster OK, um die Tracking-Analyse zu starten. Überwachen Sie den Analysefortschritt, indem Sie auf die Registerkarte Analyse in einer einzelnen Analyse klicken.

Sobald die Analyse abgeschlossen ist, suchen Sie nach einer Eingabeaufforderung für Exporteinstellungen. Vergewissern Sie sich, dass PDF einschließen und Experimentzusammenfassung einschließen ausgewählt ist. Wählen Sie beliebige andere Exportformate aus.

Überprüfen Sie im Ergebnisbereich des PDF-Datenexports, ob die gemessene Trägerkonzentration zwischen 1x10 bis zum siebten und 1x10 bis zum neunten Träger pro Milliliter liegt, um sicherzustellen, dass die gemessene Konzentration zuverlässig ist, und überprüfen Sie, ob unter dem Konzentrationsmessergebnis Fehlermeldungen oder Warnmeldungen angezeigt werden. Wiederholen Sie den Vorgang zwei oder mehr Male mit unterschiedlichen Verdünnungen aus dem Bestand und stellen Sie sicher, dass die Konzentration jeder Probe innerhalb des linearen Bereichs des Geräts liegt. Berechnen Sie die Trägerkonzentration wie im Textmanuskript beschrieben.

Bereiten Sie die freie oder Antikörper-konjugierte Fluorochromlösung wie im Textmanuskript beschrieben her. Berechnen Sie die Konzentration der Stammlösung aus der Konzentration, dem Molekulargewicht und der Avogadro-Zahl, wie in der Gleichung gezeigt. Führen Sie dann eine serielle Verdünnung des Farbstoffs im Trägerverdünnungsmittel durch, um Standardkurvenproben zu erzeugen.

Anschließend wird die Trägerprobe in die Messplatte gegeben und die Fluoreszenz mit einem Mikrotiterplattenleser gemessen. Generieren Sie die Standardkurve wie im Textmanuskript beschrieben. Berechnen Sie die absolute Fluoreszenzintensität pro Träger, indem Sie die Massenfluoreszenz durch die Trägerkonzentration dividieren.

Richten Sie das Durchflusszytometer für das abschließende Trägerzellenexperiment ein, indem Sie die optimalen PMT-Spannungseinstellungen in den relevanten Kanälen bestimmen. Führen Sie eine Negativkontrollprobe durch, bei der die Zellen nicht mit Trägern inkubiert werden, um die Hintergrundfluoreszenz zu bestimmen. Bereiten Sie die Durchflusszytometrie-Quantifizierungsperlen vor und setzen Sie sie erneut aus.

Verwenden Sie denselben Puffer wie für die Zellproben. Wenn die Perlenpopulationen separat bereitgestellt werden, ziehen Sie sie zusammen. Führen Sie die Durchflusszytometrie-Quantifizierungsperle und die Trägerzellproben durch, um die Fluoreszenzintensität pro Zelle zu bestimmen.

Führen Sie die Durchflusszytometer-Quantifizierungsperlen aus, um eine Standardkurve zu erzeugen und die absolute Fluoreszenzintensität in MFI umzuwandeln. Verwenden Sie dies, um den theoretischen MFI der Träger wie im Textmanuskript beschrieben zu berechnen. Führen Sie die Zellträgerproben durch, um die Fluoreszenzintensität pro Zelle jeder Probe zu bestimmen.

Berechnen Sie schließlich die Anzahl der Träger pro Zelle für jede Probe, indem Sie die Hintergrundfluoreszenz von der gemessenen Fluoreszenz der Probe subtrahieren und dann durch die Fluoreszenz pro Partikel dividieren. Für 633 Nanometer Polymethacrylsäure-Kernschalenpartikel waren die Konzentration und Fluoreszenzintensität pro Träger direkt mit dem Zytometerstrom quantifizierbar. Im Gegensatz dazu waren 100 Nanometer superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel zu klein, um sie einzeln zu detektieren und wurden mit dem Massenstrom analysiert.

Markierte Quantifizierungsperlen wurden an mehreren Tagen verwendet, um Standardkurven auf einem Durchflusszytometer zu erzeugen. Die Korrelation zwischen dem gemessenen MFI und dem MESF-Wert der Quantifizierungsperlen war linear und zwischen den gemessenen Daten weitgehend ähnlich. Zeitverlaufsexperimente mit fluoreszierend markierten HeLa-Zellen mit 235-Nanometer-Polymethacrylsäure-Kapseln von null bis 24 Stunden zeigten einen Anstieg des MFI im Laufe der Zeit, was darauf hindeutet, dass die Kapseln mit HeLa-Zellen assoziiert waren.

Der Unterschied in der scheinbaren zellulären Reaktion auf Träger war stark, abhängig von der relativen oder absoluten Quantifizierung. Die absolute Quantifizierung war unabhängig von der Kennzeichnungsintensität und damit vergleichbarer. Diese Techniken sind die Grundlage für eine tiefere Analyse und einen Vergleich der Partikelleistung.

Wir freuen uns, diese Techniken zur Parametrisierung mathematischer Modelle zu verwenden, die es uns ermöglichen, die Teilchenleistung unabhängig von einem bestimmten Experiment zu charakterisieren.