Ein fluoreszierender Intravital-Bildgebungsansatz zur Untersuchung der belastungsinduzierten Kalzium-Signaldynamik in Maus-Osteozyten

Dieses Protokoll bietet die Möglichkeit, eingebettete Osteozyten in vivo zu beobachten, was einen wichtigen Fortschritt in der Erforschung der Knochenmechanobiologie darstellt. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, Ereignisse auf zellulärer und molekularer Ebene in Osteozyten in vivo zu beobachten, wobei ihre native räumliche 3D-Anordnung, der Blutfluss und die endokrinen Bedingungen beibehalten werden und die Einschränkungen überwunden werden, die typischerweise durch zelluläre In-vitro-Experimente auferlegt werden. Diese Technik ist für die grundlagenwissenschaftliche Untersuchung in Mausmodellen konzipiert. Sie erstrecken sich noch nicht auf die Therapie oder Diagnose, bieten aber die Möglichkeit, Erkenntnisse zu gewinnen, die die nächste Generation von Knochenbehandlungen definieren.

[Erzähler] Machen Sie zu Beginn einen Skalpellschnitt durch die Dermis zwischen dem zweiten und dritten Mittelfußknochen, beginnend am distalen Ende und proximal entlang der Länge der Knochen. Öffnen Sie die Operationsstelle mit einer Pinzette, indem Sie die Haut in Richtung der medialen oder lateralen Ränder ziehen. Sezieren Sie die Strecksehnen mit einer geraden Vannas-Schere, um den dritten Mittelfußknochen freizulegen. Führen Sie den mittleren Drehpunktstift der Mittelfußbelastung in den kleinen Raum am distalen Ende ein, wo der dritte Mittelfußknochen auf das proximale Phalange trifft. Bewegen Sie dann den Stift proximal, bis er in der Mitte des dritten Mittelfußknochens aufliegt. Achten Sie besonders darauf, eine direkte Schnittstelle zwischen Knochen und Stift zu gewährleisten, ohne Muskeln und Faszien. Halten Sie den Knöchel mit einer Pinzette fest und legen Sie den Fuß in das mit DPBS gefüllte Wasserbad. Befestigen Sie die Pfote mit der Ladehalterung und verbinden Sie die Halterung mit der Anordnung der Wägezelle des Aktuators. Nehmen Sie die Einrichtung des Ladegeräts vorsichtig mit der Maus auf und platzieren Sie sie auf der Mikroskopplattform. Beginnen Sie mit dem Objektiv mit geringer Vergrößerung im Epifluoreszenzmodus, um die mittlere Diaphyse des Knochens zu lokalisieren und zu zentrieren. Nachdem Sie einen interessierenden Bereich lokalisiert haben, wechseln Sie zu einer höheren Wasserimmersionsobjektivvergrößerung und schalten Sie die Optik auf zwei Photonen um. Stellen Sie die Pixeldichte mit den Einstellungen für den Galvo-/Resonanzbereich ein. Um Photo-Bleaching zu vermeiden, reduzieren Sie die Leistung mit der Option zur Leistungssteuerung und erhöhen Sie die PMT-Verstärkung in den Steuerungseinstellungen des Galvo-/Resonanzscanners. Identifizieren Sie die Oberfläche des Knochens im Zwei-Photonen-Modus, indem Sie im grünen Kanal nach der Autofluoreszenz des fibrösen Periosts suchen, die einen Bandpassfilter verwendet, der bei 525 Nanometern zentriert ist. Wenn es während der Belastung zu einer sichtbaren Bewegung des Knochens kommt, wählen Sie einen anderen interessierenden Bereich in Y- oder Z-Richtung aus, um sicherzustellen, dass er sich direkt über dem mittleren Drehpunktstift befindet. Wenn die Bewegung anhält, passen Sie die chirurgische Position des Stifts manuell unter dem dritten Mittelfußknochen an. Führen Sie eine Z-Stapel-Bildgebung mit Belastung gemäß dem Versuchsdesign durch, um die morphometrischen Signalereignisse aufzuzeichnen, und dann eine T-Serien-Bildgebung mit Belastung, um die durch die dynamische Last induzierten Signalisierungsereignisse aufzuzeichnen. Hier ist ein Einzelebenen-Zwei-Photonen-Bild von Metatarsal-Osteozyten, die GCaMp6f in vivo exprimieren, zu sehen. Die endogene Expression von Kalzium-Reporter-Konstrukten liefert ein fluoreszierendes Target, ohne dass eine Inkubation erforderlich ist. In dieser Abbildung ist die 3D-Z-Projektion von Osteozyten in vivo dargestellt, die mit Zwei-Photonen-Mikroskopie aufgenommen wurden. Der Querschnitt in der XY-Ebene und ein sagittaler Schnitt zeigen die Tiefe des Z-Stapels. Das repräsentative Bild zeigt beispielhaft den Zeitverlauf des GCaMp6f-Fluoreszenzsignals von einem eingebetteten Osteozyten. Im Ruhezustand zeigen sich geringe Geräuschschwankungen. Mit der Belastung nehmen die Kalziumschwankungen in Größe und Regelmäßigkeit zu und treten oft im Gleichschritt mit der applizierten Belastung auf.

Diese Methode ebnet Forschern den Weg, funktionell basierte Fragen zur Osteozyten-Mechanobiologie in vivo zu beantworten, die bisher nur in vitro oder ex vivo möglich waren.